趙一　吳江　康愷　栗燁　李光輝　劉斌　郎貫存　安立龍　效梅

摘要：【目的】研究Activin A體外定向誘導大鼠胰腺導管干細胞分化形成胰島β細胞的作用，為移植體外新生β細胞治療寵物犬糖尿病打下基礎，同時為胰島細胞體外再生培養(yǎng)的優(yōu)化提供科學依據(jù)?！痉椒ā坎捎门囵B(yǎng)液RPMI-1640+10% FBS+10 ng/mL EGF+1%青霉素—鏈霉素擴增大鼠胰腺導管干細胞至單層，空白對照組加基礎培養(yǎng)液，誘導組在基礎培養(yǎng)液中分別添加5、10、15和20 ng/mL Activin A，連續(xù)培養(yǎng)28 d。誘導培養(yǎng)期間于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，誘導結束后通過雙硫腙（DTZ）染色、細胞免疫熒光染色、ELISA檢測及實時熒光定量PCR等方法對分化形成的類胰島細胞團功能和性狀進行驗證。【結果】大鼠胰腺導管干細胞經(jīng)Activin A誘導分化形成球形細胞，并聚集成團（類胰島），DTZ染色結果均呈陽性。誘導28 d后，20 ng/mL Activin A誘導組的類胰島細胞團數(shù)量及其Insulin基因表達水平均極顯著高于其他3個Activin A誘導組（P<0.01，下同），且類胰島細胞體積最大，類胰島細胞的Pdx1基因表達水平最高;無論在低葡萄糖（5 mmol/L）還是高葡萄糖（25 mmol/L）的刺激下，20 ng/mL Activin A誘導組類胰島細胞的Insulin和C-peptide分泌量均極顯著高于其他3個Activin A誘導組?！窘Y論】Activin A能體外誘導大鼠胰腺導管干細胞分化形成胰島β細胞，且以基礎培養(yǎng)液中添加20 ng/mL Activin A的誘導效果最佳。

關鍵詞： 大鼠;Activin A;胰腺導管干細胞;β細胞;胰島素（Insulin）

中圖分類號： S865.12? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）01-0209-08

Abstract： 【Objective】In this study，? the efficiency of Activin A to induce the differentiation of rat pancreatic ductal stem cells into islet β cells were investigated， which provided the basis for optimizing the in vitro development of β cells to advance the research related to cure of pet dogsdiabetes through transplantation of in vitro produced β cells. 【Method】For in vitro expansion， rat pancreatic ductal stem cells were cultured as a monolayer in RPMI-1640+10% FBS+10 ng/mL EGF+1% penicillin-streptomycin， the control group was cultured with basal medium， while， experimental groups were supplemented with 5， 10， 15 and 20 ng/mL Activin A respectively and stem cells were continuously cultured for 28 d. The morphological changes of cells were observed under inverted microscope. The islet-like cell cluster function and traits were corroborated by diphenylthiocarbazone（DTZ） staining，? cell immunofluorescence staining， ELISA test and qPCR. 【Result】The rat pancreatic duct stem cells were induced by Activin A for their differentiate into islet-like cell clusters. DTZ staining results were positive. After 28 d of induction， the number of islet like cells and their Insulin gene expression levels in the 20 ng/mL Activin A induced group were extremely higher than those in the other three Activin A induced groups （P<0.01， the same below）， the volume of islet-like cells was the largest， and the expression level of Pdx1 gene in islet-like cells was the highest. Under the stimulation of low glucose （5 mmol/L） or high glucose （25 mmol/L）， the Insulin and c-peptide secretion of islet cells in the 20 ng/mL Activin A induced group was extremely higher than that in the other three Activin A induced groups. 【Conclusion】This indicates that Activin A can induce the differentiation of rat pancreatic ductal stem cells into islet β-like cells， and adding 20 ng/ml Activin A into media has the optimal effects.

