歐愛群，趙必安，李江紅，王凱，彭文君

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所,北京 100093)

乳腺炎(mastitis)是由乳房組織感染引起的炎癥反應(yīng)，對奶牛影響最為嚴(yán)重，不僅危害奶牛健康，同時也會造成牛奶產(chǎn)量減少和品質(zhì)的下降[1]。國內(nèi)外治療奶牛乳腺炎的藥物主要是青霉素、鏈霉素等抗生素，但由于在實(shí)際生產(chǎn)過程中抗生素的大量使用導(dǎo)致了各種多重耐藥菌的持續(xù)出現(xiàn)，這也使得近年來奶牛乳腺炎的治愈率逐年降低[2]。此外，抗生素濫用也直接導(dǎo)致了牛奶中各類抗生素和毒素的殘留，嚴(yán)重影響牛奶的品質(zhì)，威脅人類健康。因此，迫切需要開發(fā)替代抗生素的方法用于預(yù)防和治療奶牛乳腺炎。研究結(jié)果表明，部分天然產(chǎn)物無毒、無害、無有害殘留，并對預(yù)防和治療奶牛乳腺炎有效，已經(jīng)逐步替代抗生素成為預(yù)防和治療奶牛乳腺炎的新技術(shù)和方法。在促進(jìn)動物生長、提高飼料利用率、增強(qiáng)動物疾病抵抗能力、減少抗生素使用和改善提高肉類產(chǎn)品品質(zhì)等方面可以發(fā)揮巨大作用[3]。蜂膠是蜜蜂采集植物芽孢或樹脂，混入其上腭腺、蠟腺的分泌物加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物，作為一種動植物雙源性純天然產(chǎn)物，具有多種生物活性及藥理作用。近年來國內(nèi)外對蜂膠在畜禽飼養(yǎng)及畜禽疾病防治上進(jìn)行了廣泛的研究，并取得可喜的成果[4]。本文針對利用蜂膠防治奶牛乳腺炎的相關(guān)研究及應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，以期為臨床上利用蜂膠有效防治奶牛乳腺炎提供參考。

1 奶牛乳腺炎

1.1 病因

奶牛乳腺炎是由于感染病原體(乳房內(nèi)感染，IMI)、損傷、過敏或腫瘤引起的乳腺實(shí)質(zhì)炎癥。乳腺炎根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎。柴生對甘肅、寧夏、武漢等地區(qū)的規(guī)模奶牛場進(jìn)行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，在3 000頭奶牛中，患有臨床型乳房炎、隱性乳房炎的發(fā)病率分別為13.1%和15.6%[5]。沈陽陽等[6]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，江蘇省大生源牧場奶牛臨床型乳腺炎發(fā)病率為14.3%，亞臨床型乳腺炎發(fā)病率為9.5%，隱性乳腺炎的發(fā)病率為15.6%。引起奶牛發(fā)生乳腺炎的病因較多，主要包括奶牛自身因素、營養(yǎng)因素、環(huán)境因素和病原微生物。其中病原微生物是導(dǎo)致奶牛乳腺炎易感多發(fā)的主要原因。病原微生物也可分為傳染性病原體和環(huán)境性病原體2類。傳染性病原體主要定植于乳腺，常在擠奶過程中傳播，主要包括金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactia)、牛棒狀桿菌(Corynebacteriumbovis)以及牛支原體(Mycoplasmabovis)等[7]；環(huán)境病原體需要一定外界條件才能生存，因此導(dǎo)致奶?；疾〈嬖谝欢ǖ碾S機(jī)性，主要包括乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷菌屬(Serratia)以及假單孢桿菌屬(Pseudomonas)[8]。乳腺炎看似為一般的奶牛疾病，但有著嚴(yán)重的危害性，由乳腺炎造成的經(jīng)濟(jì)損失主要包括獸醫(yī)治療費(fèi)用增加、牛奶產(chǎn)量以及品質(zhì)下降、生育率降低、甚至因感染而導(dǎo)致奶牛死亡。

