羅璇，陳常緣，王秀原，杜婧加，劉婧雨，吳蒙

(武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院,武漢 430205)

酶作為一種高效、安全的生物催化劑，已被廣泛地運(yùn)用在食品原料開發(fā)、品質(zhì)改良、工藝改造等領(lǐng)域[1]。其中蛋白酶是食品加工生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的酶種之一，被廣泛用于奶制品、豆制品等食品的精細(xì)加工[2]。生姜蛋白酶作為新型的植物蛋白酶，不僅具有藥用保健價值，還可用作食品添加劑，其應(yīng)用前景廣泛。然而，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，游離的生姜蛋白酶穩(wěn)定性較差，易失活，但可通過對其進(jìn)行固定化，以顯著提高酶穩(wěn)定性[3]。

目前，國內(nèi)外對生姜蛋白酶的提取、純化及固定化已有了較多報道，但利用新型載體磁性復(fù)合物固定生姜蛋白酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究卻未見報道。

磁性Fe3O4納米粒子可以和各種天然生物大分子、合成高分子及無機(jī)物反應(yīng)生成磁性復(fù)合微球，并借助外部磁場將其應(yīng)用在流床式酶反應(yīng)器中，使其表面積增大，提高固定化酶的催化效率[4,5]。但由于載體會影響酶蛋白的活性，從而會限制酶的活性中心，因而酶學(xué)性質(zhì)將受到不同程度的影響[6]。

為了解決這一問題，本文通過單因素實(shí)驗(yàn)法來確定固定化生姜蛋白酶的最佳條件，并對磁性凝膠微球固定生姜蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究；探討酶固定化的最適條件，以期在提高酶的催化效果的同時實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)使用，將酶的利用價值最大化。

1 材料與方法

1.1 材料與器材

鮮生姜：市售；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、氨水、海藻酸鈉、明膠、三氯化鐵、硫酸亞鐵、三氯乙酸、碳酸鈉、干酪素、50%戊二醛、氯化鈣：均為分析純；福林酚試劑：生物純。

TG16-WS離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器公司；FA2014B電子天平 上海越平科技儀器有限公司；UV2000紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；HH-S2電熱恒溫水浴鍋、SHZ-88恒溫振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 生姜蛋白酶液的制備

取外形完好、無腐爛和機(jī)械損傷的新鮮生姜50 g洗凈, 切成小塊后，加入2倍體積的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 6)研磨30 min, 過濾, 將濾液收集至250 mL的三角瓶中，并置于4 ℃冰箱中，2 h后以4000 r/min離心10 min，取上清液，即得生姜蛋白酶液，測其初始酶活。

1.2.2 Fe3O4磁核的制備

將0.25 mol/L的硫酸亞鐵溶液100 mL、0.5 mol/L氯化鐵溶液200 mL以及0.1 mol/L檸檬酸鈉溶液40 mL混合，于75 ℃恒溫攪拌10 min，滴加10%氨水調(diào)節(jié)pH至10，并等待其繼續(xù)反應(yīng)40 min后，離心10 min，棄上清液，濾渣用蒸餾水重復(fù)洗滌至中性，放入80 ℃烘箱中干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 磁性微球的制備方法

將一定量的Fe3O4磁核、3.5%海藻酸鈉及3.0%明膠以一定體積比例混合，室溫下恒溫振蕩器混合均勻；用注射器吸取上述混合液，從一定高度滴入濃度為2%的CaCl2溶液中，以形成凝膠微球；更換CaCl2溶液，于4 ℃下靜置硬化2 h后，再濾出凝膠微球，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液洗滌，瀝干，于 50 ℃干燥。

1.2.4 固定化生姜蛋白酶

將磁性凝膠微球與戊二醛交聯(lián)2.5 h后，用蒸餾水洗滌，并于50 ℃干燥，以獲得磁性凝膠微球復(fù)合載體。將其與酶液混合，室溫下恒溫振蕩器混合均勻，用蒸餾水洗滌，獲得磁性復(fù)合載體固定化生姜蛋白酶，并測其酶活。

1.2.5 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法[7，8]

取上述溶液各1.00 mL，各加0.4 mol/L的碳酸鈉溶液5.0 mL, 福林試劑1.00 mL, 在40 ℃左右(±0.2 ℃)水浴中使其顯色20 min, 將分光光度計(jì)波長設(shè)置為680 nm, 分別測定其吸光度, 并以O(shè)D值為縱坐標(biāo),酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

表2 單因素實(shí)驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of single factor experiment

由表2可知單因素實(shí)驗(yàn)條件，測定其對應(yīng)的酶活力，并換算成相對酶活力。

1.2.7 方差分析

基于上述單因素實(shí)驗(yàn)所測得的數(shù)據(jù)，通過SPSS 18.0處理，確定影響固定化酶活力的各因素的大小關(guān)系并進(jìn)行方差分析。