Key words： rat;Activin A; pancreatic ductal stem cells; β cell; Insulin

Foundation item： Guangdong Natural Science Foundation（10152408801000023）

0 引言

【研究意義】胰腺導管是分化形成β細胞的成體干細胞庫（Bonner-Weir et al.，2004;Veiseh and Langer，2015）。由胰腺導管分離出的干細胞具備多向分化潛能，體外定向誘導可分化形成功能性β細胞，再將類胰島細胞移植到糖尿病動物體內(nèi)即可有效維持正常的血糖水平（Butler et al.，2003;Ashcroft and Rorsman，2012;Kim et al.，2013）。目前，寵物犬糖尿病的發(fā)生越來越普遍，已成為寵物犬最常見的內(nèi)分泌疾病之一，對寵物業(yè)的健康發(fā)展造成嚴重威脅（東彥新和魏艷輝，2018）。因此，體外定向誘導胰腺導管干細胞分化形成β細胞并移植，對治療寵物犬糖尿病及其獸藥開發(fā)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Activin A是轉(zhuǎn)化生長因子β家族成員之一，能促進胰芽形成，引導胰腺內(nèi)分泌細胞和外分泌細胞分化，最終形成胰島（Tateishi et al.，2008;Maehr et al.，2009;Zhang et al.，2009;Moriya et al.，2010）。已有研究表明，將Activin A和β細胞素同時注入鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠新生兒體內(nèi)，可有效降低其高血糖癥（Li et al.，2004）。在體外的β細胞再生培養(yǎng)研究中，Activin A作為一種主要的誘導因子被廣泛應用。D'Amour等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，使用Activin A和低血清培養(yǎng)基能將胚胎干細胞誘導分化形成定形內(nèi)胚層、腸管內(nèi)胚層、胰腺內(nèi)胚層和內(nèi)分泌前體，最終分化形成胰島細胞，且證實胚胎干細胞誘導分化形成的胰島細胞與自然狀態(tài)下的β細胞功能相似，通過釋放C-肽而響應葡萄糖刺激。Park等（2007）報道稱，Activin A可增強大鼠胰腺導管細胞分化，將分化形成的內(nèi)分泌細胞移植入STZ誘導的糖尿病大鼠腎囊下，糖尿病大鼠血糖恢復正常，有效緩解其高血糖癥。Chen等（2009）在運用小分子物質(zhì)誘導人類胚胎干細胞向胰島細胞分化時發(fā)現(xiàn)，Activin A誘導干細胞分化形成內(nèi)分泌胰腺，并刺激胰腺祖細胞關鍵轉(zhuǎn)錄因子Pdx1表達，將誘導形成的胰島細胞移植入糖尿病模型動物中具有良好的降低血糖功效。Kim等（2013）研究發(fā)現(xiàn)Activin A、exendin-4和葡萄糖均能刺激人源胰腺導管細胞分化形成內(nèi)分泌細胞。Kuo等（2017）研究證實，Activin A與視黃酸聯(lián)用能成功誘導人源誘導多能干細胞向胰島細胞分化。Kunio等（2017）通過建立人源誘導多能干細胞分化形成胰島細胞方案，發(fā)現(xiàn)Activin A在前期是作為啟動人源誘導多能干細胞分化的活化因子。【本研究切入點】至今，有關Activin A誘導胰腺導管干細胞分化形成胰島的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】探討Activin A體外定向誘導大鼠胰腺導管干細胞分化形成胰島β細胞的作用，比較不同Activin A濃度的誘導效果，并對分化形成的類胰島功能和性狀進行驗證，為移植體外新生β細胞治療糖尿病打下基礎，同時為胰島細胞體外再生培養(yǎng)的優(yōu)化提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

大鼠胰腺導管干細胞系由廣東海洋大學濱海農(nóng)業(yè)學院動物繁殖原理與生物技術團隊分離培養(yǎng)獲得。部分細胞保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保存號C201457。RPMI-1640、無糖-DMEM、FBS（Fetal bovine serum）、EGF（Epidermal growth factor）、青霉素—鏈霉素及Activin A購自Gibco公司;DMSO（Dimethyl sulfoxide）、葡萄糖及雙硫腙（DTZ）購自Sigma公司;大鼠胰島素（Insulin）和C-肽（C-peptide）ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;Hoechst 33342和BSA（Bovine serum albumin）購自Solabio公司;Triton X-100、多聚甲醛、PBS及Hanks溶液購自生工生物工程（上海）股份有限公司;兔多克隆抗體Pdx1、小鼠單克隆抗體Insulin+Proinsulin、山羊抗兔IgG（H&L）及山羊抗小鼠IgG（H&L）購自Abcam公司;RNA提取試劑盒購自Magen公司;PrimeScriptTM RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green Premix Ex Taq II定量試劑盒購自TaKaRa公司。