1.2 臨床癥狀

根據(jù)奶牛乳腺臨床發(fā)生癥狀以及乳汁變化情況，可分為急性乳腺炎、慢性乳腺炎和隱性乳腺炎[9-10]。

急性乳腺炎：奶?；紖^(qū)乳房腫脹、發(fā)紅、疼痛明顯，乳汁呈淡黃色或黃白色，產(chǎn)乳量減少，此外健康乳房的產(chǎn)奶量也顯著下降。

慢性乳腺炎：如果急性乳腺炎不能完全治愈就會轉(zhuǎn)化成慢性乳腺炎，患病奶牛不會出現(xiàn)明顯的全身癥狀，其中乳汁呈灰白色，乳中有凝塊或絮狀物，乳房腫脹，疼痛不明顯，產(chǎn)乳量變化不大。

隱性乳腺炎：患隱性乳腺炎的奶牛不會表現(xiàn)出炎癥癥狀，但發(fā)病率極高，超過總發(fā)病率的50%以上，通常容易被飼養(yǎng)員或擠奶員忽略，進(jìn)而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失?；疾∧膛Ｈ橹胁≡?、體細(xì)胞數(shù)量急劇增加；經(jīng)pH試制檢驗(yàn)可得，乳中pH 值呈堿性,其中堿性越高,病情越嚴(yán)重。

1.3 發(fā)病過程

微生物感染引起乳腺炎包括三個階段:① 侵入階段，此階段主要是病原菌破壞皮膚屏障，通過乳頭管侵入; ② 感染階段，此階段主要是病原菌在乳池中存活并增殖、向乳腺其他部位擴(kuò)散的階段; ③炎癥階段，此階段主要是以乳體細(xì)胞數(shù)(SCC )升高為主要特征的炎癥反應(yīng)階段，在此階段乳腺炎的臨床癥狀逐漸顯現(xiàn)。細(xì)菌一旦侵入乳房，首先可能會被乳腺中的免疫細(xì)胞清除[11]。但如果未被徹底清除，細(xì)菌會在乳腺中繁殖并釋放毒素誘導(dǎo)白細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α，白細(xì)胞介素-8，白細(xì)胞介素-1，類二十烷酸，急性期蛋白(APPs)等[12]。這些炎癥介質(zhì)進(jìn)而會通過吸引循環(huán)免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)入感染部位，釋放氧化劑和蛋白酶來破壞細(xì)菌和清除受感染的乳腺上皮細(xì)胞。隨后，巨噬細(xì)胞吞噬剩余的多形核中性白細(xì)胞。除死亡的白細(xì)胞外，死亡和脫落的乳腺上皮細(xì)胞也會分泌到乳汁中，導(dǎo)致牛奶中SCC 急劇上升[13]。

1.4 治療措施

目前臨床上對于奶牛乳腺炎的治療還是以使用抗生素為主，相關(guān)經(jīng)典方法也是針對哺乳期乳腺炎臨床病例[14]。在臨床上使用的抗生素主要包括青霉素、四環(huán)素、氨芐西林等?？股刂委熑橄傺椎膬?yōu)點(diǎn)是治療目標(biāo)明確，易于使用，且適合現(xiàn)代乳品管理系統(tǒng)，治愈率高。但其明顯缺點(diǎn)是導(dǎo)致牛奶中可能存在的抗生素殘留，且容易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。因此，為避免使用抗生素造成的危害，一些補(bǔ)充/替代療法也被廣泛應(yīng)用于奶牛乳腺炎的防治。迄今為止，研究最多的抗生素替代品主要包括沸石、臭氧和中草藥。Morinaga等[15]在80頭患有乳腺炎的荷斯坦奶牛飲食中給藥200 g/頭/天沸石粉，發(fā)現(xiàn)與未給藥組相比，飲食沸石組奶牛乳中的SCC呈現(xiàn)出明顯下降的趨勢，表明飲食沸石對防治奶牛乳腺炎有一定的作用效果。Ioffe等[16]應(yīng)用臭氧輸注到受乳腺炎影響的乳區(qū)，其形式已被證明是有效、安全和經(jīng)濟(jì)的，有效避免了牛奶中藥物殘留的風(fēng)險。部分中草藥作為純天然物質(zhì)，具有抗菌、消炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力和增強(qiáng)機(jī)體對病原體的抵抗等多種優(yōu)點(diǎn)。葉東東等[17]研究了雙黃連注射液、地丁菊蓮注射液和魚腥草注射液對患乳腺炎泌乳牛的治療效果，結(jié)果表明，3種中草藥注射液對治療隱性乳房炎均有一定的療效，可以有效緩解牛乳腺炎性癥狀、降低牛乳中SCC數(shù)量，其中注射魚腥草注射液后即產(chǎn)生較好的療效且持續(xù)時間較長；并且對控制高SCC的隱性乳腺炎發(fā)展成臨床型乳腺炎有積極的預(yù)防作用。盡管中草藥及其有效成分對治療奶牛乳腺炎有一定的效果，但中草藥的成分復(fù)雜，治療機(jī)理還尚未明確，對奶牛及乳品的影響還有待于進(jìn)一步研究。