1.2.8 酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.2.8.1 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性測定

檢測固定化生姜蛋白酶和游離生姜蛋白酶在不同溫度(20～80 ℃)下的酶活力，確定酶的最適溫度。然后將兩種酶分別在不同溫度下處理1 h，在最適溫度下檢測各自酶活力，并計(jì)算熱處理后的剩余酶活力(%)，分析兩種酶的溫度穩(wěn)定性。

1.2.8.2 酶的最適pH及酸堿穩(wěn)定性測定[9]

測定固定化生姜蛋白酶和游離生姜蛋白酶在不同pH (3.0～8.0)下的酶活力，確定最適pH。再將兩種酶分別置于不同pH的0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液中，4 ℃下處理2 h，在最適pH下檢測各自酶活力，計(jì)算酸堿處理后剩余的酶活力(%)，分析兩種酶的酸堿穩(wěn)定性。

1.2.8.3 酶的動力學(xué)參數(shù)測定

測定酶的米氏常數(shù)(Km)：分別測定底物生姜蛋白濃度范圍在1.0～5.0 mg/mL時，固定化酶和游離酶的酶活力，利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖可得游離生姜蛋白酶的米氏常數(shù)和固定化生姜蛋白酶的表觀米氏常數(shù)。

1.2.8.4 固定化酶操作穩(wěn)定性的測定

測定上述制備的1 g固定化生姜蛋白酶的酶活力，固定化酶每使用一次，用蒸餾水清洗3次，再次進(jìn)行測定，并計(jì)算出相對酶活力(%)；連續(xù)測定6次，根據(jù)測定的酶活力分析固定化酶的操作穩(wěn)定性。

1.2.8.5 固定化酶儲存穩(wěn)定性的測定

固定化酶在25 ℃下每隔2 d測其剩余酶活力(%)，共測定5次。

1.2.8.6 酶活力和相對酶活力的測定[10]

酶活力測定方法：分別取酶液和酪蛋白底物1 mL于水浴預(yù)熱 2 min，混合均勻后繼續(xù)恒溫反應(yīng)10 min，加入 0.4 mol/L 三氯乙酸 2 mL，沉淀殘余蛋白。離心，取 1 mL 上清液，加入 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液和1 mL稀釋后的福林酚試劑，混合均勻，在 40 ℃水浴顯色 10 min，用紫外可見分光光度計(jì)測試其在 680 nm 下的吸光度。

生姜蛋白酶活力(U)=A×K×N×4/10。

式中：A為樣品的平均吸光度值；K為100除以酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上100 μg/mL對應(yīng)680 nm處的吸光度值；N為酶液稀釋倍數(shù)；4為反應(yīng)液總體積；10為10 min，酶液分解酪蛋白反應(yīng)時間。

固定化酶相對酶活力(%)=每次使用后固定化酶活力/最高固定化酶活力×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.9983,說明線性關(guān)系良好。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析

表3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of single factor experiments

表4 單因素實(shí)驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance of single factor experiments

單因素的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)借助SPSS 18.0來處理，通過F檢驗(yàn)，查表可知當(dāng)F≥F表時表明兩組數(shù)據(jù)存在顯著差異；P值即概率，反映某一事件發(fā)生的可能性大小，P<0.001為有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所以，確定影響固定化生姜蛋白酶酶活力各因素的大小關(guān)系為：交聯(lián)時間>酶量>固定時間>pH>Fe3O4磁核量>戊二醛濃度。其中交聯(lián)時間、酶量、固定時間3個因素的P值分別為0，0，0.001，是影響固定化生姜蛋白酶的主要因素，戊二醛的濃度、Fe3O4磁核量、pH影響的顯著性相對較弱。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 酶的最適溫度測定

溫度升高會使維持酶蛋白空間構(gòu)象的次級鍵發(fā)生斷裂從而導(dǎo)致酶變性失活，而固定化的酶由于酶分子與載體間多處連接可防止由于溫度過高引起的酶分子伸展變形作用。由圖2可知，固定化生姜蛋白酶的最適溫度(60 ℃)大于游離酶的最適溫度(50 ℃)，說明固定化酶的溫度穩(wěn)定性有一定程度的提高。

圖2 酶的最適溫度測定Fig.2 Determination of optimum temperature of enzymes

2.3.2 酶的最適pH測定

圖3 酶的最適pH測定Fig.3 Determination of optimum pH value of enzymes

由圖3可知，固定化生姜蛋白酶最適pH均為5.0，固定化生姜蛋白酶在pH 3.0～6.0范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，而游離酶的最適pH為6.0，最適范圍在pH 5.0～7.0；說明固定化酶比游離酶更能在酸性條件下保持活性。