1. 2 誘導方法

大鼠胰腺導管干細胞按1×104個/孔接種于12孔板中，采用培養(yǎng)液RPMI-1640+10% FBS+10 ng/mL EGF+1%青霉素—鏈霉素擴增干細胞至單層，誘導組更換誘導培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)28 d，每48 h換液一次。各組細胞培養(yǎng)液組成如表1所示。

1. 3 DTZ染色

參照Bonner-Weir等（2000）的研究方法進行DTZ染色。

1. 4 細胞免疫熒光染色檢測

誘導28 d后，通過間接細胞免疫熒光染色檢測β細胞標記物Insulin和Pdx1。細胞染色步驟：以PBS沖洗細胞，再用4%多聚甲醛固定5 min;預冷PBS洗滌3次（每次5 min）后用0.2% Triton X-100滲透30 min;預冷PBS洗滌2次（每次5 min），用1% BSA封閉30 min;加入一抗（1% BSA稀釋）在室溫下濕箱孵育1 h或4 ℃過夜;去除液體并用PBS洗滌3次（每次5 min），加入二抗（1% BSA稀釋）在室溫下避光孵育1 h;倒棄二抗并用PBS洗滌3次（每次5 min），使用Hoechst 33342進行染色。其中，一抗為兔多克隆抗體Pdx1或小鼠單克隆抗體Insulin+Prainsulin，二抗為山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG。倒置熒光顯微鏡觀察染色結果。

1. 5 ELISA檢測

誘導28 d后，采用ELISA試劑盒檢測葡萄糖刺激類胰島細胞后的Insulin和C-peptide分泌水平。用PBS洗滌3次，每組處理隨機選擇6孔，分成低葡萄糖刺激組（5 mmol/L）和高葡萄糖刺激組（25 mmol/L）。37 ℃孵育30 min后收集細胞培養(yǎng)液，2000 r/min離心15 min，收集上清液，分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?，或直接進行ELISA檢測。

1. 6 RNA提取及實時熒光定量PCR檢測

于誘導0和28 d時分別采用RaPure Total RNA Kit提取細胞總RNA，以攜帶gDNA Eraser的PrimeScriptTM RT試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;然后使用TB Green Premix Ex Taq II在Applied Biosystems 7300定量儀上檢測β細胞標記基因Insulin和Pdx1的表達情況，以β-actin為內(nèi)參基因。實時熒光定量PCR的引物如表2所示。

1. 7 細胞形態(tài)觀察

每隔3 d在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，并拍照記錄。

1. 8 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計整理，分別用單因素方差分析（One-way ANOVA）和 t 檢驗進行差異顯著性分析，再以GraphPad Prism 6.0制圖。

2 結果與分析

2. 1 大鼠胰腺導管干細胞分化形成類胰島

2. 1. 1 大鼠胰腺導管干細胞形態(tài)變化情況 大鼠胰腺導管干細胞形態(tài)為多邊形，呈鋪路石樣生長，經(jīng)Activin A誘導其分化細胞形態(tài)變化如圖1所示。誘導7 d時，各Activin A誘導組胰腺導管干細胞形態(tài)無明顯變化（圖1-B、圖1-G、圖1-L、圖1-Q和圖1-V），空白對照組則出現(xiàn)明顯的細胞富集現(xiàn)象;誘導14 d時，15和20 ng/mL Activin A誘導組的胰腺導管干細胞分化形成球形細胞，并聚集成團（圖1-R和圖1-W）;誘導21 d時，各Activin A誘導組胰腺導管干細胞均分化形成細胞團（圖1-I、圖1-N、圖1-S和圖1-X）;誘導28 d時，各Activin A誘導組均維持類胰島細胞團形態(tài)（圖1-J、圖1-O、圖1-T和圖1-Y），空白對照組胰腺導管干細胞仍未分化形成細胞團（圖1-E）。此外，類胰島細胞團的形成與Activin A濃度呈明顯的劑量依賴性關系。

