夏小艷 葉 楓 彭桂元 周小明

(1 長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院， 湖南長沙市 410017，電子郵箱：274228692@qq.com; 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)科， 長沙市 410017)

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，據(jù)國際癌癥研究所最新統(tǒng)計(jì)資料顯示，2012年全球有52.8萬宮頸癌新發(fā)病例，26.6萬死亡病例，其中我國宮頸癌的新發(fā)病例和死亡病例約占全世界的1/3[1]。目前，手術(shù)切除并輔以放化療是宮頸癌的主要治療方法[2]。但化療可使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性而導(dǎo)致療效不佳，疾病復(fù)發(fā)乃至死亡。沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白 1(silent mating-type informator regulator 2 homolog 1，SIRT1)是Sirtuin家族成員之一，是酵母沉默信號調(diào)節(jié)因子2在人體中的類似物，是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的Ⅲ型去乙?；浮IRT1基因定位于人類染色體10q21.3，基因組序列長度約為33 kb，共有9個外顯子編碼747個氨基酸，翻譯后蛋白質(zhì)量為81.7 kDa，其參與了體內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)，還參與腫瘤、糖尿病等疾病以及增齡相關(guān)性疾病的發(fā)生過程[3-4]。有研究表明，SIRT1在宮頸癌HeLa/MMC耐藥細(xì)胞亞系中高表達(dá)[5]，但機(jī)制尚未完全明確。本研究探討耐順鉑(DDP)宮頸癌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)情況及其對細(xì)胞增殖的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源與培養(yǎng) 宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心。細(xì)胞均用含10%小牛血清、100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)在溫度37℃、濕度95%、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 主要試劑、儀器 SIRT1抗體(圣克魯斯生物技術(shù)公司，CA，美國，批號：sc-74504)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(Abcam公司，批號：ab2785)。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Abcam公司，批號：ab6785)。TRIzol 試劑(Invitrogen公司，批號：10033-21)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技公司，批號：4374876)，細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑(賽默飛世爾科技公司，批號：A13261)，脂質(zhì)體 2000轉(zhuǎn)染試劑(賽默飛世爾科技公司，批號：11668019)，Wellscan MK3型酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司)，siRNA由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。

1.3 細(xì)胞分組及干預(yù) 將HeLa和SiHa細(xì)胞分別分為耐藥組和敏感組。敏感組細(xì)胞不做任何處理，而耐藥組在培養(yǎng)過程中逐步增加培養(yǎng)液中順鉑的濃度來誘導(dǎo)SiHa和HeLa細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，建立對順鉑耐藥的SiHa和HeLa細(xì)胞系，即HeLa/DDP和SiHa/DDP細(xì)胞系，其中順鉑濃度從0.5～20 nmol(0.5、1,2、4、8、10、12、14、16、18、20 nmol)逐漸增加，直到細(xì)胞增殖穩(wěn)定，無明顯凋亡。再將穩(wěn)定增殖的耐藥細(xì)胞分為HeLa/DDP-NC組、HeLa/DDP-siRNA組，以及SiHa/DDP-NC組、SiHa/DDP-siRNA組，每組取100 μL密度為1×105個/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔板上，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜，次日按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。siRNA組加入合成序列：TGATGAAGCGCTGTAACTCTT；NC組加入合成序列：ACGTGACACGTTCGGAGAATT。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)3個副孔。

1.4 免疫印跡試驗(yàn)法 收集敏感組、穩(wěn)定增殖的耐藥組以及轉(zhuǎn)染后的耐藥組細(xì)胞(轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞轉(zhuǎn)染4～6 h后收集細(xì)胞)，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌后加入適當(dāng)裂解液，裂解離心提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(上樣量為40量/孔)，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，用5%低脂奶粉在室溫下封閉2 h，阻斷膜的非特異性斑點(diǎn)。然后用SIRT1抗體(體積比為1 ∶1 000)或GAPDH(體積比為1 ∶500)孵育，室溫下于搖床上平緩搖動2 h。TBS洗滌3次，5 min/次，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶2 000)室溫下孵育1 h，TBS洗滌3次，5 min/次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯示信號，于AX-II X射線攝影暗匣進(jìn)行顯影。根據(jù)顯影條帶計(jì)算條帶灰度值，進(jìn)而計(jì)算目的蛋白的表達(dá)。

1.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 收集敏感組、穩(wěn)定增殖的耐藥組及轉(zhuǎn)染后的耐藥組細(xì)胞(轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞轉(zhuǎn)染4～6 h后收集細(xì)胞)，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。測定純度及濃度后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，操作按說明書進(jìn)行。以GAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測SIRT1 mRNA相對表達(dá)量。20 μL反應(yīng)體系：Bestar?SYBRGreen qPCRMaster Mix 10μL，PCR上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1μL，ddH2O 8 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。所有引物由上海生工生物有限公司進(jìn)行設(shè)計(jì)。GAPDH引物：正向5’- CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3，反向5′-GGGTAGAGTCATACTGGAACATG-3′；SIRT1的引物：正向5′-GAGTGGCAAAGGAGCAGA-3′，反向5′-TCTGGCATGTCCCACTATC-3′。用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。其中，△Ct=(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)，△△Ct=(待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct)。