2.3.3 酶的動力學(xué)參數(shù)測定

在不同的生姜蛋白底物濃度下分別測定固定化生姜蛋白酶和游離酶的酶活力，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法[11]，以滴定度(及消耗的NaOH 體積)對時間作圖，得一直線，其斜率即為初速度V1.0(相當(dāng)于1.0 mg/mL的蛋白酶濃度)，然后分別取2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL的底物重復(fù)上述操作，分別測出V2.0、V3.0、V4.0、V5.0，以反應(yīng)速度倒數(shù)為x，底物濃度為y作圖，得固定化生姜蛋白酶的線性方程為：y=0.6897x+0.1004，可得固定化酶表觀米氏常數(shù)Km=6.869 mg/mL；游離酶的線性方程為y=0.3805x+0.2743，求得游離酶的米氏常數(shù)Km=1.387 mg/mL。說明經(jīng)磁性復(fù)合載體固定的生姜蛋白酶對底物的親和力有所下降，但并不顯著。酶與底物的親和力有下降得是正?，F(xiàn)象，但下降得太多會影響到達(dá)最大反應(yīng)速率的時間。

2.3.4 固定化生姜蛋白酶操作穩(wěn)定性的測定

對固定化酶進(jìn)行重復(fù)使用，重復(fù)使用4次，相對酶活力為56.71%；重復(fù)使用5次，酶活力還剩余44.83%，而且磁性球形載體還保持較好彈性，破碎現(xiàn)象少；游離酶在重復(fù)使用3次后，酶活力只剩下了50.24%；重復(fù)使用5次后只剩下20.18%，相對酶活力極低。

圖4 酶的動力學(xué)參數(shù)的測定Fig.4 Determination of kinetic parameters of enzymes

圖5 生姜蛋白酶操作穩(wěn)定性的測定Fig.5 Determination of operational stability of ginger protease

由圖5可知，以海藻酸鈉-明膠協(xié)同的磁性復(fù)合載體固定化的生姜蛋白酶不僅酶活力回收率高，且操作穩(wěn)定性更優(yōu)于游離酶。

2.3.5 固定化生姜蛋白酶儲存穩(wěn)定性的測定

固定化酶在25 ℃條件下每隔2 d測其相對酶活力(%)，共測5次。固定化酶在25 ℃條件下儲存2 d，相對酶活力可達(dá)88.47%；但25 ℃下儲存10 d后，固定化酶活力只剩50.66%，而游離酶在25 ℃條件下儲存2 d，相對酶活力可達(dá)86.34%，但25 ℃下儲存10 d后，游離酶活力只剩33.57%。

圖6 固定化生姜蛋白酶儲存穩(wěn)定性的測定Fig.6 Determination of storage stability of immobilized ginger protease

由圖6可知，固定化酶及游離酶的活力隨著儲存時間的延長會逐漸降低，但磁性復(fù)合載體固定化的生姜蛋白酶儲存穩(wěn)定性相比于游離酶的儲存穩(wěn)定性較高。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用海藻酸鈉與明膠為載體，對磁性Fe3O4進(jìn)行包埋，形成了磁性復(fù)合載體凝膠微球。當(dāng)濃度為3.0%，戊二醛中交聯(lián)1.5 h，1 g磁球載體中加入30 mg/g酶量時可制得彈性好且不易碎的磁性微球載體；磁性海藻酸鈉-明膠協(xié)同固定化生姜蛋白酶的最適pH為5.0，最適溫度為60 ℃，在pH 3.0～6.0、40～70 ℃溫度范圍內(nèi)固定化酶相對穩(wěn)定，表觀米氏常數(shù)Km=6.869 mg/mL，重復(fù)使用4次后，相對酶活力為56.71%，重復(fù)使用5次后，酶活力還剩余44.83%，此時磁性球形載體還保持較好彈性；經(jīng)磁性固定化后的酶在25 ℃條件下儲存2 d，相對酶活力為88.47%；儲存10 d后，酶活力仍達(dá)50.66%。

而游離酶的最適pH為6.0，最適溫度為50 ℃，在pH 5.0～7.0、50～60 ℃溫度范圍內(nèi)酶相對穩(wěn)定；表觀米氏常數(shù)Km=1.387 mg/mL；游離酶在重復(fù)使用3次后，酶活力只剩下了50.24%，重復(fù)使用5次后只剩下20.18%；在25 ℃條件下儲存2 d，相對酶活力為86.34%，但在25 ℃下儲存10 d后，游離酶活力只剩33.57%。由此可知，在同等條件下，磁性復(fù)合載體固定生姜蛋白酶所表現(xiàn)出來的酶學(xué)性質(zhì)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于游離酶。