鄧琳梅　楊蕾　張俊星　字變仙　龔加壽　梅馨月　劉屹湘　朱書(shū)生　楊敏

摘要：【目的】明確云南省不同森林類型林下土壤是否適宜種植三七，篩選森林土壤中對(duì)三七主要病原菌具有拮抗作用的生防細(xì)菌資源，為三七林下種植及病害的生物防治提供理論依據(jù)。【方法】收集不同森林類型（雜木林、思茅松林、云南松林和桉樹(shù)林）土壤浸提液，比較過(guò)濾液（除去微生物）和未過(guò)濾液對(duì)三七種子出苗及生長(zhǎng)的影響;以連作土為對(duì)照，分析添加10%林下土壤對(duì)連作土中三七種子萌發(fā)和幼苗單株鮮重的影響。利用LB平板分離法分離森林土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌，通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)法篩選對(duì)三七病原菌具有拮抗活性的菌株，并選取對(duì)三七主要病原菌均具有拮抗活性的菌株進(jìn)行16S rDNA分類鑒定?！窘Y(jié)果】與過(guò)濾液相比，云南松林和思茅松林土壤浸提未過(guò)濾液可促進(jìn)三七種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng);雜木林土壤浸提未過(guò)濾液可促進(jìn)三七種子萌發(fā)，但對(duì)幼苗生長(zhǎng)有一定的抑制作用;桉樹(shù)林土壤浸提未過(guò)濾液對(duì)三七種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用。在連作土中添加10%松林土壤可有效緩解三七連作障礙;添加雜木林和桉樹(shù)林土壤對(duì)三七種子萌發(fā)有抑制作用，但可在一定程度上促進(jìn)三七幼苗生長(zhǎng)。從森林土壤中共分離獲得465株細(xì)菌，其中分離自松林土壤中的14株細(xì)菌對(duì)供試三七主要病原菌均具有較強(qiáng)的拮抗活性，包括6株芽孢桿菌屬、5株鏈霉菌屬、2株假單胞菌屬和1株腸桿菌屬，抑菌活性在58.02%～98.61%?！窘Y(jié)論】松樹(shù)林尤其是思茅松林土壤中存在大量的有益微生物，且這些有益微生物既能抑制根腐病菌，減輕三七連作障礙，又能促進(jìn)三七種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞： 三七;連作障礙;促生細(xì)菌;拮抗細(xì)菌;林下種植;云南省

中圖分類號(hào)： S435.672? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）01-0115-08

Abstract：【Objective】To explore whether different forest soils in Yunnan Province was suitable for planting Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen， and screen bacterial strains with growth-promoting and pathogen antagonistic effects on P. notoginseng， and provide theoretical basis for under forest planting of P. notoginseng and biological control of P. notoginseng disease. 【Method】The different forest soils extracts（miscellaneous wood forest，Simao pine forest，Yunnan pine forest and eucalyptus forest） were collected to compare the effects of forest soil filtrate（removed microbes） and non-filtrate on seed germination and seedling growth of P. notoginseng. The alleviation effects of 10% forest soil amendment on P. notoginseng seed germination and seedling fresh weight was analyzed using consecutively cultivated soil as control. The bacterial strains were isolated from soils by LB plate dilution method， the strains with inhibition activity against P. notoginseng pathogens were screened by confrontation culture method and the antagonistic isolates were identified by 16s rDNA. 【Result】The results showed that pine and miscellaneous forest water non-filtrated extracts could promote seed germination and seedling growth compared， the non filtrate of miscellaneous forest could promote the seed germination of P. notoginseng， but inhibited the growth of seedlings. The non filtrate of eucalyptus forest could inhibit the seed germination and seedling growth of P. notoginseng. 10% pine soil amendment obviously reduced the adverse effect of replant failure of P. notoginseng. The addition of miscellaneous forest soil and eucalyptus forest soil inhibited the germination of P. notoginseng seeds， but promoted the growth of P. notoginseng seedlings to a certain extent. A total of 465 bacterial strains were isola-ted from forest soils， and 14 strains isolated from pine soil showed strong antifungal activity against main pathogens of P. notoginseng， including six Bacillus isolates， five Streptomyces isolates， two Pseudomonas isolates and one Lelliottia isolate， the colony inhibition rate was 58.02%-98.61%. 【Conclusion】There may exist plenty of antagonistic and plant growth promoting bacteria resource in pine soil especially Simao pine soil. These beneficial microorganisms can not only inhibit the root rot pathogen and reduce the continuous cropping obstacle of P. notoginseng， but also promote the seed germination and seedling growth of P. notoginseng.

