陳曙 趙秋芳 陳宏良, 金輝

摘? 要：泛素結(jié)合酶是泛素/蛋白酶體途徑的重要組成部分，在蛋白質(zhì)的泛素化過程中具有重要作用。本研究利用生物信息學(xué)對(duì)玉米泛素E2家族成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化及基因結(jié)構(gòu)分析。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，玉米泛素結(jié)合酶基因可分為6個(gè)亞家族，各亞家族成員數(shù)目差異較大。基因數(shù)目最多的亞家族是UBC1，為22個(gè)。成員數(shù)最少的是UBC3，僅為5個(gè)。以亞家族UBC2為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)UBC2中一共存在4對(duì)旁系同源基因，分別是ZmUBC3/ZmUBC70、ZmUBC8/ZmUBC34、ZmUBC31/ZmUBC53以及ZmUBC45/ZmUBC66。對(duì)UBC2中成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，互為旁系同源的基因其基因結(jié)構(gòu)相似。ZmUBC45/ ZmUBC66含有外顯子數(shù)量最多，為9個(gè)，而ZmUBC31/ZmUBC53外顯子含量最小，僅為4個(gè)?；蚧蚍治鼋Y(jié)果顯示，ZmUBC3/ZmUBC70含有基序數(shù)量最多（8個(gè)），ZmUBC8/ZmUBC34與ZmUBC31/ZmUBC53基序含量最?。ň鶠?個(gè)）?；騿?dòng)子作用元件分析顯示，泛素E2基因啟動(dòng)子元件類型可分為光響應(yīng)、激素響應(yīng)和脅迫響應(yīng)元件、組織表達(dá)相關(guān)元件以及周期性調(diào)控相關(guān)元件5大類?；虿煌M織表達(dá)分析顯示，被檢測(cè)基因在玉米雌花中均有很高的表達(dá)量，在根和莖中表達(dá)量最低。低氮脅迫結(jié)果顯示，所有被檢測(cè)基因在低濃度NO3處理下，其基因相對(duì)表達(dá)量在1 h降至最低，隨后逐漸上升。在低濃度NH4+處理?xiàng)l件下，各基因表達(dá)量逐漸降低，在24 h達(dá)到最低值。以上結(jié)果表明，泛素結(jié)合酶亞家族UBC2基因受低氮脅迫的影響其表達(dá)量發(fā)生了變化。

關(guān)鍵詞：泛素結(jié)合酶;系統(tǒng)進(jìn)化分析;生物信息學(xué);低氮脅迫反應(yīng)

中圖分類號(hào)：Q786????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Ubiquitin-binding enzyme is an important component of the ubiquitin/proteasome pathway， playing an important role in protein ubiquitination. In this study， bioinformatics tools were used to systematically analyze the maize gene structure and evolution relationship of ubiquitin E2 family members. Phylogenetic analysis showed that the maize ubiquitin-binding enzyme genes could be divided into six subfamilies. The number of the members in each subfamily is different. Subfamily UBC1 contained the largest numbers （22 genes）， while the least number of members was UBC3， only five genes. Based on the subfamily UBC2， it was found that there were four paralogous genes in UBC2， namely ZmUBC3/ZmUBC70， ZmUBC8/ZmUBC34， ZmUBC31/ZmUBC53 and ZmUBC45/ZmUBC66. Gene structure analysis revealed that the paralogous genes were similar in structure. ZmUBC45/ZmUBC66 contained the largest number of exons （9 exons） while ZmUBC31/ZmUBC53 only had four. Gene motif analysis results showed ZmUBC3/ZmUBC70 contained eight motifs while ZmUBC8/ZmUBC34 and ZmUBC31/ZmUBC53 only had three. Gene promoter element analysis revealed that there were five component types， which were photo response elements， hormone response elements， stress response elements， tissue expression related components， and periodic regulation related components. Gene expression analysis indicated that all the tested genes had high expression levels in the female flowers but the lowest expression in roots and stems. The low nitrogen stress test suggested that the relative expression of all the tested genes decreased rapidly to a minimum at 1th hour， then increased slowly. Under low concentration of NH4+ treatment， the expression level of each gene gradually decreased and reached the lowest value at the 24th hour point. The results suggested that the maize ubiquitin-binding enzyme genes may be involved in the response of low nitrogen stress pathway.

