蘇文英　楊和川　譚一羅　周振玲　秦裕營　李曉

摘要：【目的】優(yōu)化玉木耳原生質(zhì)體制備條件，獲得高質(zhì)量、高產(chǎn)量的原生質(zhì)體，為后續(xù)玉木耳遺傳育種、優(yōu)良性狀篩選和品種改良提供良好的試驗材料?！痉椒ā恳杂衲径|(zhì)體產(chǎn)量為考察指標，結(jié)合單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化法，建立原生質(zhì)體制備回歸方程，探究玉木耳原生質(zhì)體的最佳制備條件。【結(jié)果】單因素試驗結(jié)果表明，玉木耳原生質(zhì)體制備的適宜條件為：酶解時間3 h、酶解液濃度2.0%、酶解溫度35 ℃。響應(yīng)面試驗結(jié)果表明，各因素對原生質(zhì)體制備影響程度的排序為：酶解溫度>酶解時間>酶解液濃度，酶解溫度與酶解時間的交互作用對原生質(zhì)體產(chǎn)量有極顯著影響（P<0.01），酶解時間與酶解液濃度的交互作用影響顯著（P<0.05）。響應(yīng)面試驗優(yōu)化后，獲得玉木耳原生質(zhì)體的制備條件為：酶解液濃度2.0%、酶解時間3.4 h、酶解溫度35 ℃，此條件下玉木耳原生質(zhì)體的平均產(chǎn)量為17.5×106 CFU/mL，與理論產(chǎn)量（17.77×106 CFU/mL）偏差小?！窘Y(jié)論】利用響應(yīng)面法可確立玉木耳原生質(zhì)體制備的最佳條件，獲得較理想的原生質(zhì)體產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞： 玉木耳;原生質(zhì)體;響應(yīng)面法;制備條件

中圖分類號： S646.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）01-0169-07

Abstract：【Objective】 The objective of this study was to optimize the preparation conditions of protoplasts of Auricularia cornea， and to obtain high quality and high yield protoplasts， which provided good experimental materials for the subsequent genetic breeding， excellent trait screening and variety improvement of A.cornea. 【Method】The protoplast yield of A.cornea was used as an index， and the regression equation of protoplast preparation was established by combi-ning single factor experiment and response surface optimization method to study the optimal preparation conditions of protoplasts of A.cornea. 【Result】The results of single factor test showed that the suitable enzymatic hydrolysis time of protoplast preparation was 3 h， the enzymatic hydrolysis liquid concentration was 2.0%， and the enzymatic hydrolysis temperature was 35 ℃. The results of response surface methodology showed that the degree of influence of various factors on protoplast preparation was： enzymatic hydrolysis temperature>enzymatic hydrolysis time>enzymatic hydrolysis liquid concentration， and the interaction between enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time had a highly significant effect on protoplast yield（P<0.01）， and the interaction betweenenzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis liquid concentration had significant influence（P<0.05）. The results of the response surface test were as follows： enzymatic hydrolysis liquid concentration 2.0%， enzymatic hydrolysis time 3.4 h， enzymatic hydrolysis temperature 35 ℃. Under these conditions， the average yield of protoplasts of A.cornea. was 17.5×106 CFU/mL， which was lower than the theoretical yield（17.77×106 CFU/mL）. 【Conclusion】 The response surface method is used to establish the optimal conditions for the preparationof protoplasts of A. cornea， and the optimal protoplast yield is obtained.

Key words： Auricularia cornea; protoplast; response surface method; preparation conditions

Foundation item： Jilin Natural Science Foundation（20170101053JC）; Lianyungang Special Financial Project（QNJJ1808）

