黃旭光 秦玲 黃麗丹 陸炎松 羅恩波 黃玲璞 劉岳飛

摘? 要：以朱槿品種‘紫牡丹為試驗材料，采用盆栽試驗，研究了苗期重度干旱脅迫及復(fù)水對其根系生理特性的影響，并運用高通量測序技術(shù)分析干旱脅迫及復(fù)水下朱槿根際土壤微生物多樣性的變化特征。結(jié)果顯示：與正常處理（CK）相比，重度干旱脅迫及復(fù)水處理（T2）的總根長、根表面積及根尖數(shù)等根系生長指標(biāo)呈現(xiàn)顯著減少的結(jié)果，但與重度干旱脅迫（T1）處理相比，均顯著增加。通過對朱槿根際土壤樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，屬分類水平上，厭氧繩菌屬（Anaerolineaceae），酸桿菌屬（Acidobacteria）、酸微菌屬（Acidimicrobiales）、幽門螺桿菌屬（Sphaerobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）等是不同處理土壤樣品中的優(yōu)勢菌群。T1處理下的嗜青霉屬（Algiphilus）、奧利螺旋菌屬（Aureispira）、綠線菌屬（Chloronema）、扁棒殼屬（Acrospermum）為不同處理下的特殊細菌。真菌方面，屬的分類水平上發(fā)現(xiàn)，糞殼菌屬（Sordariale）、散囊菌屬（Eurotiales）、擬青霉屬（Pseudallescheria）、格孢腔菌屬（Pleosporales）、枝孢霉屬（Cladosporium）等是不同處理土壤樣品中的優(yōu)勢菌群;T1和T2處理下的樣品中，側(cè)角藻屬（Goniomonas）、齒盤菌屬（Lamprospora）和索羅迪夫斯菌屬（Sorodiplophrys）為不同處理下的特殊真菌屬。其中，有促生作用的細菌如酸微菌屬（ Acidimicrobium）、厭氧繩菌屬（Anaerolineaceae）嗜青霉屬（Algiphilus）以及具有一定生防作用真菌如擬青霉屬（Pseudallescheria）、枝孢霉屬（Cladosporium）等均可以合理的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，為植物的抗干旱脅迫以及提高朱槿在干旱脅迫下的水分利用做出貢獻。

關(guān)鍵詞：干旱脅迫;高通量測序;朱槿;根系;微生物多樣性

中圖分類號：S154.3????? 文獻標(biāo)識碼：A

Abstract： A pot experiment using a cultivar ‘Purple Peony as the experimental material was conducted under drought and rehydration condition. The effects of drought at seedling stage and rehydration on the physiological characteristics of roots and the soil microbial diversity in the rhizoshere were studied. The total root length， root surface area and root tip numbers were significantly decreased in the drought and rehydration treatment （T2）， compared to the normal condition （CK）， but they were significantly increased compared with the drought stress without rehydration （T1）. Under drought stress （T1）， Algiphilus， Aureispira， Chloronema， Acrospermum were the special bacteria. Anaerolineaceae， Acidobacteria， Acidimicrobiales， Sphaerobacter and Streptomyces were the dominant bacteria in the rhizoshpres of all drought and normal treatments. Sordariale， Eurotiales， Pseudallescheria， Pleosporales and Cladosporium were the dominant fungi. Goniomonas， Lamprospora and Sorodiplophrys were the special fungi in drought stress （T1） and rehydration after drought stress （T2）. Bacteria such as Acidimicrobium， Anaerolineaceae， Algiphilus， Pseudallescheria， Cladosporium， having certain biocontrol effects， could be reasonably used in agricultural production， which could contribute to the resistance of plants to drought stress and the improvement of water use of Hibiscus under drought stress.

Keywords： drought stress; high-throughput sequencing; Hibiscus; root system; microorganisms diversity

干旱一直以來是人類面臨的主要自然災(zāi)害之一，隨著人類的經(jīng)濟發(fā)展和人口膨脹，人類對水資源的污染越來越嚴重，水資源短缺的現(xiàn)象也日趨明顯。此外，全球暖干化進程的加快，水資源短缺的形勢愈發(fā)嚴峻，對農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展造成了嚴重的影響[1]。這也直接導(dǎo)致了全世界范圍內(nèi)干旱地區(qū)的擴大以及干旱化程度的加重，但干旱化問題也越來越引起全球范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 干旱脅迫及復(fù)水下的朱槿根系生長指標(biāo)