2. 1. 2 類胰島細胞團計數(shù)結果 如圖2所示，20 ng/mL Activin A誘導組的類胰島細胞團數(shù)量極顯著高于其他3個Activin A誘導組（P<0.01，下同），空白對照組無類胰島細胞團。

2. 1. 3 DTZ染色結果 DTZ可與胰島β細胞中的鋅離子結合呈鐵紅色。由圖3可看出，各Activin A誘導組的DTZ染色結果均為陽性，而空白對照組的DTZ染色結果呈陰性。

2. 2 類胰島細胞共表達Insulin和Pdx1的情況

胰島β細胞能特異性分泌Insulin;Pdx1在胰島β細胞的分化形成過程中發(fā)揮重要作用，同時在β細胞內(nèi)表達（Liang et al.，2013）。誘導28 d后采用細胞免疫熒光染色檢測類胰島細胞，結果（圖4）顯示各Activin A誘導組類胰島細胞均共表達Insulin和Pdx1，但各組間的Insulin和Pdx1表達情況存在一定差異，具體表現(xiàn)為：20 ng/mL Activin A誘導組的類胰島細胞體積明顯大于其他3個Activin A誘導組，且該誘導組類胰島細胞中表達Insulin的細胞數(shù)多于其他3個Activin A誘導組。空白對照組無表達Insulin的類胰島細胞團，僅有少量表達Insulin的細胞（圖4-A），但有表達Pdx1的類胰島細胞團（圖4-B）。Insulin和Pdx1共表達提示Activi A誘導大鼠胰腺導管干細胞分化形成的類胰島細胞具備β細胞特性。

2. 3 類胰島細胞Insulin和Pdx1基因的表達水平

實時熒光定量PCR檢測結果（圖5）顯示，誘導28 d后各Activin A誘導組類胰島細胞的Insulin基因表達水平較誘導0 d時極顯著上調(diào)，空白對照組胰腺導管干細胞的Insulin基因表達水平較誘導0 d時顯著上調(diào)（P<0.05，下同）。20 ng/mL Activin A誘導組類胰島細胞的Insulin基因表達水平極顯著高于其他3個Activin A誘導組及空白對照組，5、10和15 ng/L Activin A誘導組類胰島細胞的Insulin基因表達水平高于空白對照組，但差異不顯著（P>0.05，下同）。誘導28 d后，空白對照組及5、10和20 ng/mL Activin A誘導組細胞的Pdx1基因表達水平較誘導0 d時極顯著上調(diào)，15 ng/mL Activin A誘導組呈顯著上調(diào)趨勢。與對照組細胞相比，10 ng/mL Activin A誘導組類胰島細胞的Pdx1基因表達水平顯著上調(diào)，20 ng/mL Activin A誘導組類胰島細胞的Pdx1基因表達水平極顯著上調(diào)，但二者間差異不顯著。

2. 4 葡萄糖刺激類胰島細胞分泌Insulin和C-pepitide的情況

經(jīng)Activin A誘導28 d后分別以5和25 mmol/L的葡萄糖刺激類胰島細胞，結果顯示，20 ng/mL Activin A誘導組類胰島細胞的Insulin（圖6-A和圖6-B）和C-peptide（圖6-C和圖6-D）的分泌量較對空白照組均極顯著提高;5、10和15 ng/mL Activin A誘導組與空白對照組相比，Insulin分泌量無明顯變化，C-peptide分泌量雖呈上升趨勢，但差異不顯著，表明類胰島細胞具有分泌Insulin和C-peptide的功能，即具備胰島β細胞特性。無論在低葡萄糖還是高葡萄糖刺激下，20 ng/mL Activin A誘導組類胰島細胞的Insulin和C-peptide分泌量均極顯著高于其他3個Activin A誘導組，即以20 ng/mL Activin A誘導胰腺導管干細胞分化形成的類胰島細胞含有更多Insulin分泌細胞。