2 蜂膠及其抗炎作用

蜜蜂利用蜂膠清理蜂巢內(nèi)壁，并封住蜂巢上的洞，同時也用于覆蓋蜂巢內(nèi)入侵者的尸體，避免它們的腐爛而影響蜂巢環(huán)境。人類利用蜂膠的歷史非常久遠(yuǎn)。據(jù)記載，在古希臘，蜂膠被用作皮膚和頰部感染的消毒劑和防腐劑。蜂膠的活性成分十分復(fù)雜, 主要包括黃酮類、酚酸類、萜烯類等多種化合物。蜂膠的化學(xué)組成取決于蜂膠的植物來源、采集季節(jié)和采集蜜蜂種類。由于蜂膠具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種藥理活性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健、食品加工、化妝品、畜牧獸醫(yī)等多個領(lǐng)域。蜂膠抗炎活性十分突出，而炎癥也是多種疾病共生的土壤，近年來關(guān)于蜂膠抗炎作用的研究見表1。

表1 近5年蜂膠抗炎研究進(jìn)展情況

材料地理來源實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂寡鬃饔迷u價參考文獻(xiàn)AEP土耳其LPS誘導(dǎo)大鼠眼葡萄膜炎癥減少睫狀體NF-κB/p65免疫反應(yīng)活性,降低TNF-α和HIF-1α的表達(dá)水平[18]EEP中國LPS與IFN-γ誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥抑制炎性細(xì)胞因子的分泌,阻止NF-κB的激活[19]EEP巴西LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥降低促炎因子( IL-12, GM-CSF, IFN-?, IL-1β )的產(chǎn)生,抑制NF-κB和MAPK信號通路[20]EEP中國臺灣MSU誘導(dǎo)小鼠腹膜炎減輕腹膜中性粒細(xì)胞聚集,降低IL-1β,半胱天冬酶-1,IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白-1的水平[21]EEP馬來西亞鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠模型降低 IL-1β、TNF-α的表達(dá),緩解炎癥癥狀[22]EEP巴西LPS激活腹腔巨噬細(xì)胞模型降低NO水平、減少促炎細(xì)胞因子和基因的釋放和表達(dá)[23]EEP印度尼西亞炎癥大鼠牙髓組織顯著抑制炎癥因子IL-6的表達(dá)[24]EEP中國DSS誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎改善結(jié)腸炎癥狀,腸道微生物多樣性顯著增加[25]EEP日本LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型顯著降低亞硝酸鹽積累和COX-2活性[26]EEP土耳其LPS誘導(dǎo)大鼠急性肝和肺炎癥減少NO的釋放,SOD和CAT值升高,緩解炎癥癥狀[27]

注：AEP-蜂膠水提液；EEP-蜂膠乙醇提取液

3 蜂膠防治奶牛乳腺炎的作用

3.1 蜂膠抑制或殺滅奶牛乳腺炎病原

奶牛乳腺炎的病原微生物多達(dá)150余種，其中以細(xì)菌最為常見。在對乳腺炎的防治過程中，由金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染而引起的乳腺炎的治療最為困難，但蜂膠因其良好的抗菌活性被廣泛用于抗生素替代治療細(xì)菌感染導(dǎo)致的奶牛乳腺炎。蜂膠因提取方式、地理來源的不同，對奶牛乳腺炎分離菌的抗菌效果存在一定的差異(表2)。有研究發(fā)現(xiàn)蜂膠可能是用于臨床、亞臨床乳腺炎常規(guī)抗菌藥物很好的替代物，并且對鼠、山羊和奶牛等動物建立體內(nèi)、體外模型進(jìn)行了研究驗(yàn)證。Bacic等[28]利用蜂膠提取物對對常見乳腺炎病原菌的體外抗菌作用和荷斯坦奶牛的臨床試驗(yàn)。結(jié)果證明，1%的乳內(nèi)蜂膠制劑在體外和體內(nèi)均具有較高的抗菌和抗氧化活性。Wang等[29]以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為研究對象，利用多種乳腺炎病原菌誘導(dǎo)建立細(xì)胞炎性損傷模型，發(fā)現(xiàn)15 μg/mL的蜂膠對奶牛乳腺炎病原微生物誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用。

