吳彩霞，劉朝明*，顏泉梅，張全軍，歐陽振，趙宇，樊娜娜，賴良學(xué)，2*

(1. 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東 廣州 510530；2. 吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

動物模型是科學(xué)研究不可缺少的工具，受到取材和倫理道德的限制，很多研究無法直接在人體中進行，必須首先依靠動物模型進行廣泛的試驗和評估。小鼠等嚙齒類作為經(jīng)典的模式動物，在行為學(xué)研究方面都已非常深入，但由于其本身存在著難以克服的缺陷使其越來越難以滿足科研需求。一些致病突變在小鼠上引起的癥狀與在人類自身引起的癥狀明顯不同甚至截然相反，這讓小鼠等嚙齒類動物模型無法滿足人類疾病相關(guān)的研究[1]。家兔生理結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)發(fā)育也比嚙齒類動物更接近于人類，尤其是比小鼠等能更真實地模擬人類疾病的發(fā)病機制，目前已經(jīng)成為多種人類疾病模型和發(fā)育機制研究模型的首選[2]。兔作為極具利用價值的實驗動物模型，與其自身特有的生物學(xué)特點及發(fā)育特點密切相關(guān)。兔性成熟早、妊娠期短、窩產(chǎn)仔數(shù)多、個體差異小等特點[3]。和其它動物(小鼠、豚鼠、豬等)相比，兔體型適中，價格低、飼養(yǎng)管理成本低，適合科研機構(gòu)在有限的空間內(nèi)飼養(yǎng)、繁殖、操作、觀察[4]。哺乳動物基因靶向修飾技術(shù)以前主要是利用DNA同源重組的原理將外源基因定點插入目的基因，使目的基因敲除或修飾，再利用胚胎干細胞囊胚顯微注射技術(shù)或體細胞核移植技術(shù)獲得基因打靶動物模型[5]。但對于尚未建立胚胎干細胞的動物來說，只能在體細胞上利用同源重組技術(shù)獲得目的基因修飾的陽性細胞，再經(jīng)過體細胞核移植技術(shù)獲得基因修飾動物[6]。但是對于家兔這種既沒有建立能夠生殖系遺傳的胚胎干細胞，克隆效率又極低的物種來說，獲得期望的基因打靶動物曾經(jīng)是極其困難的[7]。體細胞基因靶向修飾的低效率極大地限制了基因修飾大動物的應(yīng)用與發(fā)展，然而，鋅指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)以及成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列關(guān)聯(lián)核酸酶9(clustered regularly interspaced palindromic repeat/CRISPR associated RAN-guided endonuclease 9,CRISPR/Cas9)技術(shù)的出現(xiàn)極大地促進了基因靶向修飾動物的研究，為這些克隆效率低下又缺少全能性胚胎干細胞物種的基因修飾開辟了新渠道。

Tiki基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個基因，在Wnt信號通路中作為抑制因子而發(fā)揮作用，在爪蟾上研究結(jié)果表明，缺失TiKi基因會導(dǎo)致爪蟾頭部的缺失[8]。由于TiKi基因包含TiKi2和TiKi1兩種類型，因此建立一種同時敲除TiKi2和TiKi1兩種基因的兔模型，能更好地研究TiKi基因是否影響兔頭部的早期發(fā)育。但ZFN制備復(fù)雜、打靶效率低、成本高昂限制了其在基因修飾兔研究中的應(yīng)用。TALENs的打靶效率也尚不夠高，生出來的動物大多都是TiKi1或TiKi2單等位基因敲除動物模型，難以直接獲得TiKi1或TiKi2雙等位基因敲除動物模型，要想獲得TiKi1和TiKi2同時雙等位基因敲除動物模型更加困難，不利于全面研究TiKi對哺乳動物頭部早期發(fā)育的影響。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷發(fā)展，單基因乃至多基因修飾兔將逐步發(fā)揮其優(yōu)勢，為人類疾病、藥物開發(fā)、發(fā)育機制等研究提供更加真實、可靠、有效的動物模型。本研究致力于建立家兔CRISPR/Cas9高效的雙基因修飾技術(shù)體系，該技術(shù)平臺的成功構(gòu)建，將為日后獲得其他雙基因修飾兔模型以及對兔自身基因的深入研究提供技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分子實驗相關(guān)試劑無特殊說明均購自TaKaRa 公司，細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑無特殊說明均為 Gibco，化學(xué)試劑無特殊說明均購自Sigma 公司。兔子為新西蘭白兔，普通級，雌性6～8月齡，體重2～4.5 kg，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證為[SCXK 粵 2011—0015]。飼養(yǎng)條件：室溫18～25 ℃、濕度 40%～70%、換氣良好、12/12 h光照條件，自由飲水，每只每次添加80 g顆粒飼料，每天2次，并輔助飼喂胡蘿卜、青菜等青綠飼料。