Key words： Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen; replant obstacle; plant-growth promoting bacteria; antagonistic bacteria; under forest planting; Yunnan

Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31772404）;National Key Research? Program（2017YFC1702502）;Yunnan Middle-aged and Young Personnel Project（2017HB024）

0 引言

【研究意義】三七[Panax notoginseng （Burk.） F.H. Chen]為五加科人參屬名貴中藥材，以干燥的根、根狀莖入藥，具有活血化瘀、消腫定痛等功效（陳紅艷等，2019）。近年來(lái)，由于連年大面積單一種植，三七生產(chǎn)出現(xiàn)連作障礙問(wèn)題，已嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，生產(chǎn)上主要通過(guò)化學(xué)農(nóng)藥和輪作倒茬來(lái)緩解三七連作障礙，但農(nóng)藥的大量使用不但未明顯減輕連作障礙，反而導(dǎo)致嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留問(wèn)題。輪作能較好地克服連作障礙，但三七輪作周期長(zhǎng)，一般種植后要經(jīng)過(guò)10年以上的輪作才能再次種植（簡(jiǎn)在友等，2009）。云南是三七的主產(chǎn)地和原產(chǎn)地，隨著市場(chǎng)對(duì)三七需求量的不斷增加和新墾地的減少，三七種植逐漸從道地產(chǎn)區(qū)向非道地產(chǎn)區(qū)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響三七藥材的道地性和原產(chǎn)地保護(hù)。云南省森林資源豐富，充分利用林地資源開(kāi)展林下三七生態(tài)種植，一方面可有效解決由于三七連作障礙帶來(lái)的無(wú)農(nóng)田地可種的困境，另一方面有利于三七品質(zhì)和藥效的提升，有利于實(shí)現(xiàn)三七產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】林下中藥材種植是將適宜林下生長(zhǎng)的藥用植物引種到自然環(huán)境下進(jìn)行野生化栽培，在充分利用林地資源的同時(shí)節(jié)約了大量農(nóng)田，且保證中藥材質(zhì)量，是一種科學(xué)合理的生態(tài)種植模式。目前人參林下種植技術(shù)已較成熟，許多學(xué)者從不同人參種植基地的種植條件、林下人參種植品種及林地選擇等方面入手，結(jié)合多年的實(shí)踐歸納總結(jié)出一套林下人參種植技術(shù)要點(diǎn)：適宜的生長(zhǎng)環(huán)境、優(yōu)良的品種和種植區(qū)的合理規(guī)劃（齊淑艷，2006;王婷婷等，2014;甄廣韻，2017）。三七的林下種植也有學(xué)者進(jìn)行了積極探索。姜成厚等（2012）在廣西梧州進(jìn)行三七林下種植試驗(yàn)，結(jié)果表明在梧州地區(qū)具有可行性，可以推廣種植。Gong等（2016）在湖南對(duì)不同林下三七栽培技術(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果表明杉木林、核桃等林下環(huán)境適宜種植三七。云南省現(xiàn)有林業(yè)用地面積高達(dá)2500萬(wàn)ha，而在思茅松林地、云南松林地、桉樹(shù)林地及雜木林地等主要林地類型中是否適宜種植三七目前尚未見(jiàn)報(bào)道。焦如珍等（1997）研究表明，土壤微生物、酶和養(yǎng)分是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，土壤微生物通過(guò)分解植物殘?bào)w而參與森林生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)，是土壤肥力的重要指標(biāo)。森林土壤微生物積極參與氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的地球化學(xué)循環(huán)，將有機(jī)質(zhì)分解為植物可吸收利用的形態(tài)，土壤微生物還產(chǎn)生大量生物活性物質(zhì)，直接關(guān)系到植物的生長(zhǎng)（王慧敏，2009）。吳慶梅等（2009）研究表明，森林類型會(huì)對(duì)林下土壤微生物的促生菌總量和比例造成一定影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】植物—土壤微生物間的相互作用很早就為人們所關(guān)注，土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)的主要活性組分，在土壤有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。土壤中細(xì)菌群落是土壤微生物中數(shù)量最多、分布最廣且多樣性最豐富的類群之一，目前森林土壤中是否存在對(duì)三七生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用且能抑制三七主要病害的細(xì)菌類群鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從云南省不同森林類型入手，評(píng)價(jià)不同森林類型土壤浸提液對(duì)三七生長(zhǎng)的影響及引入后對(duì)三七連作障礙的緩解作用，在此基礎(chǔ)上分離篩選對(duì)三七生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用且能抑制三七主要病害的微生物資源，以明確云南適宜種植三七的森林資源類型，并進(jìn)一步擴(kuò)大生防菌種資源庫(kù)，為三七病害生防菌劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（蛋白胨10.0 g、酵母浸粉5.0 g、氯化鈉10.0 g、瓊脂粉18.0 g，用去離子水定容至1000 mL）用于土壤細(xì)菌分離;NA培養(yǎng)基（牛肉浸粉3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖2.5 g、瓊脂粉18.0 g，用去離子水定容至1000 mL）用于土壤細(xì)菌保存;PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂粉18.0 g，用去離子水定容至1000 mL）用于病原真菌培養(yǎng)和拮抗菌篩選。

