周紅艷，單熱愛(ài)

( 1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，江西 贛州 341000；2.重慶市中醫(yī)院麻醉科，重慶 400000)

急性胃粘膜損傷(acute gastric mucosa lesion, AGML )發(fā)生于嚴(yán)重創(chuàng)傷、重大手術(shù)、重度顱腦損傷、嚴(yán)重感染、多器官功能障礙等重癥患者，一旦演變成急性胃潰瘍或消化道大出血，則后果十分嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致患者死亡。因手術(shù)、創(chuàng)傷、疾病進(jìn)展等傷害的不可避免性和不確定性，及AGML防治的傳統(tǒng)方法主要集中于胃粘膜層面，即使新藥也離不開(kāi)抑酸、防酸返彌散、抗氧自由基等胃粘膜終末端治療[1-2]，況且預(yù)防手段有限，因此，迄今仍沒(méi)有阻止AGML發(fā)生、發(fā)展和再發(fā)的特效藥和十分有效的手段。近期有研究指出鎂的使用有利于減輕非甾體類藥物誘導(dǎo)的胃黏膜損傷，并指出其與鎂離子減少壁細(xì)胞數(shù)量、增加粘液細(xì)胞數(shù)量有關(guān)[3-4]。鎂離子作為人體內(nèi)不可缺少的重要元素,具有較多的生理作用, 是很多主要的酶和激素作用所必須的物質(zhì)之一，多項(xiàng)研究指出鎂具有降低炎癥反應(yīng)、減輕氧自由基損傷的作用[5-7]。本文擬從氧自由基層面，探討硫酸鎂預(yù)處理對(duì)浸水束縛應(yīng)激致大鼠急性胃黏膜損傷的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與器材

1.1.1主要試劑硫酸鎂(MP Biomedicals)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成)、BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天)、鎂離子測(cè)定試劑盒(Cohesion Biosciences)。

1.1.2主要器材酶標(biāo)儀(中國(guó)南京華東電子集團(tuán))、低溫離心機(jī)(日本HITACHI公司)、37℃恒溫孵育箱(廣東省醫(yī)療器械)、超低溫冰箱(日本SANYO公司)、分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性SPF級(jí)Wistar大鼠24只，體重180～220 g，南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。每4～5只大鼠放入1籠，適應(yīng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)環(huán)境為光/暗周期為12/12 h(光照時(shí)間7∶00～19∶00)、溫度為(23±1)℃，大鼠可自由獲得飼料和飲水。

1.3實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1動(dòng)物分組24只大鼠隨機(jī)分為3組，分別為：正常組(NC組，n=8)、模型組(WIRS組，n=8)、實(shí)驗(yàn)組(MgSO4組，n=8)，實(shí)驗(yàn)組大鼠飲用的是加入硫酸鎂的水(硫酸鎂500 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)14 d，正常對(duì)照組及模型組則正常飲水。14 d后，模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠制備浸水束縛應(yīng)激模型，6 h后，3組大鼠均處死取材。

1.3.2造模采用經(jīng)典的浸水束縛應(yīng)激模型[8]：大鼠于造模前禁食24 h、禁飲2 h；室溫控制在24℃恒溫，溫度計(jì)調(diào)控水溫在(18±1)℃之間(酌情加冰)；將大鼠固定于自制的鐵絲籠內(nèi)，連同鐵絲籠垂直放入恒溫水中，液面達(dá)大鼠胸骨劍突位置；固定好鐵絲籠，防止大鼠嗆水。

1.3.3取材6 h后，麻醉取材，分別取血、胃液、胃組織備用。

1.3.4檢測(cè)

1.3.4.1計(jì)數(shù)潰瘍指數(shù)按Guth標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)胃黏膜損傷指數(shù)(UI)：點(diǎn)狀出血及糜爛<1 mm為1分，糜爛1～2 mm為2分，糜爛2～3 mm為3分，糜爛>3 mm為4分，糜爛>4 mm為5分，寬度>2 mm者分值×2，所有得分相加為UI。

1.3.4.2測(cè)定組織含水量用生理鹽水沖洗胃組織，用組織剪剪取一塊0.5 cm×0.5 cm大小組織塊，吸干后稱重，作為濕重(W)，置于37℃恒溫箱，干燥48 h至恒重后稱重，作為干重(D)，計(jì)算胃組織(濕重-干重)/濕重。

1.3.4.3H-E染色將切好的胃組織切片進(jìn)行蘇木素-伊紅染色。

1.3.4.4胃液pH值測(cè)定結(jié)扎賁門(mén)和幽門(mén)，取下整個(gè)胃，收集胃液于干燥管內(nèi)，通過(guò)pH計(jì)直接測(cè)定并記錄，取測(cè)定3次的平均值。