1.2 試驗方法

1.2.1 TIKI基因靶位點的選擇及gRNA的制作

靶位點的選擇：基因靶位點的選擇遵循GGN(17-18)NGG(N為任意堿基)的序列要求，其中GGN(17-18)是與靶基因結(jié)合的位點， NGG是Cas9蛋白切割所必須的PAM區(qū)。由于本試驗所用的pT7-gRNA 體外轉(zhuǎn)錄載體是T7啟動子，故要求第二位堿基也為G；若是選擇別的啟動子則第二位堿基可任意修改。此外，可在正義鏈或反義鏈上選擇靶位點。

L-gRNA與退火靶位點的連接：L-gRNA與退火靶位點的連接用TaKaRa公司提供的 solutionⅠ，在 PCR 管中配置反應(yīng)液混勻后，16 ℃，30 min。然后轉(zhuǎn)化，涂氨芐抗性的平板，第二天后挑取4個菌落擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒送測序，測序引物用通用引物 M13-47，測序正確的gRNA質(zhì)粒備用。具體步驟如下： 10 μL 連接產(chǎn)物+50 μL Top 10感受態(tài)細胞→混勻后，冰上放置30 min→42 ℃，90 s→冰上冷卻約3 min→加入 500 μL 無抗性LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床中搖晃 30 min→取250μL涂氨芐平板，過夜培養(yǎng)→挑取單個菌落。

1.2.2 gRNA和Cas9的體外轉(zhuǎn)錄

靶位點gRNA的體外轉(zhuǎn)錄模板的制備：用引物 T7-s(5′-GAAATTAATACGACTCACTATA-3′)和tracr-rev(5′-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3′)，以測序正確的gRNA質(zhì)粒作為模板，用高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(TaKaRa)擴增用來體外轉(zhuǎn)錄gRNA的模板。

gRNA的體外轉(zhuǎn)錄：用 T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit( NEB)體外轉(zhuǎn)錄gRNA。用該試劑盒自帶的Licl回收純化體外轉(zhuǎn)錄的gRNA，-80 ℃保存作受精卵注射用。

Cas9質(zhì)粒的線性化及體外轉(zhuǎn)錄：Cas9質(zhì)粒(MLM3613)在體外轉(zhuǎn)錄成mRNA之前先用PmeⅠ內(nèi)切酶(NEB)線性化。跑膠檢測Cas9質(zhì)粒是否切割完全，切割完全則直接回收線性化的Cas9，測定濃度后用作體外轉(zhuǎn)錄mRNA模板，用mMESSAGE mMACHINE?T7 Kit 體外轉(zhuǎn)錄帶帽的cas9 RNA，按照回收gRNA的方法回收帶帽的體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 RNA,用E.coliPoly(A) Polymerase(NEB)對回收的帶帽的Cas9 RNA進行加polyA反應(yīng)，這樣得到的Cas9 mRNA比較穩(wěn)定而且翻譯效率也更高。按照回收gRNA的方法回收 Cas9 mRNA，-80 ℃保存作受精卵注射用。

1.2.3 兔受精卵的顯微注射

母兔的超排和受精卵的收集：對發(fā)情期的供體母兔進行肌肉注射100 IU的PMSG，注射后72～120 h和公兔合籠配種，取出卵巢和輸卵管置于預(yù)熱的1×PBS中，然后用沖卵液從輸卵管沖出受精卵，挑選原核期前后的受精卵置于胚胎培養(yǎng)液中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育待用。

受精卵的RNA顯微注射：把約30個原核期的受精卵放置在60 mm培養(yǎng)板的一個操作液滴中，用移液槍將約1 μL的Cas9 mRN和gRNA 混合液沿注射針玻璃管內(nèi)壁注射到底部，調(diào)節(jié)注射針和固定針的位置，使用固定管吸住受精卵，將注射針刺入受精卵的胞質(zhì)內(nèi)，注入約5～10 pl RNA，固定針去吸附下一個受精卵，進行下一個受精卵的注射。