3.2 蜂膠降低奶牛乳腺炎癥反應(yīng)

奶牛乳房炎臨床表現(xiàn)癥狀主要是炎性反應(yīng)，主要包括乳房腫脹、發(fā)紅、發(fā)熱，伴有疼痛，牛奶顏色變化、凝塊外觀以及細(xì)胞數(shù)量增加。因此在治療乳房炎時應(yīng)著重注意消除炎癥。朱建英[38]采用復(fù)方蜂膠擦劑對臨床性奶牛乳腺炎進(jìn)行了治療研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳汁中的絮片、凝塊消失，患病乳區(qū)紅、腫、熱、痛癥狀消失，牛奶外觀正常，泌乳量回升；且亞急性奶牛乳腺炎的有效治愈率達(dá)90%。木村直美等[39]利用黃連、蜂膠和乳沒制成奶牛乳頭浸蘸劑，對患有隱性乳腺炎奶牛(63頭252個乳區(qū))進(jìn)行臨床試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳頭浸蘸劑對奶牛隱性乳腺炎有一定的防治作用。劉謝榮等[40]研究也發(fā)現(xiàn)利用蜂膠制成乳頭浸蘸劑對奶牛隱性乳腺炎有較好的防治效果。Bacic等[28]利用1%的乳內(nèi)蜂膠制劑對患有亞臨床乳腺炎的奶牛進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)3次使用后，乳汁中的體細(xì)胞數(shù)目降低、乳房內(nèi)感染率下降。結(jié)果表明1%的乳內(nèi)蜂膠制劑對預(yù)防和治療奶牛的亞臨床乳腺炎有一定的效果。Wang等[29]建立大腸桿菌脂多糖LPS和金黃色葡萄球菌脂磷壁酸LTA誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，發(fā)現(xiàn)在給藥15 μg/mL的蜂膠后，能有效降低促炎因子的表達(dá)，進(jìn)而減緩細(xì)胞炎癥反應(yīng)。 Bueno-Silva等[41]研究表明巴西紅蜂膠能有效減少中性粒細(xì)胞向炎癥部位的流入，主要是通過減少細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β，CXCL1/KC和CXCL2/MIP-2釋放起作用，并通過阻斷鈣內(nèi)流來減少中性粒細(xì)胞的趨化性，進(jìn)而發(fā)揮抗炎效果。

表2 蜂膠治療奶牛乳腺炎抗菌作用研究

材料蜂膠來源試驗(yàn)菌種抗菌效果參考文獻(xiàn)AEP巴西Staphyloccocus spp.30%濃度下表現(xiàn)出較好的抗菌效果[30]EEP巴西Staphyloccocus aureus1 mg/mL濃度下具有較好的抗菌效果[31]EEP羅馬尼亞Staphyloccocus aureus對敏感性S.aureus抗菌濃度為0.125%～2%,耐抗生素S.aureus為2%～4%[32]HAEP巴西Escherichia coli; Staphyloccocu spp.; Streptococcus spp.25 mg/mL濃度下對S.aureus、Streptococcus spp.有較強(qiáng)的抗菌作用[33]EEP克羅地亞Staphyloccocus aureus1%的乳內(nèi)蜂膠制劑表現(xiàn)出較高的抗菌活性[28]EEP巴西Staphyloccocus aureus; Escherichia coli濃度為0.75 mg/mL和1 mg/mL時,蜂膠對S.aureus生長減少到平均為零,但對E.coli的影響較弱[34]EEP哥倫比亞Staphylococcus spp.MIC:11.88 mg/mL～51.25 mg/mLMBC:1.87 mg/mL～30 mg/mL[35]MEPEAEP巴西Staphyloccocus aureus蜂膠在不同溶劑中的MBC分別為:甲醇0.375 mg/mL,乙酸乙酯3 mg/mL[36]EEP阿爾及利亞Staphyloccocus aureus;Pseudomonas aeruginosa蜂膠對S.aureus的MIC范圍為0.4%～1.6%,對P.aerugino-sa效果不明顯 [37]