0 引言

【研究意義】玉木耳（Auricularia cornea Ehrenb.）隸屬于木耳科（Auriculariales）木耳屬（Auricularia），是毛木耳的白色變種（李曉和張闊譚，2016），為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程中心選育出的適合吊袋小孔出耳的木耳新品種，其質(zhì)地脆嫩，美味可口，營養(yǎng)豐富（李玉和李曉，2016），且具有抗腫瘤等功效（曹玉春等，2017），經(jīng)濟價值較高，極具開發(fā)潛質(zhì)。目前關(guān)于玉木耳的研究主要集中在栽培、生理活性及成分分析方面（李曉和蘇文英，2017;Wang et al.，2018），針對其分子遺傳學(xué)的研究還鮮有報道。原生質(zhì)體是生理學(xué)、細胞學(xué)研究與遺傳育種的重要材料（譚偉等，2001;李守勉等，2007）。因此，對玉木耳原生質(zhì)體制備進行系統(tǒng)研究，可為后續(xù)玉木耳遺傳育種、優(yōu)良性狀篩選和品種改良提供良好的試驗材料。【前人研究進展】關(guān)于食用菌原生質(zhì)體的制備已有廣泛研究，許修宏等（2011）通過單因素試驗獲得黑木耳原生質(zhì)體制備的最佳條件：黑木耳菌絲液體培養(yǎng)8 d，以0.6 mol/L MgSO4·7H2O作滲透壓穩(wěn)定劑，加入2.0%溶壁酶在31 ℃下酶解4 h。孫露等（2012）對毛木耳原生質(zhì)體制備條件進行優(yōu)化，獲得最佳制備條件：菌齡5 d，溶壁酶濃度1.5%，酶解溫度30 ℃，酶解時間3 h，滲透壓穩(wěn)定劑為0.5 mol/L甘露醇。馬躍騰等（2015）采用正交試驗對秦巴蛹蟲草原生質(zhì)體制備條件進行優(yōu)化，在最佳制備條件[以0.6 mol/L NaCl為穩(wěn)滲劑，用混合酶（1%纖維素酶和0.5%蝸牛酶按1∶1的體積比混合）在（26±1）℃下對菌齡6 d的菌絲酶解3 h]下獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高。陸歡等（2018）通過響應(yīng)面法對花臉香蘑原生質(zhì)體制備條件進行優(yōu)化，獲得最佳制備條件：以0.6 mol/mL甘露醇作穩(wěn)滲劑，1%溶菌酶+1%蝸牛酶+1%纖維素酶為復(fù)合酶解液，酶解溫度30 ℃，60～70 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，酶解4 h。崔瑋潔等（2019）對玉木耳原生質(zhì)體的制備進行研究，通過單因素試驗得出以培養(yǎng)15 d的玉木耳菌絲為原材料，0.6 mol/L甘露醇作穩(wěn)滲劑，2%溶壁酶作酶解液，27 ℃酶解5 h時，可獲得最大量的玉木耳原生質(zhì)體?！颈狙芯壳腥朦c】原生質(zhì)體制備受菌齡、穩(wěn)滲劑濃度、酶解液濃度、酶解時間及酶解溫度等因素的交互影響，響應(yīng)面優(yōu)化法能對多個因素的組合效應(yīng)進行研究，從而獲得最優(yōu)試驗條件（Ragonese et al.，2002）。目前關(guān)于玉木耳原生質(zhì)體制備的報道很少，尚不清楚其原生質(zhì)體制備影響因子間的相互作用效應(yīng)。【擬解決的關(guān)鍵問題】在單因素試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面法進一步對玉木耳原生質(zhì)體制備條件進行優(yōu)化，以期獲得高質(zhì)量、高產(chǎn)量的原生質(zhì)體，為后續(xù)玉木耳遺傳育種、優(yōu)良性狀篩選和品種改良提供良好的試驗材料。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株和試劑 玉木耳菌株（菌種編號CCMJ2567）由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心提供。溶壁酶購自廣東省微生物菌種保藏中心，其余藥品均為國產(chǎn)分析純。

1. 1. 2 主要溶液及培養(yǎng)基 穩(wěn)滲劑（0.6 mol/L）：稱取甘露醇10.93 g，用蒸餾水定容至100 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。酶解液：于10 mL穩(wěn)滲劑（0.6 mol/L）中加入0.2 g溶壁酶，經(jīng)0.2 μm細菌過濾膜過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。玉木耳液體MYG培養(yǎng)基：麥芽糖10 g，葡萄糖5 g，酵母浸粉5 g，蒸餾水定容至1000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。原生質(zhì)體固體MYG再生培養(yǎng)基：麥芽糖10 g，葡萄糖5 g，酵母浸粉5 g，瓊脂10 g，甘露醇109.3 g，蒸餾水定容至1000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