Keywords： ubiquitin-binding enzyme; phylogenetic analysis; bioinformatics; low nitrogen stress response

玉米是世界主要糧食作物之一，也是我國種植面積最大、用途最廣、總產(chǎn)量最高的作物。其在整個(gè)生長周期中會(huì)受到各種外界不利因素的影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成減產(chǎn)甚至死亡。植物在長期的自然進(jìn)化過程中形成了一套完整的防御機(jī)制，能確保自身順利繁衍下去。泛素化過程是真核生物體內(nèi)普遍存在的一種特異性降解蛋白途徑，能調(diào)控細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、逆境脅迫以及蛋白質(zhì)的胞內(nèi)定位等諸多生物學(xué)過程[1]。泛素E2家族是植物泛素/蛋白酶體系統(tǒng)中的重要組成部分，含有一個(gè)具有140～220 aa的UBC保守催化結(jié)構(gòu)域，能夠通過UBC結(jié)構(gòu)域與E3的RING結(jié)構(gòu)域相互作用并特異性識(shí)別底物蛋白[2]。目前已在多種物種中鑒定出了泛素結(jié)合酶基因，其中酵母中14個(gè)[3]、擬南芥中37個(gè)[4]、水稻中48個(gè)[5]、番茄中52個(gè)[6]、人類50個(gè)[7]等。研究表明，E2基因在植物的生長發(fā)育、DNA修復(fù)以及逆境脅迫等方面具有重要的作用。E2基因通過與蛋白Mms2p/Uevla形成復(fù)合物，在UBC保守結(jié)構(gòu)域的賴氨酸催化位點(diǎn)上形成泛素鏈，進(jìn)而對(duì)受損核酸進(jìn)行修復(fù)[8]。在擬南芥中，AtUBC13與E3連接酶RNF8 協(xié)同產(chǎn)生RNF8- UBC13復(fù)合物，定位受損核酸并將其泛素化并傳遞信號(hào)至RAP80 修復(fù)蛋白，對(duì)受損DNA進(jìn)行修復(fù)[9]。番茄果實(shí)中E2基因的啟動(dòng)子區(qū)能夠與果實(shí)成熟調(diào)控因子（RIN）相結(jié)合，將E2基因沉默后發(fā)現(xiàn)，番茄成熟時(shí)果實(shí)著色發(fā)生了改變[10]。在擬南芥中，AtUBC1與AtUBC2在葉和花中大量表達(dá)，并能夠結(jié)合和激活基因Flowering Locus C，抑制擬南芥的開花[11]。一些研究者還發(fā)現(xiàn)，棉花中GhUNC1與GhUNC2基因能夠通過選擇性降解調(diào)控生長素運(yùn)輸過程的蛋白，繼而延遲植株的衰老[12]。在逆境脅迫中，E2基因同樣具有重要的作用。將擬南芥進(jìn)行缺鐵處理，過表達(dá)AtUBC13基因后，擬南芥根部對(duì)鐵元素的吸收效率明顯提高，將AtUBC13敲除后，植株則表現(xiàn)出了明顯的缺鐵癥狀[13]。將大豆Gm?UBC2基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中過表達(dá)發(fā)現(xiàn)，擬南芥對(duì)干旱及鹽脅迫的耐受性增強(qiáng)[14]。此外，Eunsook等[15]發(fā)現(xiàn)綠豆中的VrUBC1基因參與對(duì)細(xì)胞滲透壓的調(diào)控過程。Mural等[16]發(fā)現(xiàn)E2基因能夠調(diào)節(jié)增強(qiáng)植物自身的免疫能力從而提升對(duì)植物病原菌的抗性。