1. 1. 2 三七病原菌 惡疫霉菌（Phytophthora cactorum）D-1、人參鏈格孢菌（Alternaria panax）AP-2、毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）RS006和茄腐鐮刀菌（Fusarium solani）F3均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲(chóng)害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供并經(jīng)過(guò)致病性測(cè)定。

1. 1. 3 土樣 分別采自云南省西雙版納的雜木林土（ZM）;寧洱（S1）和瀾滄（S2，S3）的思茅松林土;建水（Y1）、文山（Y2，Y3）、迪慶（Y4）和麗江（Y5）的云南松林土;瀾滄的桉樹(shù)林土（An）;云南文山的三七連作土（L）。取土?xí)r以S形取樣法分別選取5個(gè)樣點(diǎn)，去除表面枯枝落葉等雜物后采集0～20 cm土壤樣品，混合均勻后低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 林下土壤有效養(yǎng)分采用常規(guī)農(nóng)化分析方法測(cè)定（鮑士旦，2000）。土壤有機(jī)質(zhì)含量采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化—容量法測(cè)定，堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，速效鉀含量采用乙酸銨浸提—火焰光度計(jì)法測(cè)定，有效磷采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測(cè)定，電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀（MP513型，上海三信儀表廠）測(cè)定，pH采用精密pH計(jì)（MP512型，上海三信儀表廠）測(cè)定。

1. 2. 2 森林土壤浸提液種植三七效果評(píng)價(jià) 取采自不同地點(diǎn)的林下土壤過(guò)0.84 mm（20目）篩后在體積500 mL的三角瓶中用無(wú)菌水（按林下土壤和無(wú)菌水體積比1∶10的比例）浸泡，將三角瓶置于搖床上，25 ℃、150 r/min振蕩24 h，經(jīng)定性濾紙（20 μm）過(guò)濾收集土壤浸提液。將收集到的土壤浸提液分為兩份，一份用0.22 μm濾膜過(guò)濾除去微生物（只含有養(yǎng)分），另一份不過(guò)濾處理（含有養(yǎng)分和微生物）。

為明確土壤微生物的作用，進(jìn)行林下土壤浸提液對(duì)三七種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)影響試驗(yàn)。選取飽滿的三七種子，用1.5% NaClO表面消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3次。石英砂經(jīng)160 ℃高溫干熱滅菌3 h，稱取100 g加入滅菌組培瓶（250 mL）內(nèi)備用。添加石英砂的組培瓶分為兩組，第一組加入未過(guò)濾的土壤浸提液;第二組加入過(guò)濾的土壤浸提液，每瓶加入浸提液20～25 mL ，在每個(gè)組培瓶中放入15粒三七種子，蓋好瓶蓋。每處理4次重復(fù)，按隨機(jī)區(qū)組擺放于晝夜溫度24 ℃/16 ℃、光照強(qiáng)度2000 lx、12 h光暗交替的生長(zhǎng)間中培養(yǎng)，60 d后調(diào)查出苗率，75 d后稱量植株整株鮮重。

1. 2. 3 連作土摻入森林土壤種植三七效果評(píng)價(jià)

為明確土壤微生物是否具有緩解三七連作障礙的作用，于三七連作土中混合拌入10%的供試森林土壤，在引入土壤微生物的同時(shí)避免改變土壤理化性質(zhì)（Weller et al.，2002）。將連作土和供試土樣按9∶1的比例混合均勻后裝入組培瓶中，加入20 mL無(wú)菌水，在每個(gè)組培瓶中放入15粒三七種子并置于1.2.2的生長(zhǎng)間進(jìn)行培養(yǎng)。每處理6次重復(fù)，以未加入供試森林土壤的三七連作土為對(duì)照，60 d后調(diào)查出苗率，75 d后稱量整株鮮重。