1. 1. 3 主要儀器設(shè)備 凈化工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）、生物顯微鏡（XSP-BM-8C，上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司）、高速冷凍離心機[5804R，艾本德（德國）]、恒溫搖床（HZQ-2，金壇市城東超韻實驗儀器廠）、恒溫金屬?。℉X-20L，上海滬析實業(yè)有限公司）和滅菌鍋（YM75Z，上海三申醫(yī)療器械有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 原生質(zhì)體制備 將玉木耳菌絲塊接種至液體MYG培養(yǎng)基中，25 ℃靜置培養(yǎng)13 d，去除液體培養(yǎng)基，將收集得到的玉木耳菌絲用無菌蒸餾水清洗2次，0.6 mol/L穩(wěn)滲劑洗滌2次，再用已滅菌的濾紙吸取多余水分。稱取處理后的菌絲200～300 mg置于1.5 mL離心管中，加入3倍菌絲體積的酶解液，于30 ℃恒溫金屬浴中酶解3 h，得到玉木耳原生質(zhì)體粗提液。在超凈工作臺中，將原生質(zhì)體粗提液用已滅菌的脫脂棉過濾，濾液在室溫、3000 r/min下離心5 min，去除上清液，再用0.6 mol/L穩(wěn)滲劑洗滌2次，得到純化的原生質(zhì)體，將其立即懸浮于0.6 mol/L穩(wěn)滲劑中，顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，即為原生質(zhì)體產(chǎn)量。

1. 2. 2 玉木耳原生質(zhì)體再生 將新鮮制備的原生質(zhì)體懸液用0.6 mol/L穩(wěn)滲劑稀釋至1×104 CFU/mL，取100 μL涂布于固體MYG再生培養(yǎng)基上;同時用滅菌蒸餾水將原生質(zhì)體懸液稀釋至同等濃度，取100 μL涂布于固體MYG再生培養(yǎng)基上作為對照，將試驗組與對照組同時置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d后計算原生質(zhì)體再生率（韓業(yè)君等，2004）。再生率（%）=（再生菌落數(shù)-對照組菌落數(shù)）/原生質(zhì)體總數(shù)×100。

1. 2. 3 單因素試驗設(shè)計 分別考察酶解時間（1、2、3、4和5 h）、酶解液濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）和酶解溫度（20、25、30、35和40 ℃）3個因素對玉木耳原生質(zhì)體制備的影響，每個試驗3次重復(fù)。

1. 2. 4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken Design設(shè)計原理，選取酶解時間（A）、酶解液濃度（B）和酶解溫度（C）為考察因素，以原生質(zhì)體產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，進行3因素3水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計，以確定玉木耳原生質(zhì)體的最佳制備條件。因素及水平見表1。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2016對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用SPSS 17.0進行顯著性差異分析，Design-Expert 8.0.6對響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗結(jié)果

2. 1. 1 酶解時間對玉木耳原生質(zhì)體制備的影響

不同食用菌的細胞壁厚薄不同，所以酶解時間也不相同。由圖1可知，在酶解溫度30 ℃、酶解液濃度2.0%的條件下，隨著酶解時間的延長，玉木耳原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率不斷增加，當酶解時間為3 h時，原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率最高，分別為13.5×106 CFU/mL和6.71%，均顯著高于其他酶解時間的原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率（P<0.05，下同）;但酶解時間超過3 h后，原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率反而不斷降低。因此，選擇2～4 h為適宜酶解時間。

2. 1. 2 不同酶解液濃度對玉木耳原生質(zhì)體制備的影響 由圖2可知，在酶解溫度30 ℃、酶解時間3 h的條件下，隨著酶解液濃度的增加，玉木耳原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率不斷顯著增加，當酶解液濃度增至2.0%時，原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率均達最高值，分別為18.5×106 CFU/mL和9.17%;酶解液濃度大于2.0%后，原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率有所下降，但酶解液濃度2.5%與2.0%的原生質(zhì)體產(chǎn)量間無顯著差異（P>0.05）。因此，選擇1.5%～2.5%為適宜酶解液濃度。