氮素作為植物重要的信號(hào)分子，在植物的生長以及逆境脅迫中都有著重要的作用。植物根系吸收的氮素形態(tài)主要由銨態(tài)氮和硝態(tài)氮兩種形式，在氮素缺乏時(shí)，植物自身會(huì)激活根系的“覓食反應(yīng)”，改變根部結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)對(duì)土壤環(huán)境中的氮素感知和吸收能力[17]。有研究表明，蛋白的泛素化過程參與了植物缺素后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[18]。在低氮環(huán)境下，擬南芥AtUBC8蛋白在細(xì)胞核中與NLA基因編碼的一類RING型的泛素連接酶進(jìn)行互作，來調(diào)控植株缺氮后的適應(yīng)性反應(yīng)，將NLA基因Ring結(jié)構(gòu)域突變后，AtUBC8基因無法定位NLA基因并進(jìn)行互作，nla突變體表現(xiàn)出對(duì)低氮溶液超敏現(xiàn)象[19]。同樣在擬南芥中，PHO2作為磷轉(zhuǎn)運(yùn)負(fù)調(diào)控因子，通過與AtUBC24結(jié)合參與到對(duì)植物體內(nèi)磷代謝途徑中，在pho2突變體中，植株地上部分磷含量超常積累，無法對(duì)體內(nèi)磷素進(jìn)行運(yùn)輸和再分配，植株表現(xiàn)出磷中毒現(xiàn)象[20]。目前對(duì)于植物E2家族基因的功能的研究已有較多報(bào)導(dǎo)，但大部分主要集中在模式植物擬南芥上以及植物抗逆脅迫方面，對(duì)于泛素結(jié)合酶E2在植物缺素脅迫響應(yīng)中的功能的研究尚不多見。已有研究對(duì)玉米E2家族基因進(jìn)行了鑒定和分類[21]，為進(jìn)一步研究E2基因在玉米吸收氮素的途徑中的作用，本研究通過生物信息學(xué)、qRT-PCR方法對(duì)該家族成員進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式的初步研究。

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)材料及處理方法

供試材料為玉米自交系Mo17，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究中心提供。種子播種于25 cm×20?cm的塑料盆中，所用土壤為基質(zhì)營養(yǎng)土（營養(yǎng)土∶蛭石=3∶1），萌發(fā)后置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調(diào)整培養(yǎng)箱恒定溫度為（26±6）℃，光照時(shí)間為12 h。待幼苗長至三葉期時(shí)，剔除弱苗及死苗，挑選出生長狀態(tài)一致的健壯苗。以不作處理為對(duì)照，2個(gè)低氮處理分別為：（1）將幼苗置于1/50低氮Hoagland培養(yǎng)液（KNO3代替NH4NO3，且NO3濃度為對(duì)照組的1/50，溶液其它元素含量與對(duì)照均一樣）中培養(yǎng);（2）將幼苗置于1/50低氮Hoagland培養(yǎng)液（NH4Cl代替NH4NO3，NH4+ 濃度為對(duì)照組的1/50，溶液其它元素含量與對(duì)照均一樣）中培養(yǎng)。分別取上述2種處理方式下對(duì)照組（0 h）和處理組1、6、24 h的幼苗葉片，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取5株混合取樣，放入液氮中速凍，并立即放入?80?℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有?shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2? 玉米泛素結(jié)合酶基因的基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

用生物信息學(xué)的方法對(duì)玉米泛素結(jié)合酶基因家族成員進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，泛素E2家族中共有75個(gè)泛素結(jié)合酶基因，根據(jù)其在染色體的位置將其依次命名為ZmSUS1-ZmSUS75[21]。本研究利用ME?ME4.0（http：//meme-suite.org/tools/meme）工具分析玉米UBC家族蛋白的保守基序。利用在線軟件Gene Structure Display Server2.0（GSDS2.0）分析玉米E2基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)。運(yùn)用MEGA6軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining），使用P-距離模型，重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1000，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3? 玉米泛素E2基因家族成員啟動(dòng)子作用元件分析

