王雪亮，肖艷群，王華梁

（上海市臨床檢驗中心分子生物學(xué)室，上海 200126）

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，分子檢測的應(yīng)用范疇不斷擴大，目前已被廣泛應(yīng)用于感染性疾病、遺傳性疾病和腫瘤等多個領(lǐng)域，是疾病預(yù)防、診斷、治療、監(jiān)測和預(yù)后評估的重要方法。目前，臨床常用的分子檢測技術(shù)主要分為3類：聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、分子雜交技術(shù)和基因測序技術(shù)。這3類技術(shù)存在操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴、人員需專業(yè)培訓(xùn)等局限，因此開發(fā)更為快速、價廉、操作簡單、靈敏度高、特異性強的新一代檢測技術(shù)，是分子檢測領(lǐng)域不斷追求的目標(biāo)[1-3]。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein，Cas）系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在生物進化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)[4]。目前，CRISPR技術(shù)作為基因組編輯利器，已被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域[5-6]。此外，在科學(xué)家發(fā)現(xiàn)部分Cas（如Cas13和Cas12）具有“附帶切割”活性，并將其用于快速分子檢測后，此領(lǐng)域的發(fā)展立即駛?cè)肟燔嚨?，并取得系列重要成果[2,7]。我們就CRISPR技術(shù)在分子檢測中的相關(guān)應(yīng)用展開綜述，以期為相關(guān)人員在此領(lǐng)域中進一步應(yīng)用該技術(shù)提供參考與幫助。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)簡介

CRISPR/Cas系統(tǒng)本質(zhì)上是一系列由RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，存在于約40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌中，是細(xì)菌抵御外源物質(zhì)（如噬菌體和質(zhì)粒）入侵的獲得性免疫系統(tǒng)[8]。1987年，ISHINO等[9]即在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)了串聯(lián)的間隔重復(fù)序列，但其功能未知。2002年，JANSEN等[10]將此重復(fù)序列正式命名為CRISPR序列。CRISPR序列主要由前導(dǎo)區(qū)、重復(fù)序列和間隔序列組成，其上游富含AT堿基對，長度為100～500 bp，即CRISPR序列前導(dǎo)區(qū)，被認(rèn)為是CRISPR序列轉(zhuǎn)錄的啟動子；重復(fù)序列長度為21～48 bp，含回文序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；間隔序列位于重復(fù)序列之間，長度為25～72 bp，其序列來源于病毒或噬菌體等外源DNA[11]。2007年，BARRANGOU等[8]首次發(fā)現(xiàn)并證實了嗜熱鏈球菌可利用CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體侵染。CRISPR系統(tǒng)行使功能主要包括3個階段：（1）適應(yīng)階段。當(dāng)外源核酸入侵細(xì)菌時，細(xì)菌啟動自身防御機制，將外源核酸整合到CRISPR回文重復(fù)序列中；（2）表達(dá)階段。CRISPR序列在RNA聚合酶幫助下進行轉(zhuǎn)錄，然后被剪切為成熟CRISPR RNA（crRNA）。成熟crRNA與反式作用crRNA相結(jié)合，形成向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA），發(fā)揮導(dǎo)向功能；（3）干擾階段。通過識別外源核酸序列中的前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM），sgRNA引導(dǎo)Cas（如Cas9、Cas12、Cas13等）與靶標(biāo)序列相互作用，引發(fā)對外源核酸的定向切割[12-13]。

根據(jù)Cas的組成及發(fā)揮功能的方式，CRISPR/Cas可分為二大類群：第1類以多個Cas組成的效應(yīng)復(fù)合體行使功能為特征，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；第2類則只需單個多結(jié)構(gòu)域的Cas，包括Ⅱ（Cas9）、Ⅴ（Cas12）和Ⅵ（Cas13）型[14-15]。第2類系統(tǒng)簡單、高效、操作方便，是目前主要的基因編輯系統(tǒng)，其中最具代表性的是Cas9。相比Cas9，Cas12a和Cas13a僅需crRNA即可實現(xiàn)特異性靶位點切割，這表明其系統(tǒng)更為簡潔，具有成為精度更高、安全性更好的新一代基因編輯工具的潛力[16-17]。

