Annang Elsie Odua，張亞青，Chiteme Tafadzwa Evangelista，柳 永,2,3，劉士旺,2,3

(1.浙江科技學院 生物與化學工程學院，杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學與生物加工技術重點實驗室，杭州 310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 310023)

脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)是生物遺傳信息的攜帶者，同時也是一種功能多樣的生物高分子。雙鏈DNA(dsDNA)的解鏈構象-單鏈DNA(ssDNA)，既是基因編輯的重要靶標物[1]，也是DNA材料研究的常見原料[2]。ssDNA在體外常溫下傾向于互補配對形成部分雙鏈結構，這對常溫下研究ssDNA生物學活性和操作ssDNA材料造成了阻礙。已知dsDNA在受熱情況下，能夠解鏈形成并保持ssDNA結構。如能將高溫下的ssDNA結構固定化，則將為常溫下研究ssDNA的生物學功能和ssDNA基功能材料研發(fā)提供有益參考。

殼聚糖(chitosan，CS)是天然陽性多糖，已被大量研究證實為優(yōu)良的核酸載體。已見報道的CS/DNA復合物大致可以分為4類：1)非靶向CS/DNA納米粒子，如CS/超螺旋DNA和CS/dsDNA/siRNA復合納米粒子[3]、改性CS/超螺旋DNA納米粒子[4]等，均表現(xiàn)出良好的哺乳細胞轉染功能；2)靶向CS/DNA復合納米粒子，如靶向大腦的錳福地吡-CS/siRNA/DNA納米粒子[5]、靶向腫瘤細胞的CS納米粒子[6]等；3)智能響應CS/DNA復合納米粒子，如ATP響應[7]、氧化還原響應[8]、磁場響應CS納米轉染制劑[9]等；4)CS/DNA基人工模擬物，如CS/DNA基人工模擬酶，表現(xiàn)出高催化活性和高抗逆性[10]。相比種類繁多的CS/核酸復合納米粒子報道，關于CS與核酸相互作用機制及其對細胞侵染效率的影響報道相對較少。現(xiàn)有研究表明，CS與DNA間弱相互作用力有利于對哺乳細胞的轉染[11]，CS上氨基與DNA上磷酸基團的比例對轉染效率存在顯著影響[12]，具有支化結構的CS較線型CS具有更好的基因遞送效果和更佳的細胞相容性[13]等。這些研究雖對CS/DNA相互作用與其基因轉染效果間關系進行了探索性研究，但對分子水平的相互作用機制研究報道仍較少。石幻君等[14]發(fā)現(xiàn)磺化殼聚糖鐵配合物可通過嵌插作用來解鏈dsDNA。Shen等[15]通過動態(tài)分子模擬發(fā)現(xiàn)，DNA上帶負電磷酸基團與CS上帶正電氨基之間的互作是殼聚糖負載DNA的主要機制。

綜合以上研究可以發(fā)現(xiàn)，正電性CS與負電性DNA間的靜電自組裝是CS包埋DNA的主要作用機制。如能在體外制備攜帶單鏈區(qū)段的DNA，并在保持ssDNA構象條件下引發(fā)殼聚糖與DNA間的共聚，則有可能實現(xiàn)不穩(wěn)定ssDNA拓撲構象的固定化。因此，我們采用熱處理的方法，制備攜帶單鏈區(qū)段的線型DNA，并與CS共聚形成復合納米粒子，對不穩(wěn)定ssDNA在復合納米粒子中的固定化負載效果進行分析評價。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

殼聚糖(粘均相對分子質量150 kDa，脫乙酰度90%以上)，國藥集團化學試劑有限公司；鮭魚精DNA(D1626)，美國Sigma-Aldrich公司，其0.25 mg/mL水溶液A260/A280=1.92，A260/A230=2.35；SYBR Green Ⅰ熒光染料，美國MP Biomedicals公司；其他常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 dsDNA熱處理及解鏈度測定