從Ensembl Plants（http：//plants.ensembl.org/ Zea_mays/Info/Index）中搜索UBC家族成員的基因編號(hào)，獲取基因上游約1500?bp的片段序列，將序列導(dǎo)入PlantCARE（http：//bioinformatics.psb. ugent.be/ webtools/plantcare/html/）中，可獲得目的基因啟動(dòng)子上的每一個(gè)作用元件，從而預(yù)測(cè)基因的潛在生物學(xué)功能。

1.4? 不同組織器官的表達(dá)模式分析

利用北京華越洋生物有限公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒提取玉米在抽雄期根、莖、葉、穗絲、雄花和幼果的總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取其cDNA，具體操作方法見說明書。并根據(jù)基因全長利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（交由生工生物工程（上海）有限公司合成）。表1為組織器官特異性表達(dá)以及低氮脅迫下相對(duì)定量所用的對(duì)應(yīng)引物，內(nèi)參基因?yàn)?8S?rRNA。熒光定量所用儀器為羅氏LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)選用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司生產(chǎn)），熒光定量PCR試劑盒選用TaKaRa公司生產(chǎn)的SYBR Green Master Mix。反應(yīng)體系為10?L，其中SYBR Green Master Mix酶混合液5?L，上下游引物各1?L，cDNA模板0.8?L，其余不足部分補(bǔ)足ddH2O至10 L。反應(yīng)程序?yàn)椋?5?℃預(yù)變性5 min，95?℃變性30 s，58?℃退火30 s，72?℃延伸40 s，循環(huán)數(shù)為40個(gè)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，并利用2ΔΔCT計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量大小。

1.5? 低氮脅迫下泛素E2家族基因成員的表達(dá)分析

以低氮條件處理后的對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的不同時(shí)間點(diǎn)下的葉片cDNA為模板，以18S rRNA為內(nèi)參基因，選用引物見表1，反應(yīng)體系及PCR擴(kuò)增程序同1.4中一樣。

1.6? 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 玉米泛素結(jié)合酶蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)玉米E2家族75個(gè)成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果顯示，玉米E2蛋白家族可分為UBC1～ UBC6共6個(gè)亞家族，不同亞家族之間成員數(shù)目差異較為明顯，UBC1成員數(shù)目最多，為22個(gè)，UBC3最少，僅為5個(gè)。不同亞家族間旁系同源蛋白數(shù)量差異明顯，亞家族UB1中旁系同源蛋白數(shù)量為9對(duì)，亞家族UBC2中為4對(duì)，亞家族UBC3中為2對(duì)，亞家族UBC4中為6對(duì)，亞家族UBC5中為3對(duì)，亞家族UBC6中為5對(duì)，說明生物在進(jìn)化的過程中逐漸產(chǎn)生了功能有差異性的同源蛋白。

為了解不同亞家族成員之間的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式的差異性，本研究選擇UBC2亞家族成員作為研究對(duì)象進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)、基序以及后續(xù)的基因表達(dá)差異性分析（圖2）。進(jìn)化關(guān)系顯示，UBC2亞家族中存在4對(duì)旁系同源基因，其分別是ZmU?BC3/ZmUBC70、ZmUBC45/ZmUBC66、ZmUB?C31/ ZmUBC53以及ZmUBC8/ZmUBC34。內(nèi)含子/外顯子作為家族基因進(jìn)化的重要印跡，對(duì)基因的結(jié)構(gòu)和功能有著重要的影響?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，UB?C?2

圖1? 玉米E2家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig. 1? Unrooted dendrogram of all maize E2 proteins