2 基于Cas9的分子檢測系統(tǒng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有精準(zhǔn)識別和切割特定DNA序列的能力，這意味著其可用于新型分子檢測方法的開發(fā)。2016年，PARDEE等[18]首次將CRISPR/Cas9技術(shù)引入分子檢測中，他們將等溫toehold生物傳感檢測到的寨卡病毒和凍干CRISPR/Cas9相混合，肉眼觀察即可對寨卡病毒美洲株和非洲株進行準(zhǔn)確分型（圖1）。ZHOU等[19]和HUANG等[20]利用CRISPR/Cas9的特異識別切割能力和等溫擴增技術(shù)相結(jié)合策略分別開發(fā)了CRISDA和CAS-EXPAR方法，可實現(xiàn)阿摩爾級的高靈敏度（amol/L，10-18mol/L）單堿基分辨率，并成功用于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型和單增李斯特菌檢測。有學(xué)者將CRISPR/Cas9和PCR技術(shù)相結(jié)合，建立了具有較高靈敏度和特異性的不同版本的ctPCR技術(shù)，有效用于人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）16型和18型的檢測和基因分型[21-23]。此外，LEE等[24]還利用Cas9/sgRNA的特異性切割結(jié)直腸癌患者血液中的野生型DNA，進而增加樣本中循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的豐度，可顯著提高ctDNA檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，更好地用于腫瘤的早期診斷和用藥監(jiān)測。然而，上述研究報道的基于Cas9的檢測方法主要還是作為輔助工具切割特定靶標(biāo)序列，并未被直接應(yīng)用于各種靶標(biāo)序列檢測，這使得其在實際臨床工作中的推廣受到一定程度的限制。

圖1 CRISPR/Cas9用于寨卡病毒毒株分型[18]

3 基于Cas13的分子檢測系統(tǒng)

與常用Cas9不同，Cas13a（舊稱C2c2）是一種RNA引導(dǎo)的RNA核酸內(nèi)切酶，屬于第2類CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Ⅵ型[25]。Cas13a能在crRNA的引導(dǎo)下特異性切割單鏈靶標(biāo)RNA，并在切割完成后仍保持活性，繼續(xù)切割其他非靶標(biāo)RNA，即具有“附帶切割”能力[26]?；诖颂匦?，EAST-SELETSKY等[27]開發(fā)出基于CRISPR/Cas13a檢測不同靶標(biāo)RNA的新方法，但其靈敏度較低，不具有實際臨床應(yīng)用價值。2017年，張峰開發(fā)了特異性高靈敏度酶解報告基因解鎖（specific high-sensitivity enzymatic reporter unLOCKing，SHERLOCK）檢測系統(tǒng)[28]。在該系統(tǒng)中，目標(biāo)模板首先經(jīng)重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）（用于檢測DNA靶標(biāo)）或逆轉(zhuǎn)錄-RPA（用于檢測RNA靶標(biāo)）為含有T7啟動子的DNA模板，后經(jīng)T7 RNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物可作為Cas13a切割的靶標(biāo)，在Cas13a對上述靶標(biāo)特異性切割后激活附帶切割功能，切割體系中單鏈RNA熒光報告探針能產(chǎn)生可被檢測的熒光信號（圖2）[28]。相比先前的研究，PRA方法的引入顯著提高了該方法的檢測靈敏度，已被成功用于寨卡病毒、登革熱病毒、致病細(xì)菌株及其耐藥基因、SNP分型和ctDNA等多種靶標(biāo)檢測。此外，該方法所用檢測試劑可凍干制備成濾紙片，用于即時檢測（point-of-care testing，POCT），成本極為低廉（0.61美元/次）[28]。在此基礎(chǔ)上，該團隊很快開發(fā)出第2代SHERLOCK（SHERLOCKv2）系統(tǒng)，在性能方面有了較大提升：（1）單管中可同時進行4通道檢測；（2）定量檢測限可低至2 amol/L；（3）結(jié)合Csm6蛋白可進一步將靈敏度提高3.5倍；（4）側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測，有效解決了上一代系統(tǒng)檢測通量低、不能定量、需特定熒光設(shè)備等問題[29]。此外，MYHRVOLD等[30]開發(fā)了改良版的SHERLOCKv2系統(tǒng)，命名為（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases，HUDSON）。此方法可不經(jīng)核酸提取純化，僅需對臨床樣本進行核酸酶滅活和加熱等快速處理，即可用于后續(xù)SHERLOCK2反應(yīng)，2 h不到便可肉眼觀測寨卡病毒和登革熱病毒的檢測及分型結(jié)果，其快速、價廉、準(zhǔn)確的特點非常適用于POCT等應(yīng)用場景[30]。

圖2 CRISPR/Cas13a分子檢測示意圖[28]

在上述重磅研究成果被報道后，多個課題組進一步拓展了Cas13a在不同分子檢測領(lǐng)域的實際應(yīng)用。WU等[31]、LIU等[32]和QIN等[33]分別報道了CRISPR/Cas13可用于EB病毒、H7N9禽流感病毒和埃博拉病毒等感染性病原體的準(zhǔn)確、快速檢測。此外，CRISPR/Cas13結(jié)合微流控芯片技術(shù)可實現(xiàn)樣本檢測的全自動化，具有重要的臨床應(yīng)用價值[33]。SHAN等[34]的研究結(jié)果證實采用基于CRISPR/Cas13a的方法可在30 min內(nèi)準(zhǔn)確定量樣本中的miRNA。