2. 1. 3 不同酶解溫度對玉木耳原生質(zhì)體制備的影響 由圖3可知，在酶解液濃度2.0%、酶解時間3 h的條件下，隨著酶解溫度的升高，玉木耳原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率也隨之升高，當酶解溫度達35 ℃時，原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率最高，分別為18.0×106 CFU/mL和8.90%;但酶解溫度高于35 ℃時，原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率反而快速降低。因此，選擇25～35 ℃為適宜酶解溫度。

2. 2 玉木耳原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化結(jié)果

2. 2. 1 Box-Behnken設(shè)計試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert 8.0.6設(shè)計試驗方案，共設(shè)計17個試驗組，試驗結(jié)果見表2。對Box-Behnken試驗結(jié)果進行回歸方差分析（表3），得到回歸方程：Y=-211.85375+63.56500A+85.25250B+2.79725C-2.00000AB-0.52500AC+0.055000BC-7.45875A2-19.88500B2-0.013850C2。由表3可知，該模型P<0.01，具有極高的顯著性，失擬項P=0.2872>0.05，R2adj=0.9853，說明試驗無失擬因素存在。因此，該回歸方程擬合度較好，可信度較高，可用于預(yù)測玉木耳原生質(zhì)體制備的最佳條件。同時，一次項C、交互項AC及二次項A2和B2為極顯著（P<0.01，下同），說明酶解溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量有極顯著影響，酶解時間與酶解溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量有極顯著交互影響;一次項A、B和交互項AB為顯著，說明酶解時間和酶解液濃度，以及二者的交互作用對原生質(zhì)體產(chǎn)量均有顯著影響。

2. 2. 2 響應(yīng)面交互作用分析結(jié)果 由圖4可知，酶解時間（A）與酶解液濃度（B）的交互作用影響顯著，酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響大于酶解液濃度，表現(xiàn)為二者交互作用的曲面較陡，在二者交互作用的等高線中，沿A軸移動的等高線比沿B軸的等高線更密;酶解時間（A）與酶解溫度（C）的交互作用影響極顯著，酶解溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響較酶解時間大，表現(xiàn)為二者交互作用的曲面最陡，酶解溫度的等高線比酶解時間的等高線更密;而酶解液濃度（B）與酶解溫度（C）的交互作用較弱，酶解液溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響較酶解液濃度大，表現(xiàn)為酶解溫度與酶解液濃度交互作用的曲面較平緩，酶解溫度的等高線較酶解液濃度的等高線密。因此根據(jù)曲面陡峭程度及等高線密集程度，可以判斷出各因素對原生質(zhì)體制備影響程度的排序：酶解溫度>酶解時間>酶解液濃度，兩因素間交互作用對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響程度排序為：AC>AB>BC。這與表3的回歸模型方差分析結(jié)果一致。

2. 2. 3 驗證試驗結(jié)果 響應(yīng)面試驗優(yōu)化后玉木耳原生質(zhì)體的制備條件為：酶解液濃度2.02%、酶解時間3.4 h、酶解溫度35 ℃，預(yù)測產(chǎn)量為17.77×106 CFU/mL?？紤]試驗的可行性，將制備條件調(diào)整為：酶解液濃度2.0%、酶解時間3.4 h、酶解溫度35 ℃，在此條件下進行3次重復(fù)試驗，得到玉木耳原生質(zhì)體的平均產(chǎn)量為17.5×106 CFU/mL，與預(yù)測結(jié)果偏差小，試驗結(jié)果可靠，說明響應(yīng)面法對于玉木耳原生質(zhì)體條件進行優(yōu)化具有可行性。