1.3.4.5血清SOD、MDA的檢測(cè)取好的血室溫靜置2 h后，3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取上清按照南京建成試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.4.6血清Mg的測(cè)定采用原子吸收分光光度法測(cè)定血清中Mg2+的含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，3組間同一指標(biāo)的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1胃黏膜組織形態(tài)學(xué)改變正常組大鼠胃組織內(nèi)壁光滑，未見(jiàn)損傷性改變，胃黏膜結(jié)構(gòu)正常，黏膜上皮細(xì)胞層保存良好，胃腺及固有層未見(jiàn)浸潤(rùn)；模型組大鼠胃內(nèi)壁可見(jiàn)黏膜糜爛、出血、壞死，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞排列紊亂，部分黏膜上層及固有層缺失，黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)組大鼠胃黏膜呈深紅色，可見(jiàn)明顯充血、水腫，鏡下見(jiàn)細(xì)胞排列紊亂，黏膜下層有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及出血。見(jiàn)圖1(a～c)及(A～C)。

圖1 各組胃黏膜大體(a～c)及鏡下觀(A～C，HE×100)

a：正常組，未見(jiàn)胃黏膜損傷性改變，內(nèi)壁光滑；b：模型組，黏膜糜爛、出血、壞死(見(jiàn)黑色箭頭)；c：實(shí)驗(yàn)組，胃黏膜呈深紅色，可見(jiàn)明顯充血、水腫，可見(jiàn)白色潰瘍(見(jiàn)黑色箭頭)。A：正常組，胃黏膜結(jié)構(gòu)正常，黏膜上皮細(xì)胞層保存良好，胃腺及固有層未見(jiàn)浸潤(rùn)；B：模型組，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞排列紊亂，部分黏膜上層及固有層缺失(見(jiàn)白色箭頭)，黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(綠色箭頭)及出血(藍(lán)色箭頭)；C：實(shí)驗(yàn)組，鏡下見(jiàn)細(xì)胞排列紊亂，黏膜下層有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(綠色箭頭)及出血(藍(lán)色箭頭)。

2.2各組胃黏膜潰瘍指數(shù)、組織含水量及胃液pH值與正常組相比，其余兩組均有不同程度的胃黏膜損傷，潰瘍指數(shù)及組織含水量均升高(P<0.01)，相對(duì)于模型組，實(shí)驗(yàn)組大鼠潰瘍指數(shù)及組織含水量均降低(P<0.01)，說(shuō)明硫酸鎂預(yù)處理可以減輕大鼠浸水束縛應(yīng)激所致的急性胃黏膜損傷；與正常組相比，余兩組胃液pH降低明顯(P<0.01)，而與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組胃液pH值明顯升高(P<0.01)，這表示硫酸鎂預(yù)處理減輕大鼠急性胃黏膜損傷與減少胃液酸度有關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠潰瘍指數(shù)、組織含水量和胃液pH的變化

注：與正常組相比，*P<0.01；與模型組相比，#P<0.01。

2.3各組大鼠血清SOD、MDA值研究結(jié)果顯示：與正常組相比，余兩組大鼠血清SOD值降低，MDA值升高(見(jiàn)表2)，說(shuō)明浸水束縛應(yīng)激所致大鼠急性胃黏膜損傷與降低血清SOD、升高M(jìn)DA有關(guān)。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清SOD明顯升高(158.3±11.7 vs 122.7±8.22，P<0.01)，血清MDA則明顯降低(8.16±1.25 vs 14.6±2.1，P<0.01)，說(shuō)明硫酸鎂預(yù)處理減輕急性胃黏膜損傷與升高血清SOD、降低MDA有關(guān)。

表2 各組大鼠血清Mg2+、SOD、MDA值

注：與正常組相比，*P<0.01；與模型組相比，#P<0.01。

2.4各組大鼠血清Mg2+濃度檢測(cè)各組大鼠血清Mg2+濃度發(fā)現(xiàn)：與正常組大鼠相比，模型組大鼠血清Mg2+濃度稍有降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而實(shí)驗(yàn)組大鼠血清Mg2+濃度稍有升高，也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清Mg2+濃度明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討 論

急性胃黏膜損傷是臨床上危重癥患者常見(jiàn)并發(fā)癥，尤其發(fā)生在嚴(yán)重?zé)齽?chuàng)傷、重大手術(shù)、嚴(yán)重顱腦傷、嚴(yán)重感染等急危重人群。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期以來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究指出急性胃黏膜損傷主要與以下幾方面相關(guān)：神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、胃酸分泌增多、前列腺素(prostaglandin，PG)及一氧化氮等保護(hù)性因子減少、活性氧生成增多、胃黏膜細(xì)胞增殖/凋亡失衡等，其中胃酸及氧自由基損傷均是引起急性胃黏膜損傷發(fā)生的重要原因[9-10]。鎂是一種微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被認(rèn)為是體內(nèi)300多種酶作用的重要因子。據(jù)報(bào)道，鎂可以預(yù)防心血管疾病，緩解哮喘，改善睡眠及減輕炎癥反應(yīng)等[11-13]，同時(shí)它也是抗酸劑的重要組成部分，盡管證據(jù)有限，但它用于便秘和消化不良被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)的治療方法。已知的具有抗?jié)儩摿Φ慕饘僭睾苌伲V就是其中之一，鎂化合物被用作瀉藥，在許多情況下幫助穩(wěn)定異常的神經(jīng)興奮和血管痙攣。它是許多酶的共同因子，特別是利用高磷酸鍵的酶，它被用于抗酸劑的配方，通過(guò)中和胃酸和減少胃酸的分泌，從而為愈合提供合適的介質(zhì)，除此之外，本文還從氧自由基層面探討鎂的抗?jié)儥C(jī)制。