由表1可知，與CK相比，T1的朱槿總根長、總根表面積及總根體積及根尖數(shù)均呈顯著性減少的結(jié)果，而對于根均直徑的影響不顯著。T2的根均總根表面積及總根體積及根尖數(shù)與CK相比均有顯著的減少，但與T1處理相比，均顯著增加。與T1相比，T2和CK的總根長分別增加了29.41%和63.73%，總根表面積分別增加49.07%和90.66%，總根體積分別增加了71.43%和128.57%，根尖數(shù)增加量分別為33.04%和65.28%。以上結(jié)果說明，干旱脅迫對朱槿植株根系的總根長、總根表面積、總根體積及根尖數(shù)有顯著的抑制作用，而干旱后復(fù)水對根系生長也有顯著的補償效應(yīng)。

2.2? 干旱脅迫及復(fù)水處理下朱槿幼苗生長指標(biāo)

與CK相比，T1朱槿幼苗的株高及鮮重（地上部、根系）等指標(biāo)均顯著減少，株高、地上部和根系分別減少了73.25%、55.01%和63.63%;而干旱脅迫后復(fù)水處理對于地徑、鮮重（地上部、根系）、及根冠比等指標(biāo)并沒有顯著差異。3種不同處理對于朱槿幼苗的地徑和根冠比等影響均沒有顯著的差異。由表2可知，干旱脅迫后復(fù)水對株高的補償效應(yīng)較明顯，達到與CK相近的效果，而對于地徑和根冠比等指標(biāo)則沒有顯著的影響。

2.3? 干旱脅迫及復(fù)水處理對朱槿根際土壤微生物類群的相關(guān)分析

以不同水分處理土壤樣品分布的屬分類水平

數(shù)為依據(jù)，用Mothur軟件對各不同處理的土壤樣品微生物多樣性進行相關(guān)分析，構(gòu)建Venn圖（圖1）。Venn圖可展現(xiàn)多個樣品中所共有的屬分類水平數(shù)目，屬分類水平數(shù)目反映環(huán)境樣品的相似性及重疊情況。由圖1可知，不同水分處理下的土壤中細菌的共有優(yōu)勢細菌屬為594，占總細菌屬的90.69%。T1的特有優(yōu)勢細菌屬最多，占總細菌屬的1.98%，而CK處理與T2的特有優(yōu)勢細菌屬僅分別占總細菌屬的0.46%和0.76%。真菌方面，不同水分處理下的朱槿根際土壤中真菌的共有優(yōu)勢真菌屬為94，占總優(yōu)勢真菌屬的68.12%。其中，T2的特有優(yōu)勢真菌屬最多，占總優(yōu)勢真菌屬的7.97%，而CK與T1的特有優(yōu)勢真菌屬分別為4.35%和2.17%。

2.4? 干旱脅迫及復(fù)水處理下朱槿土壤微生物類群特征

通過高通量測序技術(shù)對土壤樣品微生物中的細菌部分進行V3～V4區(qū)測序，不同處理土壤樣品共獲得有效序列364?442條，片段長度在401～ 460?bp，測序覆蓋度在98.27%～98.88%之間?；谄錅y序深度基本能夠反映該區(qū)域所涵蓋的細菌群落的結(jié)構(gòu)以及種類等特性，可進行定量比較群落組成以及物種多樣性的相對差異。

分析朱槿根際土壤樣品細菌多樣性發(fā)現(xiàn)，屬分類水平上（圖2），厭氧繩菌屬（Anaerolineaceae）為朱槿根際土壤細菌的優(yōu)勢菌屬，相對含量平均值約占總?cè)郝涞?.30%～9.65%。其中，CK土壤中的相對豐度最低，而T2土壤中的相對豐度最高。此外，酸桿菌屬（Acidobacteria）、酸微菌屬（Acidimicrobiales）、幽門螺桿菌屬（Sphae?robacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）等也是不同處理朱槿根際土壤中的優(yōu)勢菌群。其中，CK的土壤樣品中酸微菌屬（Acidimicrobiales）的相對豐度占比最高，T1的土壤樣品中的幽門螺桿菌屬（Sphaerobacter）的相對豐度占比最低，說明水分含量的降低在一定程度上有降低幽門螺桿菌的作用。而T2的土壤樣品中，熱丁香類諾卡氏菌（Nocardioides）屬的相對豐度占比最高，熱丁香類諾卡氏菌（Nocardioides）最早分離自越南南部土壤，諾卡氏菌屬成員的特征是革蘭氏陽性，非酸性，好氧菌，過氧化氫酶陽性，橫隔斷裂成球狀或棒狀，是一種嗜熱菌屬[15]。此外，與CK相比，酸桿菌屬（Acidobacteria）、鏈霉菌屬（Strep?tomyces）等其他細菌群落在不同處理下相對豐度占比均發(fā)生一定程度的變化，但變化效果不顯著。另一方面，T1的嗜青霉屬（Algiphilus）、奧利螺旋菌屬（Aureispira）、綠線菌屬（Chlor?onema）、扁棒殼屬（Acrospermum）為不同處理下的特殊真菌屬。