3 討論

本研究結(jié)合單因素試驗和響應(yīng)面法對玉木耳原生質(zhì)體制備的關(guān)鍵因素（酶解液濃度、酶解時間和酶解溫度）進行優(yōu)化，結(jié)果表明，酶解溫度對玉木耳原生質(zhì)體產(chǎn)量影響最大。適宜的酶解溫度有助于溶壁酶發(fā)揮最佳的裂解作用，溫度過低會降低酶促反應(yīng)速率，高溫則會降低溶壁酶活性和損傷已游離的原生質(zhì)體（張麗霞和郭成金，2008），致使原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率降低。本研究采用響應(yīng)面法獲得各影響因子對原生質(zhì)體產(chǎn)量的回歸方程，再通過回歸方程計算出各參數(shù)，所獲得的最佳酶解溫度綜合考慮了各因素間的交互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玉木耳原生質(zhì)體制備的最佳酶解溫度為35 ℃，高于崔瑋潔等（2019）通過單因素試驗篩選獲得的酶解溫度27 ℃，可能與其單因素試驗設(shè)定的酶解時間（5 h）較長有關(guān)。酶解時間對玉木耳原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響次于酶解溫度，優(yōu)化后的酶解時間為3.4 h。王昱等（2013）研究認為，酶解時間過長，較早釋放出的原生質(zhì)體無細胞壁保護而破裂，其活性下降難于再生;酶解時間過短，菌絲體酶解不充分，原生質(zhì)體未被充分釋放，也會導(dǎo)致原生質(zhì)體產(chǎn)量較低。本研究結(jié)果表明，酶解液濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量也有顯著影響，在一定范圍內(nèi)，酶解液濃度越高，原生質(zhì)體產(chǎn)量越高，但濃度超過2.0%后，原生質(zhì)體產(chǎn)量下降，與崔瑋潔等（2019）的研究結(jié)果一致。這可能是由于高濃度酶液會對原生質(zhì)體的膜造成影響，使原生質(zhì)體脫壁太徹底，導(dǎo)致原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率降低（孫劍秋和周東坡，2002）。

本研究獲得的玉木耳原生質(zhì)體最佳制備條件為：酶解液濃度2.0%、酶解時間3.4 h、酶解溫度35 ℃，在此條件下獲得的玉木耳原生質(zhì)體產(chǎn)量為17.5×106 CFU/mL。本研究結(jié)果與崔瑋潔等（2019）通過單因素試驗得出的結(jié)果存在一定差異，一方面可能是因為崔瑋潔等（2019）只對單因素結(jié)果進行分析，沒有進一步研究各因素間的相互作用;另一方面可能是由于試驗中供試菌株菌齡的不同所致。菌齡也是影響原生質(zhì)體制備的重要因素。有研究表明，鮮菌絲的細胞壁更易被酶解液降解，且產(chǎn)量活力高，老化的菌絲體細胞壁較厚、次生物質(zhì)多，酶解相對不易，導(dǎo)致原生質(zhì)體產(chǎn)量下降（張文學(xué)等，2003）。本研究前期對玉木耳菌絲培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)15 d的玉木耳菌絲菌皮較厚，不利于后期破碎酶解，在此基礎(chǔ)上本研究選取菌齡13 d的玉木耳菌絲為試驗材料。

此外，在研究過程中發(fā)現(xiàn)玉木耳原生質(zhì)體再生率基本低于10.0%，可能與其菌絲生長速度較慢等自身遺傳特性有關(guān)。孫露等（2012）認為，食用菌原生質(zhì)體再生率與其生長速度呈正相關(guān)，生長速度慢的原生質(zhì)體再生率相對也低。穩(wěn)滲劑種類及再生培養(yǎng)基的成分也是影響原生質(zhì)體再生率的重要因素（韓增華等，2008;李楠和許修宏，2009;盧月霞等，2015;劉宏宇等，2018），但具體原因有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法對玉木耳原生質(zhì)體的制備條件進行優(yōu)化，建立了原生質(zhì)體產(chǎn)量的回歸模型，確定玉木耳原生質(zhì)體制備的最佳條件為：酶解液濃度2.0%、酶解時間3.4 h、酶解溫度35 ℃，即可獲得較理想的原生質(zhì)體產(chǎn)量，為進一步開展玉木耳原生質(zhì)體融合育種及遺傳研究提供技術(shù)支持。

參考文獻：

曹玉春，包海鷹，李曉，圖力古爾，李玉. 2017. 玉木耳提取物對H22荷瘤小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用研究[J]. 菌物學(xué)報，36（9）：1289-1298. [Cao Y C，Bao H Y，Li X，Bau T，Li Y. 2017. Anti-tumor activities of Auricularia cornea fruiting body extract in H22 bearing mice[J]. Mycosystema，36（9）：1289-1298.]