浸水束縛應(yīng)激是一種強(qiáng)度較大的復(fù)合刺激，短時(shí)間內(nèi)即可導(dǎo)致胃黏膜損傷、甚至形成胃潰瘍，已被廣泛用來(lái)研究應(yīng)激性胃黏膜損傷的發(fā)生及治療的研究。從胃黏膜的大體形態(tài)及組織學(xué)改變，我們發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組大鼠相比，模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠均出現(xiàn)了胃黏膜糜爛、出血、潰瘍，均發(fā)生了急性胃黏膜損傷(見(jiàn)表1)，模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠潰瘍指數(shù)及胃組織水腫明顯增加(P<0.01)。而與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠胃黏膜損傷明顯減輕，潰瘍指數(shù)級(jí)組織水腫明顯降低(P<0.01)(見(jiàn)表1)，說(shuō)明硫酸鎂預(yù)處理可以減輕大鼠浸水束縛應(yīng)激所致急性胃黏膜損傷。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)與正常組相比，模型組和實(shí)驗(yàn)組胃液pH值均明顯降低(P<0.01)，而與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組胃液pH值則明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明硫酸鎂預(yù)處理可以升高胃液pH值，這與之前的大多數(shù)報(bào)道一致，研究指出口服鎂化合物是最常用、最有效的抗酸藥物之一，因其可以減少頂葉細(xì)胞數(shù)量，從而減少胃酸的分泌[14-15]。

我們的研究中發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠血清Mg2+濃度下降，雖然結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清Mg2+濃度則明顯升高，這或許與實(shí)驗(yàn)組大鼠胃黏膜損傷減輕存在相關(guān)性。早有研究指出：應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致血清Mg2+濃度降低，這與應(yīng)激導(dǎo)致血中兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素類分泌增加，從而明顯增加尿中Mg2+的排泄，導(dǎo)致血液中Mg2+水平降低[16-17]。相反地，低血鎂濃度會(huì)增加釋放這些與壓力相關(guān)的激素，導(dǎo)致一個(gè)正反饋循環(huán)，增強(qiáng)壓力荷爾蒙的釋放和鎂的消耗。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，缺乏鎂會(huì)誘發(fā)或增強(qiáng)炎癥和氧化應(yīng)激[18-19]，這或許與模型組胃黏膜損傷的發(fā)生存在相關(guān)性，相反，當(dāng)補(bǔ)充鎂以后，這種炎癥反應(yīng)會(huì)相應(yīng)減輕[5-7,13]，我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，使用硫酸鎂預(yù)處理后，大鼠血清Mg2+濃度升高，同時(shí)其胃黏膜損傷程度也相應(yīng)的減輕了。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)被認(rèn)為是氧化應(yīng)激引起黏膜損傷的原因之一。自由基通過(guò)引起上皮基底成分的降解、改變細(xì)胞代謝和促進(jìn)脫氧核糖核酸(DNA)的損傷來(lái)誘導(dǎo)胃黏膜損傷。因此，增強(qiáng)抗氧化活性、清除自由基可能是防止?jié)冃纬傻谋Ｗo(hù)機(jī)制。SOD是一種交替催化超氧化物(O2-)自由基分解為普通氧分子(O2)或過(guò)氧化氫(H2O2)的酶。生成的過(guò)氧化氫被過(guò)氧化氫酶等其他酶降解。因此，SOD是一種重要的細(xì)胞自由基清除劑，是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御機(jī)制的一部分。本研究結(jié)果提示，經(jīng)浸水束縛應(yīng)激后，模型組和實(shí)驗(yàn)組均發(fā)生了胃黏膜損傷，且這兩組的大鼠血清SOD均較正常組下降，但是與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清SOD明顯升高，且胃黏膜損傷明顯減輕，這與Hans等的研究一致[20]。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)MDA的量可反應(yīng)機(jī)體受氧自由基攻擊、細(xì)胞遭受損傷的程度，故MDA可作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的生物標(biāo)記。我們的研究發(fā)現(xiàn)，浸水束縛應(yīng)激后血清MDA值升高，但用硫酸鎂預(yù)處理后，大鼠血清MDA值的升高會(huì)明顯減少。以上結(jié)果提示：硫酸鎂預(yù)處理可以減輕大鼠浸水束縛應(yīng)激所致胃黏膜損傷可能與升高SOD、減少M(fèi)DA產(chǎn)生有關(guān)。

綜上所述，本研究表明，在正常動(dòng)物中，鎂預(yù)處理可能具有胃保護(hù)和抗?jié)兊奶匦?。它的胃保護(hù)作用除了與其抗酸能力外，還與鎂提高抗氧活性及降低脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生有關(guān)。