將鮭魚精DNA溶解于超純水中，配置質量濃度為55 ng/μL的DNA溶液。取DNA溶液0.5 mL與SYBR Green Ⅰ原液(×10 000母液)0.5 μL混合均勻，于37 ℃下避光孵育1 h。將經(jīng)過孵育的DNA溶液分裝于20個0.2 mL平蓋PCR管中，在熒光定量PCR儀CFX96上，分別于25、60、90 ℃下測量SYBR Green Ⅰ的綠色熒光信號強度。以25 ℃下測得熒光信號值為100% dsDNA熒光信號值，將60 ℃和90 ℃下熒光信號值與25 ℃熒光信號值相除，計算各溫度下dsDNA的百分比含量。

1.3 攜帶單鏈區(qū)段DNA在殼聚糖復合納米粒子中的負載

將CS溶解于1%醋酸溶液中，并以NaOH溶液調節(jié)pH值，配制質量濃度為1 mg/mL，pH值為5.5的CS溶液。將鮭魚精DNA溶解于超純水中，質量濃度為0.25 mg/mL。

在25 ℃下，按CS與DNA質量比為4/1、1/1和1/2，將DNA溶液在磁力攪拌下滴加到CS溶液中。在60、90 ℃下，按CS與DNA質量比為4/1，將DNA溶液在磁力攪拌下滴加到CS溶液中。DNA滴加溶液逐漸呈現(xiàn)藍白色熒光(后續(xù)檢測表明CS與DNA共聚形成了復合納米粒子)。

1.4 復合納米粒子表征

傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR)分析采用傅里葉變換紅外光譜儀Paragon 1000型(美國Perkin Elmer公司)，在500～4 000 cm-1范圍內掃描，樣品與KBr粉末混合后壓成薄片測定；差示掃描量熱分(differential scanning calorimetry，DSC)分析采用差示掃描量熱儀DSC Q100 V9.9 Build 303型(美國TA Instruments公司)，冷凍干燥樣品質量為3～5 mg，先將樣品從室溫降到-40 ℃，保持3 min，然后以20 ℃/min升溫到250 ℃；粒徑分布和zeta電位分析采用Zetasizer 3000HS型(美國馬爾文儀器有限公司)，以納米溶液直接測定；透射電子顯微鏡觀察(transmission electron microscope，TEM)采用JEM-1200EX型號(日本JEOL公司)，制樣方法為懸滴法。

2 結果與討論

2.1 不同溫度處理下DNA的解鏈度

圖1 CS/DNA復合納米粒子FT-IR分析

SYBR Green Ⅰ能夠與dsDNA的小溝結合，結合后的熒光信號可增強800～1 000倍。在25 ℃下，dsDNA結構穩(wěn)定，SYBR Green Ⅰ與DNA充分結合，在藍光(497 nm)激發(fā)下發(fā)射綠色熒光信號(520 nm)。當溫度升高到60 ℃和90 ℃時，dsDNA部分解鏈產(chǎn)生ssDNA區(qū)段。在ssDNA區(qū)段上，DNA小溝消失，SYBR Green Ⅰ從相關位點脫落，520 nm下熒光信號減弱。同時，未解鏈dsDNA區(qū)段SYBR Green Ⅰ仍結合于DNA小溝上，熒光信號得到保持。將60 ℃和90 ℃下熒光信號值分別與25 ℃下熒光信號值相除即可計算相應處理溫度下的dsDNA的百分比含量，并推算出相應的ssDNA百分比含量。結果顯示，在60、90 ℃下dsDNA的百分比含量分別為66.9%±1.8%、10.5%±1.3%，ssDNA百分比含量分別為33.1%±1.5%、89.5%±1.9%。表明在25、60、90 ℃處理下，獲得了具有不同解鏈度的DNA樣品。60、90 ℃處理下產(chǎn)生的ssDNA在溫度降低后會重新形成鏈內或鏈間dsDNA結構，表現(xiàn)為不穩(wěn)定拓撲結構。

