崔楠楠，杜增豐，張 鑫，欒振東，席世川，李連福，王敏曉，王 冰，梁政委，劉 靖，連 超，閻 軍

1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，中國(guó)科學(xué)院海洋地質(zhì)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院海洋研究所深極端環(huán)境與生命過(guò)程研究中心，山東 青島 266071 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室, 海洋地質(zhì)過(guò)程與環(huán)境功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 4. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心，山東 青島 266071

引 言

貽貝科種類廣泛分布于全球多種水域，從近海到深海(冷泉、熱液等極端環(huán)境)。其介殼是一種典型的天然生物礦物，是軟體動(dòng)物的保護(hù)性功能組織，由占?xì)ぶ?5%的碳酸鈣晶體和占?xì)ぶ丶s5%的有機(jī)基質(zhì)組成[1]。

深海熱液和冷泉不同于一般的依賴光合作用獲取能量的生態(tài)系統(tǒng)，其環(huán)境具有低溫/高溫、高壓、高鹽、富含甲烷以及重金屬等特點(diǎn)[2-5]。熱液與冷泉在成因和環(huán)境特征上存在很大區(qū)別。熱液流體與周圍海水隨機(jī)混合，理化環(huán)境特征變化非常明顯，以噴口為中心，相隔幾厘米溫度可從400 ℃變到2 ℃[4]，pH值范圍1～10，重金屬種類多、濃度高，富含硫化物。而冷泉?jiǎng)t穩(wěn)定緩和，理化環(huán)境特征變化更溫和。深海極端環(huán)境中生長(zhǎng)的貽貝其鰓細(xì)胞中的化能自養(yǎng)細(xì)菌利用熱液冷泉系統(tǒng)中的硫化氫或甲烷等氣體組分合成有機(jī)物為宿主提供物質(zhì)和能量[4], 而近海貽貝科通過(guò)鰓濾水[6]獲取水體中浮游植物和懸浮顆粒等來(lái)獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

目前對(duì)貽貝貝殼研究主要集中于研究殼體形成機(jī)制及礦物微觀結(jié)構(gòu)[7-9]。Scurr等利用拉曼光譜技術(shù)對(duì)貽貝鋸齒狀區(qū)域進(jìn)行研究[7]，發(fā)現(xiàn)殼體的形成與貝殼力學(xué)性能有關(guān)。Nehrke[9]等利用共聚焦拉曼顯微和電子探針對(duì)南極雙殼貽貝進(jìn)行殼體切割分析，首次在海洋鈣化生物的鈣化結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)文石、方解石和球文石共存。關(guān)于環(huán)境適應(yīng)機(jī)制研究的報(bào)道極少，攝食方式及營(yíng)養(yǎng)來(lái)源的改變對(duì)貽貝介殼礦物組成產(chǎn)生的影響是未知的。同時(shí)熱液冷泉為研究化能生態(tài)系統(tǒng)中生命礦化提供了可以相互比較的兩種環(huán)境條件，兩種生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境差異對(duì)介殼礦物組成造成的影響也是未知的。共聚焦顯微拉曼光譜作為一種非破壞、非接觸及多組分同時(shí)測(cè)試的檢測(cè)技術(shù)，可以在顯微鏡下同時(shí)直接觀測(cè)貽貝貝殼的表觀特征與礦物組成內(nèi)在特征分布。本文希望通過(guò)對(duì)不同環(huán)境中貽貝介殼進(jìn)行共聚焦顯微激光拉曼光譜研究，了解其在特殊生存環(huán)境是否具有礦物組成上的特殊性，并為之后的極端生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境重建研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品采集及處理

深海貽貝樣品分別在2015年、2016年“科學(xué)”號(hào)熱液和冷泉調(diào)查航次中獲得，由“發(fā)現(xiàn)”號(hào)水下纜控機(jī)器人(ROV)采集，采樣點(diǎn)如圖1所示，其中熱液采樣點(diǎn)位于Desmos熱液區(qū)(151°51′54.4″, 3°41′29.88″)，水深1 940 m，壓力19.4 MPa，鹽度35.02‰，冷泉采樣點(diǎn)位于臺(tái)灣西南的南海冷泉區(qū)(119°17′08.147″, 22°06′55.371″)，水深1 120 m，壓力11.2 MPa，鹽度34.56‰，近海樣品采自大連近海海域，實(shí)驗(yàn)室樣品為2016年冷泉調(diào)查航次抓取，常溫常壓環(huán)境(鹽度32‰)養(yǎng)殖至2017年4月，其中Desmos熱液區(qū)與臺(tái)西南冷泉區(qū)貽貝生活環(huán)境參數(shù)如表1所示。貽貝樣品解剖去除軟組織，超純水沖洗兩次，自然風(fēng)干，部分樣品備用。部分樣品用于橫截面掃描，用工具鉗處理，得到樣品新鮮橫截面，使用2 000目水洗砂紙對(duì)橫截面進(jìn)行打磨處理，超純水沖洗兩次，自然風(fēng)干備用。