1.2.4 胚胎移植

將受體兔側(cè)臥固定在手術(shù)臺上，選擇距脊柱約5 cm，距肋弓后緣3 cm的視野，依次剪開皮膚，肌肉層，腹膜后，小心牽扯出輸卵管和卵巢，觀察卵巢是否有排卵點，同時，讓助手把胚胎裝到胚胎移植管中，然后用鑷子輕輕捏住輸卵管傘部，助手用鑷子撥動輸卵管使其拉直方便操作者將移植管從輸卵管傘口插入，深入至3 cm左右(壺腹部)后再后退一點，輕輕推入除1 cm長的操作液外的所有液體到輸卵管中，撤出移植管。

1.2.5 分娩與護理

胚胎移植15 d左右，可以通過觸摸法來判斷受體母兔是否懷孕。適當(dāng)增加受孕兔的飼料和胡蘿卜的飼喂量，以保證胎兒的營養(yǎng)需求。仔兔前12天左右單獨放到保溫的產(chǎn)箱內(nèi)，不和母兔放一起，每天飼喂2次。

1.2.6 體外注射受精胚胎及出生仔兔基因打靶的鑒定

注射后4 d左右，受精卵發(fā)育至囊胚階段，取出發(fā)育至囊胚階段的胚胎用1×PBS 清洗3遍，然后每個囊胚放入到一個PCR管中。每個囊胚用5～7 μL的NP40裂解液在PCR儀中進行裂解，裂解好的囊胚-20 ℃保存?zhèn)溆?。然后進行PCR或者巢式PCR來擴增目的片段進行測序來鑒定各基因是否打靶。取3 μL PCR產(chǎn)物跑膠，確定大致濃度是否可以用來測序。測序結(jié)果顯示有兩套或兩套以上的峰圖的產(chǎn)物克隆到T載體上，以確定最終的基因突變情況。取新生仔兔的耳朵組織用天根血液/組織/細胞基因組提取試劑盒提取基因組，進行PCR及測序來鑒定是否打靶。

2 結(jié)果與分析

2.1 TiKi1和TiKi2同時敲除靶位點的設(shè)計

本試驗家兔的Tiki1和TiKi2基因的mRNA都是由賀熹教授實驗室提供的?？紤]到TiKi1和TiKi2的同源性比較高，可能相互之間存在補償效應(yīng)，于是設(shè)計一個gRNA同時靶向TiKi1和TiKi2。

靶位點：CCCCTACACCATCTCGGCCC。該位點位于TiKi1基因外顯子2上，位于TiKi2基因外顯子2上。

2.2 家兔受精卵TiKi1和TiKi2基因打靶的結(jié)果及體外發(fā)育情況

2.2.1 注射后胚胎的體外發(fā)育結(jié)果

以200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL gRNA的濃度注射處于原核期的家兔受精卵的胞質(zhì)內(nèi)，注射的胚胎在胚胎培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚期(4d左右)，來檢測注射的RNA對胚胎發(fā)育是否存在影響。當(dāng)注射200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL gRNA時，共注射12個原核期的受精卵，其中有9個發(fā)育到囊胚期，囊胚率為75%(表1)。

表1 Cas9 mRNA和gRNA注射后胚胎的體外發(fā)育結(jié)果

靶基因濃度 (gRNA/cas9)注射胚胎數(shù)囊胚率/%TiKi1和TiKi220/200(ng/μL)129/12(75)