2.2 復合納米粒子的FT-IR分析

CS/DNA復合納米粒子FT-IR分析結果如圖1所示，A、B、C對應樣品為25 ℃下DNA與CS質量比分別為4/1、1/1、1/2時制備納米粒子；D、E對應樣品為DNA與CS質量比為4/1時，分別在60、90 ℃下制備納米粒子；F為DNA，G為CS。從圖1可知，DNA在1 236 cm-1和1 095 cm-1處吸收峰分別為磷酸基團(PO21-)反對稱伸縮振動和對稱伸縮振動峰[16-17]，在CS包埋DNA形成的復合納米粒子中，當CS與DNA比例(CS/DNA)為4/1或1/1時，上述兩處吸收峰微弱。在CS/DNA為1/2樣品中，上述兩處吸收峰強度高于4/1或1/1樣品。這表明，在4/1或1/1的CS/DNA比例下，DNA上的磷酸基團被充分固定化，對稱振動減弱；而在1/2比例下，較多磷酸基團保留了對稱振動狀態(tài)。磷酸基團是DNA骨架的主要結構基團，CS/DNA復合納米粒子中DNA磷酸基團的固定化，意味著DNA結構的固定化。Shen等[15]的CS負載DNA分子動態(tài)分子模擬研究報道，同樣認為DNA上帶負電磷酸基團與CS上帶正電氨基之間的相互作用是殼聚糖負載DNA的主要機制。此外，DNA在1 236 cm-1處吸收峰是B -DNA特征峰[18]，在CS/DNA復合納米粒子中，該處吸收峰的減弱表明CS可能與其他多胺類高分子一樣，能夠誘導天然右手螺旋B -DNA轉變?yōu)樽笫致菪齔 -DNA[19]。DNA在965 cm-1處的吸收峰為其主鏈核糖振動吸收峰，在復合納米粒子中該振動峰向低波數(shù)方向移動到了927 cm-1，也表明復合納米粒子中的DNA結構得到了固定化。對于復合納米粒子中DNA解鏈度問題，由于DNA與CS之間及DNA堿基對之間存在多種氫鍵作用力且氫鍵構成基團相似，因此無法從傅立葉變換紅外光譜中有效解析獲得DNA的解鏈度信息。

2.3 復合納米粒子DSC分析

圖2 CS/DNA復合納米粒子DSC分析

CS/DNA復合納米粒子DSC分析結果如圖2所示，A、B、C、D、E、F、G對應樣品與圖1同。由圖2可知，天然鮭魚精DNA在43～125 ℃出現(xiàn)較平緩吸熱單峰，峰值溫度為83 ℃，該峰為dsDNA解鏈形成ssDNA過程吸熱所致。在227 ℃附近出現(xiàn)的放熱峰則為DNA氧化分解放熱所致。CS在-30～250 ℃未出現(xiàn)明顯吸放熱峰。相比天然鮭魚精DNA，CS/DNA復合納米粒子的峰形和數(shù)量發(fā)生了顯著變化：首先，5個CS/DNA復合納米粒子樣品(A、B、C、D和E)均在59 ℃附近出現(xiàn)第1個吸熱峰，該峰為dsDNA局部解鏈DNA呼吸增強所致；其次，25 ℃或60 ℃下制備的4個CS/DNA復合納米粒子樣品(A、B、C和D)，均在68.8～117.3 ℃間出現(xiàn)了第2個吸熱峰，該峰為dsDNA完全解鏈吸熱所致；最后，227 ℃附近未見DNA氧化分解放熱峰出現(xiàn)，表明經(jīng)CS包埋保護后dsDNA的分解溫度得到了提高。比較樣品A、B和C可以看出，當CS/DNA為4/1時，DNA完全解鏈溫度最高，為117.3 ℃。這一升高DNA完全解鏈溫度與較高CS/DNA比例下(4/1)，過量CS與DNA飽和相互作用導致DNA熱穩(wěn)定性提高有關[20]，同時也表明CS/DNA為4/1下，DNA與CS相互作用飽和度較高，有利于DNA拓撲結構的固定化。進一步比較樣品A、D和E可以看出，相同CS/DNA比例下，制備溫度分別為25、60、90 ℃時，DNA完全解鏈吸熱峰逐漸向低溫方向移動。由于在DNA序列相同的情況下，DNA的解鏈溫度與其雙鏈區(qū)段長度呈正相關，因此制備溫度從25 ℃升到90 ℃過程中，CS/DNA復合納米粒子中，dsDNA區(qū)段呈逐漸縮短趨勢，相應ssDNA區(qū)段呈增長趨勢。這表明，在60、90 ℃下產(chǎn)生的攜帶單鏈區(qū)段的DNA拓撲結構，在復合納米粒子中得到了固定化。