圖1 樣品采集信息及示意圖(a): 樣品采集地點(diǎn)(大連近海、臺(tái)西南冷泉區(qū)、Desmos熱液區(qū))及樣品照片；(b): 冷泉區(qū)ROV采樣照片；(c): 熱液區(qū)ROV采樣照片

(a): The sampling locations (Dalian-offshore，Cold seep in the Southwest of Taiwan, China，Desmos Hydrothermal Field) and photos of the sample; (b): The sampling of ROV in Cold seep; (c): The sampling of ROV in Hydrothermal Field

1.2 儀器與參數(shù)

實(shí)驗(yàn)所用共聚焦拉曼光譜儀(Alpha 300R+, WITec, Ulm, Germany)，Nd∶YAG激光器(λ=532 nm，功率為75 mW)作激發(fā)光源，光柵刻痕數(shù)1 200，通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)光柵塔拉曼光譜探測(cè)范圍覆蓋0～4 000 cm-1，分辨率1 cm-1，CCD制冷溫度-60 ℃[9-10]。顯微鏡物鏡為10×/0.25(Zeiss, EC, Epiplan-Neofluar, Germany)，激光光斑直徑25 μm，共聚焦顯微結(jié)構(gòu)通過(guò)兩根光纖(激發(fā)光纖與收集光纖內(nèi)徑均為100 μm)與激光器和光譜儀連接。拉曼系統(tǒng)在使用前先進(jìn)行了校準(zhǔn)，硅單質(zhì)用于激光波長(zhǎng)校準(zhǔn)，用其譜線進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 Desmos熱液與臺(tái)西南冷泉貽貝生境對(duì)比

Table1ContrastofenvironmentofmusselsinDesmoshydrothermalfieldandColdseepintheSouthwestofTaiwan,China

水深/m壓力/MPa鹽度/%CH4/ppm溫度/℃Desmos熱液1 94019.435.02-1.02臺(tái)西南冷泉112011.234.565.2863.99

圖2 共聚焦顯微拉曼系統(tǒng)

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用WITec Project plus軟件、GRAMS/AI?9.1軟件對(duì)采集的拉曼光譜進(jìn)行處理，基于相同的校準(zhǔn)和擬合方式對(duì)所有的拉曼光譜去除宇宙射線，進(jìn)行光滑處理及基線校準(zhǔn)。最后通過(guò)高斯函數(shù)對(duì)處理后的拉曼峰進(jìn)行擬合，獲得各個(gè)拉曼峰的頻移、半峰寬等重要參數(shù)。通過(guò)代表性拉曼峰獲得不同介殼層礦物組成的區(qū)別?；赼nalysis對(duì)特定的振動(dòng)模式進(jìn)行單變量成像，自動(dòng)尋找各層光譜進(jìn)行整合得強(qiáng)度分布圖。二維拉曼成像圖直觀顯示了貽貝介殼不同層之間礦物組成上的區(qū)別。

2 結(jié)果與討論

前人研究了一些碳酸鈣的基本振動(dòng)[11]模式，其中ν1特征峰1 085 cm-1為碳酸鈣最強(qiáng)峰，ν4特征峰705 cm-1及晶格振動(dòng)特征峰206 cm-1均為文石的拉曼特征峰，ν4特征峰711 cm-1及晶格振動(dòng)特征峰280 cm-1均為方解石的拉曼特征峰。

2.1 貽貝橫切面拉曼光譜分析

貽貝介殼根據(jù)形成的方式和組成可分為三層，由外到內(nèi)分別是：角質(zhì)層、棱柱層和珍珠層[12][圖3(c)]。對(duì)四種環(huán)境中采集的介殼橫截面進(jìn)行線掃、面掃，發(fā)現(xiàn)棱柱層拉曼光譜頻移在1 085，711及281 cm-1，表明棱柱層礦物組成為方解石，而珍珠層拉曼光譜頻移在1 085，706及206 cm-1，表明珍珠層礦物組成為文石，四種環(huán)境之間樣品橫截面各層礦物組成無(wú)區(qū)別。

圖3 深海貽貝介殼中橫截面各礦物分布特征圖

(a): 面掃區(qū)域圖；(b): 面掃區(qū)域?qū)?yīng)二維拉曼成像；(c): 線掃示意圖；(d) 線掃對(duì)應(yīng)拉曼強(qiáng)度趨勢(shì)圖(趨勢(shì)線交點(diǎn)對(duì)應(yīng)(c)中棱柱層與珍珠層界限)

Fig.3Thedistributionmapofmineralsinmusselshell’crosssectionofdeepsea

(a): Graph of area scan; (b): 2D-Raman mapping of area scan; (c): Graph of line scan; (d): Trend graph of Raman intensity of line scan