亞家族中互為同源基因的成員含有相似的基因結(jié)構(gòu)，ZmUBC45/ ZmUBC66含有外顯子數(shù)量最多，為9個(gè)，ZmUBC31/ ZmUBC53外顯子含量最少，為4個(gè)。對(duì)玉米UBC2亞家族成員蛋白保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果也基本支持了玉米E2基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析的分類以及UBC2亞家族基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。

基因保守基序預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3所示，互為同源基因的成員其基序數(shù)量相同，基序排列順序相似?；蚝孔疃嗟耐椿?qū)κ荶mUBC3/ZmUBC70，基序數(shù)量為8個(gè)，缺少motif2與motif6。ZmUBC8/ZmUBC34與ZmUBC31/Zm?UB?C53基序含量最少，均為3個(gè)，含有motif1、motif2以及motif3。以上結(jié)果表明，同一亞家族中不同基因的結(jié)構(gòu)及基序存在一定的差異，其差異可能在基因的功能特異性中具有重要的作用。

2.2? 玉米泛素結(jié)合酶家族基因的啟動(dòng)子作用元件分析

基因啟動(dòng)子元件分析結(jié)果顯示，玉米E2基因啟動(dòng)子含有元件主要可分為5大類，依次為光響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、組織表達(dá)相關(guān)元件以及周期性調(diào)控相關(guān)元件（表2）。不同成員含有的元件類型和數(shù)量均有差別。Zm?UB?C3不含有組織表達(dá)及周期性調(diào)控相關(guān)元件，而ZmUBC34、ZmUBC45及ZmUBC66則含有上述5大類元件。所有成員均含有光、激素、脅迫相關(guān)響應(yīng)元件，不同成員所含數(shù)量差異較大，表明玉米UBC2亞家族基因成員間功能差異明顯。

進(jìn)一步分析激素類啟動(dòng)子元件和脅迫響應(yīng)元件類型發(fā)現(xiàn)，激素類啟動(dòng)子元件分為5類：分別為生長素（IAA）、赤霉素（GA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）和茉莉酸甲酯（MeJA）。前3類對(duì)植物主要起促進(jìn)生長發(fā)育的作用，后2類主要功能為調(diào)控果實(shí)的成熟。從圖4A中看出，UBC2亞家族成員所含有的激素元件類型主要為茉莉酸甲酯和脫落酸，表明E2基因家族參與了果實(shí)成熟的調(diào)控過程。脅迫類型元件主要分為缺氧性誘導(dǎo)與干旱和低溫脅迫2大類（圖4B）。缺氧性誘導(dǎo)元件數(shù)量最大，存在于所有被檢測(cè)基因中，揭示了E2基因可能參與了玉米的缺氧性應(yīng)答反應(yīng)，如高海拔地區(qū)種植或玉米根部發(fā)生無氧呼吸等情況。

2.3? 玉米E2基因在不同組織的表達(dá)分析

如圖5所示，玉米泛素結(jié)合酶基因在被檢測(cè)的不同部位中均有表達(dá)，且表達(dá)差異明顯。Zm?UBC3、ZmUBC31、ZmUBC34、ZmUBC45、ZmUBC53和ZmUBC66在玉米雌花中的表達(dá)量最高，在莖和葉中表達(dá)量最低。ZmUBC8在苞葉中的表達(dá)量最高，在葉、雌花及雄穗中也有較高的表達(dá)量，在莖中表達(dá)量最低。ZmUBC70檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在葉中具有最高的表達(dá)量，在莖中表達(dá)量最低。