1.6 細(xì)胞增殖檢測 取HeLa/DDP-NC組、HeLa/DDP-siRNA組細(xì)胞，以及SiHa/DDP-NC組、SiHa/DDP-siRNA組細(xì)胞，以2×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板，分別在培養(yǎng)0 h、24 h、48 h及72 h后每孔加入10μL CCK-8試劑，在37℃下孵育3 h后于酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光度值(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)3個副孔。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥組與敏感組細(xì)胞SIRT1蛋白及mRNA相對表達(dá)水平比較 敏感組SiHa細(xì)胞、HeLa細(xì)胞的SIRT1蛋白及mRNA相對表達(dá)水平均低于耐藥組細(xì)胞(均P<0.05)。見表1及圖1。

表1 耐藥組與敏感組SiHa、HeLa細(xì)胞SIRT1蛋白及mRNA相對表達(dá)水平比較(x±s)

圖1 耐藥組與敏感組SiHa、HeLa細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)情況

2.2 抑制SIRT1的表達(dá)對順鉑耐藥細(xì)胞增殖的影響 SiHa/DDP-NC組和HeLa/DDP-NC組細(xì)胞SIRT1蛋白及mRNA相對表達(dá)水平分別高于Siha/DDP-siRNA組和HeLa/DDP-siRNA組細(xì)胞，提示轉(zhuǎn)染成功，見表2及圖2。CCK-8結(jié)果顯示，SiHa/DDP-NC組和HeLa/DDP-NC組細(xì)胞培養(yǎng)后24 h、48 h及72 h的A值分別高于SiHa/DDP-siRNA組和HeLa/DDP-siRNA組細(xì)胞(P<0.05)，見表3及表4。

表2 DDP-NC組與DDP-NC組細(xì)胞SIRT1蛋白及mRNA相對表達(dá)水平比較(x±s)

表3 兩組SiHa細(xì)胞增殖情況比較(x±s)

表4 兩組HeLa 細(xì)胞增殖情況比較(x±s)

圖2 轉(zhuǎn)染后兩種細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)情況

3 討 論

宮頸癌細(xì)胞耐藥性與許多因素有關(guān)，有研究表明，多重耐藥基因1、P糖蛋白過量表達(dá)以及P53突變等相互影響、共同作用，可導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞對抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥[6]。SIRT1是Sirtuin家族成員之一，其在諸多生理過程中，包括應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞新陳代謝、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡及增殖等，發(fā)揮重要作用。大多數(shù)研究表明，SIRT1在腫瘤形成過程中主要起促癌基因的作用，但在特定組織中也可有抑癌基因的作用，而促癌基因與抑癌基因的平衡極為重要[7-8]。還有研究表明SIRT1與腫瘤耐藥性密切相關(guān)，其過表達(dá)能增強(qiáng)腫瘤的耐藥性[9]。Shuang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者中SIRT1的過表達(dá)和化療耐藥性密切相關(guān)，檢測SIRT1表達(dá)水平可以預(yù)測患者的預(yù)后情況。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SIRT1能上調(diào)肝癌患者YAP2蛋白的表達(dá)而增強(qiáng)肝癌的耐藥性；而抑制SIRT1的表達(dá)能降低腫瘤的耐藥性[10]。如采用微小RNA-494抑制胰腺癌患者的SIRT1和c-Myc的表達(dá)，可以降低胰腺癌細(xì)胞的耐藥性，并抑制胰腺癌細(xì)胞增殖[11]。而有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1 表達(dá)下調(diào)能明顯降低HeLa/MMC 細(xì)胞對絲裂霉素的耐藥性，其作用可能與P糖蛋白有關(guān)[5]。

為進(jìn)一步研究SIRT1對宮頸癌順鉑耐藥的影響，本研究建立了兩個順鉑耐藥的宮頸癌細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，耐藥組SiHa細(xì)胞及HeLa細(xì)胞的SIRT1蛋白及mRNA表達(dá)水平均高于敏感組(均P<0.05)，提示順鉑耐藥宮頸癌細(xì)胞株的SIRT1表達(dá)上調(diào)；而SiHa/DDP-siRNA組、HeLa/DDP-siRNA組細(xì)胞A值分別低于SiHa/DDP-NC組、HeLa/DDP-NC組(均P<0.05)，即抑制SIRT1的表達(dá)后，耐藥細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，這與吳琦等[12]的研究結(jié)果相似，提示SIRT1可能在宮頸癌細(xì)胞對順鉑耐藥的調(diào)控中起到了不可或缺的作用。但順鉑耐藥細(xì)胞株SIRT1表達(dá)水平升高的機(jī)制尚不明確，Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，激活β2-腎上腺素受體信號通路可上調(diào)SIRT1表達(dá)，從而可能影響p53依賴性化療藥物對宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生的毒性。本研究未能通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析抑制SIRT1表達(dá)后腫瘤細(xì)胞增殖的情況，而SIRT1調(diào)控宮頸癌細(xì)胞對順鉑耐藥性的途徑也仍需進(jìn)一步研究。SIRI1能否作為宮頸癌耐藥、預(yù)后預(yù)測的標(biāo)志物，逆轉(zhuǎn)宮頸癌耐藥性的靶點(diǎn)，還有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，順鉑耐藥的HeLa、SiHa細(xì)胞中SIRT1表達(dá)水平升高，抑制SIRT1表達(dá)可以抑制順鉑耐藥的宮頸癌細(xì)胞的增殖。SIRTI或可作為宮頸癌化療耐藥患者的分子靶標(biāo)，SIRTI抑制劑或可成為對順鉑耐藥的宮頸癌患者的新治療方向。