2.2 貽貝介殼珍珠層的拉曼光譜分析

實(shí)驗(yàn)對(duì)4種環(huán)境(Desmos熱液、臺(tái)西南冷泉、實(shí)驗(yàn)室、大連近海)中收集貽貝樣品介殼珍珠層進(jìn)行共聚焦顯微拉曼光譜分析(表2)，發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境中生存的貽貝珍珠層礦物組成存在差異。

表2 4種環(huán)境下貽貝珍珠層的礦物組成對(duì)比Table 2 Contrast of minerals of mussels’ nacre in four environment

注：N1 085 cm-1表示碳酸鈣最強(qiáng)峰1 085 cm-1出現(xiàn)次數(shù)；N206 cm-1和N706 cm-1分別表示文石特征峰206和706 cm-1出現(xiàn)次數(shù)；N281 cm-1和N711 cm-1分別表示方解石特征峰281和711 cm-1出現(xiàn)次數(shù)

圖4為4種環(huán)境中貽貝珍珠層的拉曼圖譜。從圖中可以看出，Desmos熱液區(qū)、臺(tái)西南冷泉區(qū)、實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖與大連近海環(huán)境中貽貝珍珠層主要成分均為碳酸鈣，但是拉曼圖譜存在明顯區(qū)別，根據(jù)各拉曼特征峰的歸屬分析，可以確定，四種環(huán)境下生存的貽貝珍珠層礦物主要由文石組成。

大連近海貽貝文石次級(jí)特征峰706和206 cm-1出現(xiàn)頻率低于其他環(huán)境，這可能是近海受人類活動(dòng)影響，殼體雜質(zhì)太多，礦物結(jié)晶程度較低，導(dǎo)致部分采譜點(diǎn)次級(jí)峰強(qiáng)度太弱。對(duì)比極端深海環(huán)境Desmos熱液區(qū)、臺(tái)西南冷泉區(qū)中貽貝珍珠層的拉曼圖譜(表2)，熱液區(qū)貽貝珍珠層的拉曼光譜中，所有采譜點(diǎn)均出現(xiàn)碳酸鈣主峰1 085 cm-1，表征文石的次級(jí)特征峰706和206 cm-1出現(xiàn)次數(shù)依次減少，表明熱液區(qū)貽貝珍珠層礦物組成為文石。臺(tái)西南冷泉區(qū)貽貝珍珠層的拉曼光譜中，所有采譜點(diǎn)均出現(xiàn)主峰1 085 cm-1，次級(jí)特征峰706和206 cm-1出現(xiàn)次數(shù)依次減少，與熱液區(qū)無(wú)差別，但同時(shí)部分采譜點(diǎn)出現(xiàn)了表征方解石的次級(jí)特征峰281 cm-1，表明冷泉區(qū)貽貝珍珠層礦物組成主要為文石，含有少量方解石。在動(dòng)力學(xué)方面，方解石層硬度明顯低于文石層硬度，熱液區(qū)貽貝采樣點(diǎn)水深1 940 m，壓力19.4 MPa，冷泉區(qū)采樣點(diǎn)水深1 120 m，壓力11.2 MPa，熱液與冷泉采樣點(diǎn)壓力相差8.7 MPa，在壓力較小的冷泉區(qū)珍珠層中含有硬度較小的方解石符合動(dòng)力學(xué)規(guī)律，文石的力學(xué)性能優(yōu)于方解石的力學(xué)性能。貽貝貝殼的這種礦物組成的差異，符合生物為適應(yīng)環(huán)境做出調(diào)整的機(jī)制。

圖4 各環(huán)境下貽貝拉曼圖譜

3 結(jié) 論

基于共聚焦顯微激光拉曼光譜技術(shù)，對(duì)不同環(huán)境生長(zhǎng)的貽貝介殼的礦物組成進(jìn)行研究。研究表明Desmos熱液區(qū)、臺(tái)西南冷泉繁茂區(qū)、大連近海及實(shí)驗(yàn)室后期養(yǎng)殖四種環(huán)境生存的貽貝的拉曼光譜存在顯著差異。這些差異主要是由貽貝生活環(huán)境條件發(fā)生變化而引起，同時(shí)共聚焦顯微激光拉曼光譜技術(shù)能有效區(qū)分由環(huán)境變化引起的礦物組成的樣品。介殼的礦化特點(diǎn)與發(fā)育階段、生存環(huán)境等密切相關(guān)，特殊的礦物組分變化是其適應(yīng)極端環(huán)境的一個(gè)表征。因此，未來(lái)系統(tǒng)地開展對(duì)深海貽貝介殼礦化及其變化的研究及其調(diào)控機(jī)制，有助于更好的理解深海貽貝的特殊生命過(guò)程及其環(huán)境適應(yīng)機(jī)制，加深人類對(duì)深海極端環(huán)境的科學(xué)認(rèn)知。