2.4? 玉米E2基因在不同氮形態(tài)脅迫下的表達(dá)分析

為探究上述8個(gè)基因在不同氮形態(tài)脅迫下的表達(dá)模式，本研究利用硝酸鉀和氯化銨分別代替原Hoagland中硝酸銨成分，檢測(cè)目標(biāo)基因在不同氮素脅迫下的響應(yīng)情況。結(jié)果表明，在低濃度硝態(tài)氮脅迫下，被檢測(cè)的8個(gè)基因表達(dá)水平均出現(xiàn)不同程度的下降，ZmUBC3、ZmUBC8、ZmUBC31、ZmUBC34、ZmUBC45、ZmUBC53、ZmUBC66在處理后的1h下降到了最低水平，隨后在6、24 h內(nèi)表達(dá)水平逐漸上升，但仍小于0?h（對(duì)照）時(shí)基因的表達(dá)量（圖6）。ZmUBC70在6 h時(shí)表達(dá)量最低，在24 h表達(dá)水平有一定上升，但并不明顯。而在低濃度銨態(tài)氮的脅迫下，被檢測(cè)基因表達(dá)水平同利用硝態(tài)氮脅迫情況類似，基因表達(dá)下調(diào)，不同的是，在銨態(tài)氮脅迫下，基因表達(dá)水平逐步下降，在24 h時(shí)達(dá)到最低水平。以上結(jié)果說明，玉米中8個(gè)基因?qū)τ谙鯌B(tài)氮脅迫響應(yīng)速度要快于銨態(tài)氮。而上述被檢測(cè)基因均來自于玉米泛素結(jié)合酶UBC2亞家族，表明玉米泛素結(jié)合酶可能參與了玉米對(duì)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的脅迫響應(yīng)過程。

圖5? 玉米UBC2亞家族基因在不同組織的表達(dá)分析

Fig. 5? Expression analysis of maize UBC2 subfamily gene in different maize tissues

圖6? UBC2亞家族基因在不同低氮形態(tài)脅迫下的表達(dá)分析

Fig. 6? Expression analysis of UBC2 Subfamily gene under different low nitrogen stress

3? 討論

生物信息學(xué)作為分析基因組結(jié)構(gòu)和功能的重要工具，在基因家族成員鑒定、理化性質(zhì)分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析、蛋白結(jié)構(gòu)分析以及功能預(yù)測(cè)等方面具有重要作用。而泛素E2家族作為植物泛素家族中的重要組成部分，在植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成以及生物和非生物脅迫中起到了重要的作用[16]。本研究通過生物信息學(xué)方法對(duì)玉米泛素UBC家族基因進(jìn)行了分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，玉米泛素E2家族內(nèi)部分為6個(gè)亞家族，暗示了基因功能的多樣性，表明玉米E2基因在進(jìn)化過程中是按照物種進(jìn)化的特異性進(jìn)行擴(kuò)張。基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)亞家族中不同UBC基因的內(nèi)含子和外顯子數(shù)量以及基因長度等均有一定的差異，但同屬一個(gè)旁系同源基因?qū)Φ幕蚱浠蚪Y(jié)構(gòu)相似，內(nèi)含子及外顯子數(shù)量均一致。同樣蛋白基序預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，互為旁系同源基因的成員其基序數(shù)量相同，排列順序一致，而非旁系同源基因?qū)Φ幕蚧驍?shù)量、結(jié)構(gòu)差異明顯。其說明泛素結(jié)合酶基因結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化可能導(dǎo)致了基因結(jié)構(gòu)的多樣性。

泛素結(jié)合酶作為植物泛素/蛋白酶體系統(tǒng)的主要成分，在植物的生長發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白運(yùn)輸以及生物或非生物脅迫應(yīng)答中均起到了重要的作用。啟動(dòng)子是控制基因轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)，位于基因5端的上游，能夠調(diào)控RNA聚合酶與DNA模板的精準(zhǔn)結(jié)合，并通過上下游順式作用元件調(diào)控基因的表達(dá)[22]。本研究對(duì)啟動(dòng)子元件類型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，泛素結(jié)合酶所含啟動(dòng)子元件類型主要分為光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件、組織表達(dá)調(diào)控元件以及周期性調(diào)控元件5大類。在激素類中，脫落酸與赤霉素順式元件存在于所有被檢測(cè)基因中，其說明泛素UBC基因可能參與了對(duì)植物的生長發(fā)育和果實(shí)的成熟調(diào)控過程。在逆境脅迫元件中，被檢測(cè)UBC基因以缺氧性誘導(dǎo)元件居多，其暗示泛素UBC基因可能響應(yīng)玉米低氧脅迫反應(yīng)。