崔瑋潔，趙一橦，宋冰，代月婷，孫磊，付永平，李玉. 2019. 玉木耳原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化及再生菌株的變異檢測[J]. 分子植物育種，17（18）：6006-6012. [Cui W J，Zhao Y T，Song B，Dai Y T，Sun L，F(xiàn)u Y P，Li Y. 2019. Optimization of protoplast preparation of Auricularia cornea（Yumuer） and variation detection of regenerated strain[J]. Molecular Plant Breeding，17（18）：6006-6012.]

韓業(yè)君，曹暉，陳明杰，潘迎捷. 2004. 草菇原生質(zhì)體制備與再生及誘變效應(yīng)研究[J]. 食用菌學(xué)報，11（2）：1-6. [Han Y J，Cao H，Chen M J，Pan Y J. 2004. A study on the protoplast preparation，regeneration of Volvariella volvacea and the mutagenetic effect[J]. Acta Edulis Fungi，11（2）：1-6.]

韓增華，張丕奇，戴肖東，孔祥輝，馬慶芳，張介馳. 2008. 黑木耳原生質(zhì)體制備， 再生及單核體熒光鑒定[J]. 食用菌學(xué)報，15（3）：13-17. [Han Z H，Zhang P Q，Dai X D，Kong X H，Ma Q F，Zhang J C. 2008. Preparation，regeneration and identification of monokaryotic protoplasts of Auricularia auricula[J]. Acta Edulis Fungi，15（3）：13-17.]

李楠，許修宏. 2009. 黑木耳原生質(zhì)體制備及再生的研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，40（7）：34-37. [Li N，Xu X H. 2009. Protoplast preparation and regeneration of Auricularia auricula 29[J]. Journal of Northeast Agricultural University，40（7）：34-37.]

李守勉，李明，邢蕾，王俊玲，張殿生. 2007. 食用菌原生質(zhì)體技術(shù)應(yīng)用的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，35（25）：7770-7771. [Li S M，Li M，Xing L，Wang J L，Zhang D S. 2007. Application of protoplast technology of edible mushroom[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，35（25）：7770-7771.]

李曉，蘇文英. 2017. 玉木耳大棚掛袋出耳管理技術(shù)[J]. 食藥用菌，25（6）：385-387. [Li X，Su W Y. 2017. Shed han-ging bag management technology of Auricularia cornea[J]. Edible and Medicinal Mushrooms，25（6）：385-387.]

李曉，張闊譚. 2016. 木耳屬白色變異菌株的研究進展[J]. 食藥用菌，24（4）：230-233. [Li X，Zhang K T. 2016. A review of the advances of the research on a white variant strain in Genus Auricularia[J]. Edible and Medicinal Mushrooms，24（4）：230-233.]

李玉，李曉. 2016. 圖說玉木耳優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出社. [Li Y，Li X. 2016. Good quality and high yield cultivation of Auricularia cornea Ehrenb[M]. Beijing：China Agriculture Press.]

劉宏宇，郭鵬程，姚方杰. 2018. 榆耳菌絲原生質(zhì)體制備及再生的研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué)，43（2）：60-64. [Liu H Y，Guo P C，Yao F J. 2018. Optimization of preparation and regeneration conditions of Gloeostereum incarnatum mycelium protoplast[J]. Journal of Northeast Agricultural Sciences，43（2）：60-64.]

陸歡，王春暉，姜性堅，徐寧. 2018. 花臉香蘑原生質(zhì)體的制備及再生條件[J]. 菌物學(xué)報，37（6）：737-745. [Lu H，Wang C H，Jiang X J，Xu N. 2018. Protoplast preparation and regeneration of Lepista sordida[J]. Mycosystema，37（6）：737-745.]