2.4 復合納米粒子的粒徑分布與zeta電位

表1CS/DNA復合納米粒子粒徑分布與zeta電位分析結果

Table1Analytic results of particle size distribution and zeta potential of CS/DNA composite nanoparticles

樣品平均粒徑/nmzeta電位/mVA573.9±20.819.53±1.2B750.1±34.023.81±3.1C388.2±26.421.17±1.9D205.0±15.914.31±1.2E210.5±17.2 9.75±0.8

CS/DNA復合納米粒子粒徑分布與zeta電位分析結果見表1，A、B、C、D、E對應樣品與圖1同。由表1可知，當制備溫度為25 ℃時，伴隨CS/DNA比例降低，復合納米粒子平均粒徑和zeta電位均出現(xiàn)先升高后降低的變化；當CS/DNA比例固定為4/1時，伴隨制備溫度升高，復合納米粒子平均粒徑和zeta電位均呈降低趨勢。制備溫度為25 ℃時，不同CS/DNA比例導致的平均粒徑和zeta電位差異，可能與CS和DNA聚集程度不同有關。當CS/DNA比例均為4/1時，不同制備溫度下(25、60、90 ℃)出現(xiàn)的粒徑和zeta電位差異，應與DNA的解鏈度不同有關。在25 ℃下，天然鮭魚精DNA主要以雙鏈形式存在，分子剛性較強，與CS共聚形成較大納米顆粒(平均水合粒徑573.9 nm)；在60、90 ℃下，鮭魚精DNA發(fā)生解鏈，以雙鏈/單鏈雙重結構形式存在，分子剛性減弱，容易與CS共聚纏繞形成較小納米顆粒(平均水合粒徑分別為205、210.5 nm)。而伴隨制備溫度升高，zeta電位逐漸降低(由19.53 mV降到9.75 mV)，可能是較高制備溫度下含量較高ssDNA的存在降低了DNA與CS的聚集度，導致了復合納米粒子內正電性CS比例的降低。

2.5 TEM分析

對CS/DNA比例均為4/1，制備溫度分別為25、60、90 ℃的樣品A、D、E進行了TEM觀測，結果見圖3。從圖3可以看出，3個制備溫度下復合納米粒子形貌差異顯著。在25 ℃下制備樣品(A)，復合納米顆粒粒徑較大，存在大量粒徑大于100 nm的復合納米顆粒，且顆粒中部多存在低電子密度區(qū)域，應為電子密度較低的DNA集中分布區(qū)域。在60 ℃下制備樣品(D)，粒徑大于100 nm的復合顆粒減少，粒徑小于100 nm的復合顆粒顯著增多，顆粒中低電子密度區(qū)域明顯減少。在90 ℃下制備樣品(E)，仍存在部分粒徑大于100 nm的復合顆粒，但以粒徑小于100 nm的復合顆粒為主，顆粒內部低電子密度區(qū)域消失。由于A、D、E樣品間的主要差別是制備溫度不同，即DNA解鏈度不同，因此3個樣品間復合納米顆粒結構差異主要由構成復合納米顆粒的DNA拓撲結構差異造成。同時也反映出，在3個制備溫度下，攜帶不同比例ssDNA區(qū)段的穩(wěn)定或不穩(wěn)定DNA拓撲結構均被固定化負載到了復合納米顆粒中。

圖3 不同溫度制備殼聚糖/DNA復合納米粒子透射電子顯微鏡下形貌

3 結 語

通過差異加熱處理，制備了攜帶不同比例ssDNA區(qū)段的拓撲結構穩(wěn)定或不穩(wěn)定的DNA，并在相應溫度下制備了CS/DNA復合納米粒子，使得DNA的拓撲結構在復合納米粒子中得到了固定化。尤其在CS/DNA為4/1情況下，F(xiàn)T-IR測試中DNA主鏈上磷酸基團和糖鏈振動均出現(xiàn)減弱；DSC測試中第二吸熱峰伴隨制備溫度升高向低溫方向遷移的行為，也與熱處理導致的DNA雙鏈區(qū)段長度變化預期相符；粒徑分布、zeta電位和TEM測試等進一步反映出負載不同拓撲結構DNA的納米粒子，在形貌和結構特征上存在顯著差異。這些結果均有力地證明，攜帶單鏈區(qū)段的拓撲結構DNA在復合納米粒子中獲得了良好的固定化。