1. 2. 4 供試森林土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌分離 采用稀釋平板法對(duì)供試土壤中的細(xì)菌進(jìn)行分離。取10 g土樣加入100 mL無(wú)菌水，120 r/min振蕩30 min后靜置20 min，制成土壤菌懸液;用無(wú)菌水將土壤菌懸液稀釋至10-2、10-3和10-4，取100 ?L加入到LB培養(yǎng)基表面，涂布均勻后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng);待細(xì)菌菌落長(zhǎng)出，挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，得到純菌落后接種至NA培養(yǎng)基斜面上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 5 拮抗細(xì)菌篩選 采用平板對(duì)峙法篩選拮抗細(xì)菌分離物。將供試三七病原菌用打孔器制成直徑5 mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，在與其距離2.2 cm的位置對(duì)稱接種4株相同的細(xì)菌分離物，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每處理4次重復(fù)，以只接病原菌的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。待對(duì)照菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的2/3時(shí)，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，篩選對(duì)三七主要病原菌具有拮抗活性的細(xì)菌分離物，并采用十字交叉法測(cè)量菌落半徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率（%）=（對(duì)照菌落半徑-對(duì)峙培養(yǎng)菌落

半徑）/對(duì)照菌落半徑×100

1. 2. 6 拮抗細(xì)菌鑒定 對(duì)1.2.5中篩選獲得的對(duì)三七主要供試病原菌均具有拮抗活性的細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA鑒定。采用細(xì)菌DNA提取試劑盒（昆明碩陽(yáng)科技有限公司）提取拮抗細(xì)菌的基因組DNA。利用細(xì)菌16S rDNA通用引物（27F：5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3';1492R：5'-TACGGCTACCTTG TTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50.0 μL）：2×PCR Taq MasterMix 25.0 μL，DNA模板2.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，無(wú)菌去離子水19.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至昆明碩陽(yáng)科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用BLAST將獲得的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，選取相似度高的種屬確定分離菌株的分類地位。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

利用 Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同森林類型土壤有效養(yǎng)分總體特征

供試土壤樣品采自云南省海拔1310～3290 m的區(qū)域，其理化性質(zhì)見(jiàn)表1。由表1可知，供試土壤樣品電導(dǎo)率50.2～156.5 μS/cm、pH 5.1～6.8、有機(jī)質(zhì)含量8.9～107.5 g/kg、堿解氮含量109.4～497.9 mg/kg、有效磷含量3.7～63.3 mg/kg、速效鉀含量92.1～404.7 mg/kg。土壤電導(dǎo)率和pH反映土壤的鹽堿化程度，有機(jī)質(zhì)含量和土壤有效磷含量分別與土壤肥力和土壤中磷循環(huán)密切相關(guān)，土壤堿解氮含量和速效鉀含量反映土壤氮素和速效鉀的供應(yīng)狀況?？傮w而言，種植三七的連作土由于施肥的原因，其有效磷、速效鉀含量和電導(dǎo)率普遍高于森林土壤。

2. 2 森林土壤浸提液種植三七的效果評(píng)價(jià)

由表2可看出，以云南松林和雜木林土壤浸提未過(guò)濾液處理三七種子后，其萌發(fā)率均高于過(guò)濾處理;思茅松林處理中除S3處理外，其他處理均高于過(guò)濾處理;桉樹(shù)林處理中未過(guò)濾處理的種子萌發(fā)率略低于過(guò)濾處理。在單株鮮重方面，大多數(shù)區(qū)域的云南松林和思茅松土壤浸提未過(guò)濾液處理有利于增加三七幼苗的鮮重，而雜木林和桉樹(shù)林土壤浸提未過(guò)濾處理對(duì)三七幼苗生長(zhǎng)有一定的抑制作用。由此可看出，云南松林和思茅松林土壤中含有促進(jìn)三七種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的微生物，桉樹(shù)林土壤中的微生物可能不適宜三七生長(zhǎng)。雜木林由于采樣點(diǎn)較少，其土壤微生物是否適宜三七生長(zhǎng)還有待進(jìn)一步探究。

2. 3 連作土摻入森林土壤種植三七的效果評(píng)價(jià)