盧月霞，鄭素月，柳煥章. 2015. 雞腿菇原生質(zhì)體制備與再生研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，43（7）：260-261. [Lu Y X，Zheng S Y，Liu H Z. 2015. Study on protoplast preparation and regeneration of Coprinus comatus[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，43（7）：260-261.]

馬躍騰，杜雙田，丁建，紀曉朋，鮑蕊，李珍. 2015. 秦巴蛹蟲草原生質(zhì)體的制備及再生條件研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），43（9）：196-202. [Ma Y T，Du S T，Ding J，Ji X P，Bao R，Li Z. 2015. Study on isolation and regeneration of Qinba Cordyceps militeris protoplasts[J]. Journal of Northwest A & F University（Natural Scien-ce Edition），43（9）：196-202.]

孫劍秋，周東坡. 2002. 微生物原生質(zhì)體技術(shù)[J]. 生物學(xué)通報，37（7）：9-11. [Sun J Q，Zhou D P. 2002. Microbial protoplast technology[J]. Bulletin of Biology，37（7）：9-11.]

孫露，姚方杰，方明. 2012. 毛木耳原生質(zhì)體制備與再生條件的研究[J]. 中國食用菌，31（3）：35-37. [Sun L，Yao F J，F(xiàn)ang M. 2012. Study on the protoplast preparation conditions of Auricularia polytricha[J]. Edible Fungi of China，31（3）：35-37.]

譚偉，鄭林用，彭衛(wèi)紅，肖在勤. 2001. 原生質(zhì)體融合技術(shù)在食用菌育種上的應(yīng)用研究進展[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，14（S1）：120-123. [Tan W，Zheng L Y，Peng W H，Xiao Z Q. 2001. Advances in research on application of protoplast fusion technique in mushroom breeding[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，14（S1）：120-123.]

王昱，王義，王康宇，葉鵬飛，孫春玉，張美萍. 2013. 靈芝原生質(zhì)體的制備與再生研究[J]. 北方園藝，（16）：184-188. [Wang Y，Wang Y，Wang K Y，Ye P F，Sun C Y，Zhang M P. 2013. Study on preparation and regeneration of the protoplasts from Ganoderma lucidum[J]. Northern Horticulture，（16）：184-188.]

許修宏，孟琦，劉華晶，李亮. 2011. 黑木耳菌絲原生質(zhì)體的制備﹑再生及單核鑒定研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，42（8）：96-100. [Xu X H，Meng Q，Liu H J，Li L. 2011. Study on protoplast isoulation and regeneration and monokaryotization of Auricularia auricula[J]. Journal of Northeast Agricultural University，42（8）：96-100.]

張麗霞，郭成金. 2008. 豬苓原生質(zhì)體制備與再生條件的研究[J]. 中國食用菌，27（5）：35-37. [Zhang L X，Guo C J. 2008. Study on protoplast preparation and regeneration of Grifola umbellata （Pers.） fries[J]. Edible Fungi of China，27（5）：35-37.]

張文學(xué)，劉春莉，蔣宏. 2003. 利用原生質(zhì)體融合和誘變育種技術(shù)選育高酶活菌株[J]. 四川大學(xué)學(xué)報（工程科學(xué)版），35（6）：66-70. [Zhang W X，Liu C L，Jiang H. 2003. Screening of higher enzyme activity strain with protoplast fusion and mutagenisis[J]. Journal of Sichuan University（Engineering Science Edition），35（6）：66-70.]

Ragonese R，Macka M，Hughes J，Petocz P. 2002. The use of the Box-Behnken experimental design in the optimisation and robustness testing of a capillary electrophoresis method for the analysis of ethambutol hydrochloride in a pharmaceutical formulation[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，27（6）：995-1007.

Wang X X，Lan Y F，Zhu Y F，Li S S，Liu M，Song X L，Zhao H J，Liu W R，Zhang J J，Wang S S，Jia L. 2018. Hepatoprotective effects of Auricularia cornea var. Li. polysaccharides against the alcoholic liver diseases through different metabolic pathways[J]. Scientific Reports，8（1）：7574. doi：10.1038/s41598-018-25830-w.

（責(zé)任編輯 羅 麗）