2.2.2 注射后家兔受精卵Tiki1和Tiki2基因打靶效率檢測

以200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL gRNA的濃度注射處于原核期的家兔受精卵的胞質(zhì)內(nèi)，注射的胚胎在胚胎培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚期(4 d左右)，來檢測注射的RNA是否具有對家兔相應(yīng)的靶位點進行切割的作用，并統(tǒng)計其打靶效率。當(dāng)注射200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL Tiki1+Tiki2gRNA時，注射12個原核期的受精卵，囊賠率為75%。對這些發(fā)育正常的囊胚進行PCR擴增測序基因打靶效率檢測，若測序結(jié)果只有一套峰圖(圖1A)，則直接與WT序列進行比對；若測序結(jié)果在靶位點附近存在兩套及兩套以上的峰圖(圖1B)，則回收該PCR產(chǎn)物并與T載體連接，然后挑選單克隆進行測序。在這9個囊胚中，經(jīng)過PCR擴增測序發(fā)現(xiàn)9個囊胚(100%)都發(fā)生了Tiki1基因打靶，其中在5個(56%)囊胚中檢測到WT的序列，定義為Tiki1單等位基因敲除；剩下的4個(44%)沒有檢測到WT的序列是屬于Tiki1雙等位基因敲除(見表2)；經(jīng)過PCR擴增測序發(fā)現(xiàn)9個囊胚(100%)都發(fā)生了Tiki2基因打靶，其中在6個(67%)囊胚中檢測到WT的序列，我們定義為Tiki2單等位基因敲除；剩下的3個(33%)沒有檢測到WT的序列是屬于Tiki2雙等位基因敲除(見表2)。

A. 測序峰圖在靶位點附近為一套峰圖；B. 測序峰圖在靶位點附近為2套或2套以上峰圖

圖1 測序峰圖表2 注射后家兔受精卵Tiki1和Tiki2基因修飾結(jié)果

靶基因濃度(gRNA/cas9)囊胚數(shù)基因修飾效率(%)雙等位基因敲除率(%)Tiki120/200(ng/μL)99/9(100)4/9(44)Tiki220/200(ng/μL)99/9(100)3/9(33)

2.3 TiKi1和TiKi2同時敲除打靶載體注射胚胎移植受體懷孕和仔兔出生結(jié)果

總共移植了51枚注射胚胎到6只受體母兔中，其中有1只受體母兔沒有檢測到懷孕，剩下的5只母兔先后產(chǎn)下共12只仔兔(表3)。經(jīng)測序鑒定其中有1只仔兔為TiKi1和TiKi2雙等位基因敲除模型。

表3 移植入受體兔的胚胎數(shù)量和仔兔出生結(jié)果

受體胚胎移植數(shù)新生仔兔數(shù)182293370492593692總數(shù)5112

2.4 TiKi1和TiKi2同時敲除打靶載體注射新生仔兔Tiki1基因突變結(jié)果

對測序結(jié)果在靶位點附近存在兩套及兩套以上峰圖的仔兔的PCR 產(chǎn)物，回收并與T載體連接，然后挑選單克隆進行測序，再與WT序列比對，突變范圍從插入136 bp到缺失217 bp不等(圖2)。

2.5 TiKi1和TiKi2同時敲除打靶載體注射新生仔兔Tiki2基因突變結(jié)果

對測序結(jié)果在靶位點附近存在兩套及兩套以上峰圖的仔兔的PCR 產(chǎn)物，回收并與T載體連接，然后挑選單克隆進行測序，再與WT序列比對，突變范圍從插入21 bp到缺失209 bp不等(圖3)。

注：短橫線表示的是缺失的堿基，下劃線表示的是靶位點

注：短橫線表示的是缺失的堿基，下劃線表示的是靶位點

圖3 新生仔兔Tiki2基因突變結(jié)果

3 討論

Wnt信號決定細胞的極性、命運、前體細胞的增殖、體軸的建立，以及細胞的不對稱分裂等[8]。Wnt通路的失調(diào)引發(fā)多種癌癥，體軸發(fā)育不全等[9]。Tiki基因作為Wnt信號通路中的新的抑制因子進入人們的視野，蛙的Tiki1不同時期的全胚胎原位雜交的結(jié)果顯示，從原條期到神經(jīng)溝時期，Tiki1的表達區(qū)域位于胚胎體軸的前端；小鼠的Tiki2不同時期全胚胎原位雜交結(jié)果表明，Tiki2最先在神經(jīng)褶階段表達，晚些時候在心臟原基階段表達[10]。本實驗室前期對12-15 d，即原條期到神經(jīng)溝階段的豬胚胎進行了全胚胎原位雜交，試驗結(jié)果也顯示Tiki1基因在胚胎前端邊緣處表達，說明在豬的胚胎發(fā)育過程中Tiki1極有可能像在蛙上一樣，對頭部的誘導(dǎo)起著關(guān)鍵性的作用。在豬胚胎上進行的Tiki2基因的原位雜交結(jié)果和Tiki2在鼠胚胎上的原位雜交結(jié)果是一致的，均為沿著胚胎的中軸線縱向分布，且信號不強，貌似在胚胎中的表達豐度也不及Tiki1基因[11]。Tiki1和Tiki2是旁向性同源基因，其編碼的蛋白質(zhì)具有65%的同源性，且在抑制Wnt3a信號通路的過程中有著相似的功能?；赥iki基因的特殊性，即Tiki1基因在嚙齒類動物，如小鼠、大鼠體內(nèi)缺失，使用小鼠作為研究人類Tiki1基因缺失的疾病模型這一傳統(tǒng)途徑被阻斷，而兔由于心血管系統(tǒng)與人類非常相似，成為研究Tiki基因極佳的哺乳動物的選擇。