通過高通量測序技術(shù)對土壤樣品微生物中的真菌部分進行V5～V7區(qū)測序，不同處理土壤樣品共獲得有效序列350?138條，片段長度在361～ 420?bp，測序覆蓋度在99.54%～99.95%之間。分析朱槿根際土壤中真菌多樣性發(fā)現(xiàn)：屬分類水平上（圖3），糞殼菌屬（Sordariale）為朱槿根際土壤的優(yōu)勢真菌屬。其中，以T1的根際土壤中相對豐度最高，占樣品總豐度的40.38%，而CK與T2的相對豐度占比分別為27.24%和29.16%。此外，T1的擬青霉屬（Pseudallescheria）、糞殼菌屬（Sordariomycetes）、枝孢霉屬（Clados?porium）等相對豐度占比均高于CK及T2處理。格孢腔菌屬（Pleosporales）的相對豐度占比在CK的土壤樣品中最高、占樣品總相對豐度的12.73%，是其他2種處理下相對豐度占比的3.10～3.59倍。此外，與CK相比，干旱脅迫下，散囊菌屬（Eur?o?tiales）、分生孢子蟲屬（Coniochaetaceae）等其他部分真菌群落的相對豐度占比并沒有顯著的變化。另一方面，T1和T2的樣品中側(cè)角藻屬（Gonio?monas）、齒盤菌屬（Lamprospora）和索羅迪夫斯菌屬（Sorodiplophrys）為不同處理下的特殊真菌屬。

2.5? 干旱脅迫及復(fù)水處理下朱槿根際土壤微生物多樣性的變化特征

由表3可知，與CK相比，干旱脅迫及復(fù)水處理下的朱槿土壤微生物的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)及覆蓋率均沒有顯著的變化。干旱脅迫及復(fù)水處理下朱槿根際土壤微生物的豐富度和多樣性沒有顯著的變化。

3? 討論

逆境條件下，作物會通過體內(nèi)一系列的生理生化變化去適應(yīng)周圍的環(huán)境，而其變化最終體現(xiàn)在植株外部形態(tài)上。干早脅迫限制了作物根系和地上部的生長，降低了作物的干物質(zhì)積累[16]。與CK相比，T1的朱槿總根長、總根表面積、總根體積、根尖數(shù)以及朱槿幼苗的株高及鮮重（地上部、根系）等指標(biāo)均顯著減少，T2的總根表面積、總根體積及根尖數(shù)以及朱槿幼苗的株高及鮮重（地上部、根系）等指標(biāo)與CK相比也是有一定程度的減少，但與T1相比，均顯著增加，產(chǎn)生了較明顯的補償效應(yīng)[17]。有研究表明，植物根系是植物直接吸收水分的重要器官，對植物的抗旱功能具有至關(guān)重要的作用。發(fā)達的根系系統(tǒng)可使植物充分吸收利用貯存在土壤中的水分，使植物度過干旱期。與地上部莖、葉生長反應(yīng)相比較，干旱脅迫對根系生長的影響相對較小，結(jié)果使根冠比提高[18-19]，而本研究中根冠比在不同處理下并沒有顯著變化，可能與試驗處理時間及植物自身對逆境的補償機制有關(guān)，具體原因還需要更深入的研究。

本研究基于高通量測序技術(shù)，分析朱槿根際土壤細菌多樣性發(fā)現(xiàn)，屬分類水平上，厭氧繩菌屬（Anaerolineaceae）相對豐度在CK處理中最低，但在T2處理中相對豐度最高。厭氧繩菌屬（Anaerolineaceae）細菌主要參與烷烴的產(chǎn)甲烷降解過程，烷烴最初可能通過添加富馬酸被激活，被分解為脂肪酸，然后轉(zhuǎn)化為乙酸[20]。此外，在不同處理條件下發(fā)現(xiàn)了通常在巖石中才被發(fā)現(xiàn)的且能氧化金屬硫化物酸微菌屬（Acidimicrobium）的相應(yīng)序列，揭示出酸微菌亞綱（Acidimicrobidae）中還存在大量未知的放線菌新類群[21]。幽門螺桿菌屬（Sphaerobacter）是一種微厭氧、化學(xué)異養(yǎng)、過氧化氫酶-陽性的嗜熱鏈球菌[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同水分處理下對土壤中的幽門螺桿菌屬（Sph?aerobacter）的豐度比例沒有顯著地變化。