由表3可看出，在三七連作土中摻入10%森林土壤后，思茅松林的土壤微生物可明顯促進(jìn)連作土中三七種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，尤其是采自寧洱的森林土壤對(duì)三七種子萌發(fā)和單株鮮重具有顯著的促進(jìn)作用（P<0.05）。云南松林土壤對(duì)三七連作障礙具有一定的緩解作用，2個(gè)采樣點(diǎn)的土壤可促進(jìn)三七種子萌發(fā)，4個(gè)采樣點(diǎn)的土壤可明顯促進(jìn)三七幼苗生長(zhǎng)，只有采自麗江的云南松林土壤對(duì)三七連作障礙無(wú)緩解作用，甚至還抑制了三七的出苗和生長(zhǎng)。雜木林和桉樹(shù)林土壤的引入具有類似效果，即對(duì)三七種子萌發(fā)有抑制作用，但可在一定程度上促進(jìn)三七幼苗生長(zhǎng)。表明思茅松和部分區(qū)域的云南松林土壤中含有可緩解三七連作障礙的微生物。桉樹(shù)林和雜木林由于采樣點(diǎn)較少，其土壤微生物是否具有緩解三七連作障礙的效應(yīng)還有待進(jìn)一步探究。

2. 4 拮抗細(xì)菌的分離及其對(duì)三七主要病原菌的拮抗作用

利用平板分離法從供試森林土壤中共分離獲得465株細(xì)菌分離株。平板對(duì)峙結(jié)果（表4）顯示，52株分離株對(duì)三七病原菌具有拮抗作用，其中16株分離株分離自云南松林土壤，36株分離自思茅松林土壤，供試雜木林和桉樹(shù)林土壤中均未分離到拮抗菌株;分離獲得的52株拮抗菌株中，40株分離株對(duì)惡疫霉菌（D-1）具有明顯的拮抗活性，15株對(duì)茄腐鐮刀菌（F3）具有明顯的拮抗活性，19株對(duì)毀滅柱孢菌（RS006）具有明顯的拮抗活性，38株對(duì)人參鏈格孢菌（AP-2）具有拮抗活性。有14株分離菌株對(duì)供試三七病原菌均表現(xiàn)抑制活性，抑制率在58.02%～98.61%，其中有3株分離自云南松林土壤，11株分離自思茅松林土壤。各分離菌株的抑菌活性差異明顯，其中拮抗細(xì)菌S291和NE171對(duì)惡疫霉菌的抑制率最高，達(dá)98.61%;拮抗細(xì)菌9042對(duì)茄腐鐮刀菌的抑制率最高，為79.63%;拮抗細(xì)菌9042對(duì)毀滅柱孢菌的抑制率最高，為87.35%;拮抗細(xì)菌10111對(duì)人參鏈格孢菌的抑制率最高，為95.52%。

2. 5 拮抗細(xì)菌的分子鑒定結(jié)果

選取對(duì)三七主要病原菌均具有拮抗活性的14株分離菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定。將測(cè)序得到的14株拮抗菌株的16S rDNA序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果（表5）發(fā)現(xiàn)有6株為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、5株鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）、2株假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、1株腸桿菌屬（Lelliottia sp.）。云南松林土中分離鑒定的3株拮抗細(xì)菌分屬于暹羅芽孢桿菌（B. siamensis）、銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）和腸桿菌屬;思茅松林土壤中分離獲得11株拮抗細(xì)菌，包括1株玫瑰色鏈霉菌（Streptomyces roseus）、2株龜裂鏈霉菌（S. rimosus）、1株生靛鏈霉菌（S. indigoferus）、1株津島鏈霉菌（S. tsukiyonensis）、1株銅綠假單胞菌、1株蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）、3株枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和1株解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。由此可看出，思茅松林土壤中拮抗菌的比例更高，尤其是瀾滄地區(qū)的思茅松林土壤中含有的拮抗微生物資源更豐富，且以芽孢桿菌居多，占45.5%。

3 討論

本研究結(jié)果表明，森林土壤微生物群落可改良三七連作土，有效緩解三七連作障礙。對(duì)不同森林土壤微生物比較分析結(jié)果表明，與桉樹(shù)林及雜木林相比，松林土壤中含有更多適宜三七種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的有益微生物，因此，松樹(shù)林更適宜開(kāi)展林下三七種植。但林下環(huán)境復(fù)雜，森林中溫度和光照等自然條件對(duì)三七的影響還需進(jìn)一步研究，才能構(gòu)建完善的林下三七種植體系。