轉(zhuǎn)基因動物自1980年誕生后，經(jīng)過三十多年的迅速發(fā)展現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及生物學(xué)研究領(lǐng)域。目前轉(zhuǎn)基因動物存在的突出問題是外源基因插入位點以及拷貝數(shù)的不可控性，導(dǎo)致了外源基因在動物體內(nèi)表達不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)基因動物個體之間表型不均一，從而嚴重制約了轉(zhuǎn)基因動物的培育與應(yīng)用，只有對動物基因組進行定點的靶向修飾才有望從根本上解決基因隨機插入帶來的表達不可控等問題[12]。相比于小鼠和大鼠以及大動物家畜例如豬，家兔也是一種很好的選擇，既彌補了小鼠和大鼠與人類親緣關(guān)系遠的不足又彌補了大動物繁殖周期長，經(jīng)濟耗費高等的不足。家兔作為一種重要的實驗動物，建立一種高效、安全、快速及定點修飾的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將有助于推廣其在生物醫(yī)藥以及作為動物模型來研究人類疾病的應(yīng)用。但是到目前為止，在家兔上還沒有獲得獲得具有生殖系嵌合的ES細胞或者iPS細胞，所以不能像小鼠那樣通過對ES或者iPS細胞進行基因打靶結(jié)合囊胚注射獲得嵌合體的方法來獲得基因打靶兔[13]；同時因為家兔的體細胞核移植技術(shù)還不成熟，成功率比較低，所以也不能像家畜大動物那樣通過對體細胞進行基因打靶結(jié)合體細胞核移植技術(shù)來獲得基因打靶兔。近年來，隨著新興基因修飾工具的出現(xiàn)，基因定點修飾兔已成為可能。2011年有實驗室通過ZFN技術(shù)獲得IgM基因敲除兔[14]；2012年，本實驗室利用TALEN基因打靶技術(shù)結(jié)合受精卵顯微注射技術(shù)已成功高效獲得RAG1和RAG2基因敲除兔。

CRISPR/Cas9技術(shù)是根據(jù)Ⅱ類CRISPR系統(tǒng)開發(fā)而來，Ⅱ類CRISPR系統(tǒng)中有成熟的crRNA、tracrRNA和Cas9三種組分就可以行使切割DNA的功能?？茖W(xué)家們從細菌中提取純化出Cas9做的體外實驗證明了這一點[15]。Bolotin等[16]首次將含有人工設(shè)計識別序列(相當(dāng)于細菌中的特異性間隔)的crRNA和tracrRNA融合為sgRNA(singleguide RNA，也稱gRNA)在體外實驗中成功介導(dǎo)了Cas9切割目標序列。引起切割的關(guān)鍵位點是PAMs(Protospacer-adjacent Motifs)區(qū)[17]，PAMs是識別位點3′端相連的幾個堿基，識別這個位點可使Cas9從識別構(gòu)象轉(zhuǎn)化為切割構(gòu)象[18]。由此，科學(xué)家們開發(fā)出了一套用gRNA/Cas9在真核細胞中進行基因編輯的方法[19]，通過Cas9切割DNA造成DSBs后介導(dǎo)NHEJ或者HDR，最終引起DNA序列發(fā)生目標修飾。大量實驗證明，CRISPR/Cas9技術(shù)打靶效率遠遠高于ZFN和TALEN技術(shù)[20]。自CRISPR/Cas9技術(shù)推出起，該技術(shù)一直是生物研究領(lǐng)域的大熱門，各種真核細胞和生物體中幾乎都可以用CRISPR/Cas9技術(shù)進行基因編輯，這些編輯可用于各種目的[21]。因為Cas9是共用的，多個gRNA共同應(yīng)用可以進行多基因打靶，所以CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)勢之一是方便進行多基因的編輯。另外，CRISPR/Cas9技術(shù)可應(yīng)用于成體動物基因編輯研究，包括在成體動物中進行基因修復(fù)[22]和用Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠做活體內(nèi)的局部模型建立[23]，這些研究相對于ZFNs和TALENs而言是很大的突破。結(jié)合CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)在真核細胞、小鼠和大鼠上進行多基因打靶的成功案例，本研究試圖利用該技術(shù)來建立家兔的基因打靶技術(shù)平臺。