對朱槿根際土壤真菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)，糞殼菌屬（Sordariale），擬青霉屬（Pseudallescheria）、枝孢霉屬（Cladosporium）真菌在T1的相對豐度占最高;格孢腔菌屬（Pleosporales）真菌在CK的相對豐度最高。部分研究已表明，擬青霉屬（Pseudallescheria）是一些植物寄生線蟲的重要天敵，能夠寄生于卵，也能侵染幼蟲和雌蟲，可明顯減輕多種作物根結(jié)線蟲、胞囊線蟲、莖線蟲等植物線蟲病的危害，是1種有潛力的生防真菌[23]。枝孢霉屬（Cladosporium）在植物受到重金屬污染時，可減輕Hg2+和Cd2+等金屬離子對植物的的毒害作用[24]。

T1的嗜青霉屬（Algiphilus）為不同處理的特殊細菌屬，該屬菌株最早是從海洋甲藻（CCAP 1121/2）的實驗室培養(yǎng)中分離到一株嚴格耐氧、耐鹽性強的革蘭氏陰性桿狀細菌，其能夠降解二和三環(huán)多環(huán)芳烴。該屬菌株顯示出較窄的營養(yǎng)譜，更優(yōu)先食用脂族和芳烴化合物，以及少量有機酸[25]，對緩解土壤中多環(huán)芳香烴的危害有一定的作用。此外，奧利螺旋菌屬（Aureispira）、綠線菌屬（Chlo?ronema）、扁棒殼屬（Acrospermum）也是T1處理的特殊細菌屬。另外，T1和T2處理的樣品中側(cè)角藻屬（Goniomonas）、齒盤菌屬（Lamprospora）和索羅迪夫斯菌屬（Sorodiplophrys）為不同處理下的特殊真菌屬。

由于全球氣候變化，長期干旱、局部地區(qū)缺水的極端事件可能會進一步增加。為了應(yīng)對其造成的惡化影響，需要采取廣泛的適應(yīng)和緩解戰(zhàn)略。但傳統(tǒng)的策略的制定時間長、成本高，需要開發(fā)簡單、低成本的生物方法來管理非生物脅迫。植物相關(guān)微生物對非生物脅迫具有重要的抗逆性，其生物可能包括輪藻面、內(nèi)生細菌和共生真菌，并通過觸發(fā)滲透反應(yīng)和誘導(dǎo)植物中新基因等多種機制運作。通過基因工程和植物育種開發(fā)抗逆性品種是必要的，但這是一個漫長的過程，而微生物接種以減輕植物的壓力是一種成本效益更高的環(huán)境友好型選擇，可在較短的時間內(nèi)獲得[26-29]。如果能利用微生物對極端生物的耐受性、其普遍性、遺傳多樣性、微生物與作物的相互作用以及開發(fā)其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中成功應(yīng)用的方法，就可發(fā)揮微生物重要的作用[30-31]。微生物除了通過產(chǎn)生胞外多糖和形成生物膜來影響根際土壤的理化性質(zhì)外，還可通過誘導(dǎo)保護劑和熱休克蛋白等不同的機制，影響高等植物對非生物脅迫的響應(yīng)[32]。本研究中，干旱脅迫下的朱槿土壤微生物的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)及覆蓋率均沒有顯著的變化，但與CK相比，T1的朱槿總根長、總根表面積、總根體積、根尖數(shù)以及朱槿幼苗的株高及鮮重（地上部、根系）等指標(biāo)均顯著減少。其結(jié)果可能與微生物和植物對水分脅迫條件下的適應(yīng)性以及水分脅迫的臨界值不同有關(guān)。具有促生作用的細菌如酸微菌屬（Acidimicrobium）、厭氧繩菌屬（Anaerolineaceae）等，以及具有一定生防作用真菌如擬青霉屬（Pseudallescheria）、枝孢霉屬（Cladosporium）和嗜青霉屬（Algiphilus）等均可合理的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，為植物的抗干旱、提高植物在干旱脅迫下對水分的利用率等作出貢獻。此外，本研究還可對植物在冷害、鹽害、金屬毒性和高溫等非生物脅迫下的生存難題提供一個以微觀世界的角度來解決宏觀問題的方向。

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