3 討論

胰腺導管干細胞作為胰島β細胞祖細胞源，當胰腺受損時能發(fā)揮出恢復胰島功能的作用，因此在糖尿病治療方面具有巨大的應用潛力。Bonner-Weir等（2000，2004）研究認為，胰腺導管上皮是胰島和腺泡的祖細胞池，運用含TS、BSA、KGF和尼克酰胺的無血清DMEM/F12誘導液可使其誘導分化形成類胰島細胞團。效梅等（2008，2009）以含10 mmol/L煙酰胺、10 μg/L EGF和10% FBS的高糖DMEM為誘導液，成功誘導源于人流產(chǎn)胎兒胰腺組織的胰腺干細胞分化形成類胰島細胞，將類胰島細胞移植到糖尿病大鼠中能有效降低血糖水平，延長大鼠壽命。Skurikhin等（2014）從STZ處理的糖尿病小鼠胰腺中分離獲得胰腺干細胞，經(jīng)誘導可分化形成分泌Insulin的類胰島細胞。本課題組也從成年大鼠胰腺導管中成功分離獲得胰腺導管干細胞系，且研究證實該細胞系具備多向分化潛能及穩(wěn)定無限傳代的特點，共表達CK19、NeuroD2、Oct4、PCNA和Nanog蛋白，但不表達Insulin（王瑞陽等，2018;葉紹棠等，2018）。目前，體外定向誘導胰腺干細胞分化形成功能性胰島的方案非常繁瑣復雜，因此簡化誘導方案對優(yōu)化體外功能性胰島細胞的再生培養(yǎng)具有重要意義。

在體外誘導胚胎干細胞向功能性β細胞分化的過程中，添加Activin A后胚胎干細胞定向分化形成定型內(nèi)胚層，然后進一步分化形成內(nèi)分泌細胞祖細胞及類胰島細胞（Maehr et al.，2009;Zhang et al.，2009）。Kim等（2013）以Activin A處理人源胰腺導管細胞30 d后，發(fā)現(xiàn)Pdx1基因表達顯著上調(diào)，同時類胰島細胞表達β細胞特異性標記基因Insulin。在β細胞的形成過程中，Pdx1基因的激活引導祖細胞向β細胞分化并調(diào)節(jié)β細胞成熟，在維持β細胞功能和調(diào)節(jié)Insulin分泌方面也發(fā)揮著重要作用（Bemardo et al.，2008;Liang et al.，2013;Romer and Sussel，2015;Walczak et al.，2016）。DTZ是一種金屬絡合物，能與胰島β細胞中的Zn2+發(fā)生特異性結合，形成紅色或棕色絡合物，因此通過DTZ染色可快速鑒定胰島β細胞（Bonner-Weir et al.，2000）。在本研究中，Activin A誘導胰腺導管干細胞分化形成的類胰島細胞，DTZ染色呈陽性，經(jīng)葡萄糖刺激后分泌Insulin和C-peptide，且共表達β細胞特異性標記物Insulin和Pdx1。各Activin A誘導組間比較發(fā)現(xiàn)，20 ng/mL Activin A誘導組類胰島細胞的Insulin和C-peptide分泌量、Insulin和Pdx1基因表達量均極顯著高于其他3個Activin A誘導組。此外，在葡萄糖刺激下空白對照組的細胞也具有分泌Insulin和C-peptide的功能，可能與高濃度葡萄糖具有誘導胰腺導管干細胞向胰島細胞分化的作用有關（Hardikar et al.，2003;Kim et al.，2013）。本研究雖然全面驗證了Activin A體外定向誘導大鼠胰腺導管干細胞分化形成β細胞的能力，但其具體作用機制仍需進一步探究。

4 結論

Activin A能體外誘導大鼠胰腺導管干細胞分化形成胰島β細胞，且以基礎培養(yǎng)液中添加20 ng/mL Activin A的誘導效果最佳。

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（責任編輯 蘭宗寶）