對(duì)基因的組織表達(dá)模式分析有助于了解基因的生物學(xué)功能。本研究中，在玉米抽穗期對(duì)UBC2亞家族中的8個(gè)基因進(jìn)行組織器官表達(dá)分析，各基因在不同組織器官中進(jìn)行了差異性表達(dá)。旁系同源基因ZmUBC45與ZmUBC66以及ZmUBC31與ZmUBC53具有相似的表達(dá)模式，其意味著旁系同源基因中的某個(gè)基因的表達(dá)已經(jīng)不占據(jù)主導(dǎo)地位，可能產(chǎn)生了“冗余”現(xiàn)象。ZmUBC3/ZmUB?C70和ZmUBC8/ZmUBC34兩對(duì)同源基因中，成員內(nèi)部之間具有不同的表達(dá)模式，其表明這些基因家族成員可能正在加劇分化，產(chǎn)生了不同的生物學(xué)功能。

氮素作為植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一，與植物體內(nèi)蛋白、核酸、磷脂以及激素的合成密切相關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，氮素作為植物葉綠素的重要組成部分，能夠影響植物光合作用中的酶活性。此外，植物體內(nèi)氮素水平能夠影響ABA的含量，并協(xié)同ABA一起參與調(diào)節(jié)植物葉片氣孔的開放過程，提升光合作用效率[24-25]。植物體內(nèi)氮素還能夠與土壤中水分發(fā)生正向交互作用，提升作物根系對(duì)水分的吸收效率，進(jìn)而提升作物的抗旱水平，提高產(chǎn)量[26]。植物在生長發(fā)育過程中會(huì)受到各種逆境脅迫作用，同時(shí)也形成了抵御逆境脅迫的一系列機(jī)制。泛素結(jié)合酶作為植物泛素/蛋白酶體系統(tǒng)中的重要組分，對(duì)蛋白進(jìn)行泛素化修飾和降解，在植物響應(yīng)逆境中有著重要作用。為了解低氮脅迫下植物泛素基因的表達(dá)模式，本研究利用NH4+及NO3 兩種形態(tài)的氮素營養(yǎng)對(duì)玉米幼苗進(jìn)行低氮脅迫處理。檢測(cè)結(jié)果顯示，各基因表達(dá)模式相似，在低濃度KNO3溶液處理后1 h，基因相對(duì)表達(dá)量迅速降至最低，隨后逐步上升。經(jīng)低濃度NH4Cl溶液處理后，基因表達(dá)量逐步下降，這與Peng等[27]的研究結(jié)果有一定差別。Peng等[27]研究結(jié)果顯示，對(duì)擬南芥進(jìn)行低氮條件下處理4周后，泛素基因相對(duì)表達(dá)量均顯示上調(diào)。猜測(cè)在低氮處理?xiàng)l件下，泛素基因的表達(dá)可能與實(shí)驗(yàn)材料處理時(shí)間的長短有關(guān)，隨著處理時(shí)間的不斷變長，泛素基因的表達(dá)量先降低后升高，最后趨于穩(wěn)定。當(dāng)然這些猜想需要通過后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來論證。以上結(jié)果說明，玉米泛素結(jié)合酶UBC2亞家族基因在應(yīng)對(duì)低濃度NO3和NH4+?兩種形態(tài)氮素脅迫時(shí)具有不同的應(yīng)答模式，在受脅迫影響后基因表達(dá)水平迅速發(fā)生變化，推測(cè)該家族基因可能參與了玉米應(yīng)答低氮脅迫響應(yīng)途徑。

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