注：AEP-蜂膠水提液；EEP-蜂膠乙醇提取液；MEP-蜂膠甲醇提取液；HAEP-蜂膠水醇提取液；EAEP-蜂膠乙酸乙酯提取液

3.3 蜂膠作為疫苗佐劑增強(qiáng)免疫功能

乳腺炎是奶牛常見的、多發(fā)的疾病之一，與病原性細(xì)菌、飼養(yǎng)環(huán)境等多因素密切相關(guān)，難以控制和徹底治愈。不同地區(qū)的奶牛乳腺炎的主要病原菌不盡相同，具有地區(qū)差異性，這使得對乳腺炎的防治不能完全照搬其它地區(qū)的預(yù)防和治療措施。針對這些難題，研究人員考慮通過開發(fā)針對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌的疫苗來預(yù)防奶牛乳房炎。但是這些疫苗存在效力不普遍以及沒有穩(wěn)定性等問題，沒有得到大范圍的應(yīng)用。羅金印等[42]采用4種不同佐劑的奶牛乳腺炎多聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行兔免疫攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明，蜂膠疫苗效果最好，鋁膠疫苗次之。并且不同佐劑多聯(lián)疫苗在接種泌乳牛后，與對照組相比，蜂膠疫苗組臨床性奶牛乳腺炎的發(fā)病率降低了65.6%。劉賀生[43]研制出預(yù)防奶牛乳腺炎蜂膠佐劑滅活疫苗，以0.1～0.2 mL/只免疫劑量注射小鼠，采用ELISA方法檢測免疫小鼠產(chǎn)生的抗體水平，后建立小鼠關(guān)節(jié)炎攻毒模型。結(jié)果表明，蜂膠佐劑滅活疫苗能夠?yàn)楣ザ驹囼?yàn)小鼠提供有效的保護(hù)。李美榮等[44]以0.4%的甲醛作為滅活劑，以蜂膠作為佐劑制備1∶1的比例等體積混合奶牛隱性乳房炎多價蜂膠滅活疫苗，并建立小鼠模型找出最佳免疫劑量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠攻毒試驗(yàn)之前注射奶牛隱性乳房炎多價疫苗的混菌液，滅活疫苗的保護(hù)率達(dá) 86.4%，表明制備的奶牛隱性乳房炎多價蜂膠滅活疫苗的混懸液具有良好的免疫保護(hù)效果。

3.4 蜂膠活性單體治療奶牛乳腺炎

近年來針對蜂膠中生物活性單體的研究呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，研究報道蜂膠中起主要抗炎作用的化合物主要為黃酮類化合物(槲皮素、山柰酚、高良姜素等)和酚酸類化合物(咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸等)，以及一些酚酸類的衍生物，如咖啡酸苯乙酯，阿替匹林C等。槲皮素是一種膳食類黃酮，對炎癥、血管生成、血管炎癥、和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)有一定的抑制作用。Burmańczuk等[45]研究了對患有臨床性乳腺炎的奶牛給藥兩種不同劑量的槲皮素，發(fā)現(xiàn)從給藥后的第1～8天，牛奶中體細(xì)胞數(shù)(SCC)呈現(xiàn)明顯下降趨勢，表明槲皮素對臨床性奶牛乳腺炎具有一定的治療效果。Liu等[46]試驗(yàn)表明，咖啡酸通過降低促炎因子的表達(dá)，減弱核轉(zhuǎn)錄因子κB的轉(zhuǎn)錄活性來起到對LPS誘導(dǎo)的牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用。

4 結(jié)語

盡管有多種預(yù)防措施和治療手段，乳腺炎仍然是造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失的嚴(yán)重疾病，這也是由多種致病因素、奶牛對感染的易感性、飼養(yǎng)環(huán)境條件以及奶牛自身免疫功能強(qiáng)弱等因素共同作用的結(jié)果。蜂膠作為一種天然無毒害的物質(zhì)，具有多種生物活性及藥理功能，在奶牛乳腺炎的防治過程中起到較好的效果，能夠有效的解決乳腺炎治療中抗生素殘留等問題，但蜂膠在治療奶牛乳腺炎的作用機(jī)制尚未明確。因此，在之后的研究工作中，應(yīng)深入研究蜂膠防治奶牛乳腺炎的作用機(jī)制，為利用蜂膠開發(fā)治療乳腺炎藥物提供新的思路。