在植物根際界面上，植物、土壤和微生物是一個(gè)不可分割的整體，三者間具有很強(qiáng)的依賴性，所涉及的生物化學(xué)過(guò)程也非常復(fù)雜，然而，已有的大部分研究只針對(duì)單一對(duì)象進(jìn)行分析，所得到的結(jié)論不能全面反映該對(duì)象在整個(gè)根際過(guò)程中的作用和地位（艾超等，2015）。土傳病害的流行、連作障礙的出現(xiàn)，其主要原因在于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡而導(dǎo)致微生態(tài)環(huán)境惡化（龔明福等，2007），目前國(guó)際上通過(guò)構(gòu)建土壤微生物群落多樣性來(lái)防治植物病害和提高土壤抑病性的研究已成為植物病害生物防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)（段永照等，2010）。本研究供試的10份森林土壤理化性質(zhì)良好，土壤浸提液試驗(yàn)結(jié)果表明，含有益微生物的土壤浸提液有利于促進(jìn)三七種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng);未過(guò)濾處理下，添加思茅松林土壤浸提液后三七種子萌發(fā)率整體高于云南松林土壤浸提液處理，而云南松林土壤浸提液處理更有利于三七幼苗生長(zhǎng)，其鮮重整體高于思茅松林土壤浸提液處理。在石英砂中加入未過(guò)濾的桉樹(shù)林土壤浸提液后，三七單株鮮重及萌發(fā)率明顯低于其他森林土壤浸提液處理，可能是由于桉樹(shù)林土壤中的化感物質(zhì)會(huì)抑制三七生長(zhǎng)（郝建等，2011）。將林下土壤摻入三七連作土后，桉樹(shù)林和雜木林土壤對(duì)三七連作障礙無(wú)明顯緩解作用，添加思茅松林土壤后三七的萌發(fā)率及單株鮮重整體高于云南松林處理，可能是由于思茅松林土壤中拮抗微生物更豐富，因此引入到連作土后可有效抑制三七主要病原菌，從而促進(jìn)三七生長(zhǎng)，有效緩解三七連作障礙。

本研究的森林土壤拮抗細(xì)菌分離結(jié)果顯示，共獲得52株拮抗細(xì)菌，其中36株分離自思茅松林土，16株分離自云南松林土，桉樹(shù)林和雜木林中未分離到拮抗微生物，與引入森林土壤緩解三七連作障礙的結(jié)論一致。已有研究表明，通過(guò)添加0.1%～10.0%的林下土壤，可在不改變?cè)型寥览砘再|(zhì)的前提下將防病微生物轉(zhuǎn)移到本底土壤中（Mendes et al.，2011），因此本課題組嘗試將林下土壤中具有抑菌功能的不同微生物群落引入到三七連作土中，發(fā)現(xiàn)普遍可提高三七鮮重和萌發(fā)率，使連作土壤微生物區(qū)系得到改善（另文報(bào)道），為緩解三七連作障礙提供了新思路。

從松林土壤中分離獲得的拮抗微生物可有效抑制三七主要病原菌的生長(zhǎng)，抑制率在58.02%～98.61%，其主要種類為鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬，占總數(shù)的78.57%，分離到的拮抗細(xì)菌均來(lái)源于云南省不同區(qū)域的松林土壤中，為后續(xù)在松林下進(jìn)行三七種植提供了重要的依據(jù)。鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬是廣泛存在于自然界中重要的生物防治微生物資源，芽孢桿菌可通過(guò)產(chǎn)生低分子抗生素及蛋白或多肽類化合物對(duì)許多病原真菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性（趙新林和趙思峰，2011;陳哲等，2015;趙昱榕等，2019）;鏈霉菌主要通過(guò)拮抗作用、競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用和誘導(dǎo)抗性作用等抗病機(jī)制防治植物土傳病害，且鏈霉菌可通過(guò)多種方式聯(lián)合發(fā)揮生防作用（毛良居和毛赫，2017）。但拮抗細(xì)菌的田間防治效果評(píng)價(jià)及不同生防菌間的菌群組合增效技術(shù)還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

松樹(shù)林土壤浸提液可促進(jìn)三七種子萌發(fā)和生長(zhǎng)，在松林尤其是思茅松林土壤中分離到大量的有益微生物，包括芽孢桿菌、鏈霉菌、假單胞菌和腸桿菌，這些微生物既能抑制根腐病菌，減輕三七連作障礙，又能促進(jìn)三七種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）