4 基于Cas12的分子檢測系統(tǒng)

Cas12a（舊稱Cpf1）屬于第2類CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Ⅴ型，由ZETSCHE等[35]在2015年進行特性鑒定，并成功用于人細(xì)胞基因組編輯。與Cas9類似，Cas12a是RNA引導(dǎo)的特異性DNA核酸內(nèi)切酶。已有研究結(jié)果表明，Cas12a具有類似Cas13a的附帶切割特性，但其非特異性切割的靶標(biāo)是單鏈DNA，并利用此特性開發(fā)了基于Cas12a的分子檢測平臺——DETECTR[36]。與SHERLOCK工作原理相似，為提高方法的檢測靈敏度，DETECTR利用RPA等溫擴增靶標(biāo)DNA，擴增產(chǎn)物與Cas12a/cRNA混合后啟動特定靶標(biāo)切割，并激活Cas12a的附帶切割活性，反應(yīng)體系中DNA熒光報告探針即可釋放熒光信號（圖3）[36]。DETECTR可在短短1 h內(nèi)準(zhǔn)確檢測臨床患者樣本中的HPV16和HPV18準(zhǔn)確檢測并分型。同一時期，LI等[37]也報道了與DETECTR類似的基于Cas12a的分子檢測方法，稱為HOLMES。HOLMES與DETECTR的主要不同之處是前者使用RPA對目的片段進行擴增，而未使用RPA方法。HOLMES可靈敏、特異、快速地實現(xiàn)SNP分型、DNA病毒和RNA病毒的檢測[37]。

圖3 CRISPR/Cas12a分子檢測示意圖[36]

此外，同樣屬于第2類CRISPR/Cas系統(tǒng)Ⅴ型的Cas12b（C2c1）也被證明具有附帶切割活性，LI等[38]利用其特性開發(fā)了基于Cas12b的分子檢測平臺HOLMESv2。與上一代HOLMES不同，HOLMESv2將環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)和Cas12b檢測相結(jié)合，二者相同的反應(yīng)溫度使檢測系統(tǒng)可有效整合，從而實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的一體化檢測，并被成功用于1 h內(nèi)快速檢測乙型腦炎病毒[38]。

5 基于Cas14的檢測系統(tǒng)

與Cas12a相同，新近鑒定的Cas14同屬第2類CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Ⅴ型，是RNA引導(dǎo)的特異性D N A 核酸內(nèi)切酶，同時具有針對單鏈DNA的附帶切割活性[39]。不同的是，Cas14a與靶標(biāo)結(jié)合的特異性比Cas12a更高，因而更適用于開發(fā)需達(dá)到單堿基分辨率的檢測方法。HARRINGTON等[39]建立了基于Cas14a的DETECTR檢測方法，并成功用于人類眼色HERC2基因SNP分型（圖4）。然而，sgRNA引導(dǎo)的Cas14a僅能靶向切割單鏈DNA，故在檢測時需先將擴增后的雙鏈DNA的1條鏈降解，以生成靶標(biāo)單鏈DNA，才能用于后續(xù)檢測，這在一定程度上增加了操作的復(fù)雜性。

圖4 CRISPR/Cas14a分子檢測示意圖[39]

6 小結(jié)與展望

CRISPR技術(shù)在短短幾年時間內(nèi)飛速發(fā)展，已逐漸演變?yōu)橐环N功能強大的多用途生物學(xué)工具。目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)在分子檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用才剛剛開始，但SHERLOCK和DETECTR等方法已展現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用價值與前景。作為新型“下一代分子診斷”技術(shù)，其具有快速、便攜、成本低廉、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，已被證明可用于病原體檢測、耐藥性分析、SNP分型、腫瘤基因突變檢測等多個方面令，特別適用于野外環(huán)境或基層醫(yī)院。但是，基于Cas13a的檢測需使用RNA熒光報告基團，其易受環(huán)境中RNA酶降解，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。相對而言，使用DNA熒光報告基團的基于Cas12的檢測方法則不易受此問題影響。此外，單獨使用Cas檢測的靈敏度偏低，現(xiàn)有CRISPR檢測方法均需擴增相應(yīng)目標(biāo)核酸以提高檢測靈敏度。為解決此問題，未來需挖掘更多新型Cas并建立更為簡單、有效的CRISPR/Cas檢測方法。目前報道的CRISPR檢測方法尚處于實驗室開發(fā)階段，在臨床工作中的實際作用如何尚需進一步評估，以確保其具有良好的臨床適用性。總之，隨著新的Cas的不斷發(fā)現(xiàn)及相關(guān)研究的持續(xù)深入，CRISPR/Cas系統(tǒng)勢必會對分子檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。