ZFNs和TALENs針對一個靶基因要設(shè)計兩條ZFN或TALEN，兩個靶基因則要設(shè)計4條ZFN或TALEN而且每條ZFN或TALEN的設(shè)計復(fù)雜，構(gòu)建步驟繁瑣耗時，CRISPR/Cas9系統(tǒng)最大的閃光點在于多基因打靶上的應(yīng)用。因為CRISPR/Cas9系統(tǒng)中用于切割作用的Cas9蛋白是通用的，也就是說當(dāng)需要對多個基因進行打靶時，只要導(dǎo)入多個基因的gRNA和一個Cas9質(zhì)粒即可，尤其是對于那些把RNA直接顯微注射到受精卵的方法獲得基因打靶動物來說更是大的優(yōu)勢，因為gRNA的濃度在5～20 ng/μL以及cas9的mRNA濃度在200 ng/μL左右就能發(fā)揮很好的基因打靶效果，所以進行多基因打靶的時候只需要多增加注射少量的RNA濃度即可，這樣對胚胎的毒性就會小很多。目前應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功進行多基因打靶的哺乳動物有小鼠[24]，大鼠[25]和猴子[26]。gRNA/Cas9系統(tǒng)除了可以定點敲除多個靶基因外，還可以通過HDR途徑對靶基因進行定點修飾或者通過單鏈寡核苷酸鏈(Singlestranded Oligo DNA，ssODNs)來引入兩個lox位點從而達到條件性基因打靶的目的[27]。

CRISPR/Cas9的出現(xiàn)極大的促進了基因定點修飾動物的研究，為家兔等克隆效率低下又缺少全能性胚胎干細胞物種的基因修飾開辟了新渠道。本研究所用gRNA的濃度為20 ng/μL,Cas9-mRNA為200 ng/μL，注射家兔受精胚胎的體外囊胚發(fā)育率在75%以上，說明這個濃度對胚胎的發(fā)育影響不大。對這些發(fā)育正常的囊胚進行基因打靶效率檢測，在這9個囊胚中，經(jīng)過PCR擴增測序發(fā)現(xiàn)9個囊胚(100%)都發(fā)生了Tiki1基因打靶，其中在5個(56%)囊胚中檢測到WT的序列，我們定義為單等位基因敲除；剩下的4個(44%)沒有檢測到WT的序列是屬于雙等位基因敲除，經(jīng)過PCR擴增測序發(fā)現(xiàn)9個囊胚(100%)都發(fā)生了Tiki2基因打靶，其中在6個(67%)囊胚中檢測到WT的序列，定義為單敲；剩下的3個(33%)沒有檢測到WT的序列是屬于雙敲。這個基因打靶效率比利用ZFN和TALEN技術(shù)(效率分別為50%和90%左右)在家兔上進行基因打靶的效率高。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新興發(fā)展起來的高效的基因打靶工具，已經(jīng)受到了廣大科學(xué)家們的青睞，它除了廣泛應(yīng)用在傳統(tǒng)的基因敲除和基因敲入的研究上，最近還通過引入兩個loxP位點來達到條件性基因打靶的目的，此外還有科學(xué)家利用CRISPR系統(tǒng)來達到RNAi的作用來調(diào)控基因的表達。相信通過科學(xué)家們的繼續(xù)深入研究，CRISPR/Cas9系統(tǒng)技術(shù)會越來越完善，其潛力和價值會得到更全面的發(fā)現(xiàn)，對基礎(chǔ)研究、生物技術(shù)和人類基因治療等諸多領(lǐng)域都會產(chǎn)生重大影響。

綜上所述，本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功實現(xiàn)了對家兔的雙基因打靶，建立了家兔雙基因打靶技術(shù)體系。高效的CRISPR/Cas9雙基因敲除兔系統(tǒng)的建立將為藥物研制開發(fā)、器官移植、干細胞、脂代謝以及心腦血管等研究提供各種有價值的動物模型。