陳桂柳，盧超銳，劉雪萍，吳長力，林夢哲，陳穎琪，張宏梅

(廣東工業(yè)大學(xué) 生物工程系，廣州 510006)

廣式臘腸具有非常悠久的歷史，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。但傳統(tǒng)臘腸的制作以作坊形式為主，具有規(guī)模小、產(chǎn)品性質(zhì)不穩(wěn)定的特征，同時(shí)也存在產(chǎn)品的安全性問題。發(fā)酵肉制品中的亞硝酸鹽殘留問題是食品安全領(lǐng)域中非常重要的內(nèi)容[1,2]。因?yàn)閬喯跛猁}具有優(yōu)異的發(fā)色和抑菌能力，所以它是一種在食品生產(chǎn)中特別是在肉制品制造業(yè)中常用的食品添加劑，但它卻有致畸、致癌、致甲狀腺腫大等危害[3,4]。因此，急需找到一種能夠降解發(fā)酵肉制品中亞硝酸鹽的辦法。

目前亞硝酸鹽的降解辦法主要有物理法、化學(xué)法和微生物法3種，微生物法基于其經(jīng)濟(jì)、高效等特點(diǎn)得到廣泛的重視，其主要是通過菌株如硝化細(xì)菌中的假單胞菌(Pseudomonassp.)、芽孢桿菌(Bacillussp.)或發(fā)酵中用到的乳酸菌(Lactobacillussp.)等對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行降解。解決發(fā)酵食品中亞硝酸鹽安全問題的最為理想的途徑之一，就是從具有代表性的發(fā)酵食品中篩選出高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌菌株作為發(fā)酵劑，添加到發(fā)酵肉制品中，在改善產(chǎn)品性能的同時(shí)提高產(chǎn)品的安全性[5-9]。

本研究以前期在泡菜中分離的兩株植物乳桿菌為研究對(duì)象，分析其耐氯化鈉和耐亞硝酸鈉的特征以及降解亞硝酸鹽的能力，并將其中一株植物乳桿菌應(yīng)用到廣式臘腸發(fā)酵中，通過檢測其理化性質(zhì)和微生物學(xué)特征，以探討其作為廣式臘腸發(fā)酵劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)菌株：實(shí)驗(yàn)所用的菌株分別是LactobacillusplantarumH1和LactobacillusplantarumL1。由本實(shí)驗(yàn)室前期從潮汕泡菜中分離得到，并經(jīng)過革蘭氏染色、產(chǎn)乳酸分析、過氧化氫酶分析等生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析鑒定為植物乳桿菌，并于-20 ℃添加20%甘油保護(hù)劑低溫保存。

培養(yǎng)基：MRS肉湯、PALCAM瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、GYP培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基等，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 植物乳桿菌對(duì)氯化鈉和亞硝酸鈉耐受性的研究

配制50 mL的MRS培養(yǎng)基，經(jīng)118 ℃高壓滅菌15 min，備用。從-20 ℃冰箱中取出菌株，待培養(yǎng)基冷卻至室溫時(shí)，分別吸取50 μL菌液于培養(yǎng)基中，并將培養(yǎng)基移至恒溫?fù)u床中，30 ℃培養(yǎng)48 h。

在GYP培養(yǎng)基中，加入2.0%的氯化鈉或 300 mg/kg的亞硝酸鈉，以不加任何其他物質(zhì)作為空白對(duì)照，平行3個(gè)樣本。移取乳酸菌液于離心管中，5000 r/min ，4 ℃下離心5 min后舍棄上清液，用10 mL的無菌PBS緩沖液清洗乳酸菌，并用50 mL PBS緩沖液懸浮乳酸菌。以1%的接種量(大約為7.0 log CFU/mL)接種于GYP培養(yǎng)基中(含有氯化鈉或亞硝酸鈉)以及空白對(duì)照培養(yǎng)基中。置于恒溫?fù)u床30 ℃培養(yǎng)72 h后，使用分光光度計(jì)法，在波長660 nm處測量培養(yǎng)基的光密度值[10]。

乳酸菌存活率=(含氯化鈉或亞硝酸鈉GYP培養(yǎng)基的OD值)/(不含鹽GYP培養(yǎng)基的OD值)×100%。

1.3 植物乳桿菌對(duì)亞硝酸鹽降解能力的研究

亞硝酸鹽的檢測參照GB 5009.33-2016中的分光光度法進(jìn)行。將待測液2 mL置于50 mL帶塞比色管中，先加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液混勻，然后避光靜置5 min，再加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，用去離子水定容至刻度，搖勻后避光靜置15 min，于538 nm處測量其吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別準(zhǔn)確吸取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00，2.50 mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液(相當(dāng)于 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.5，10.0，12.5 μg 亞硝酸鈉)置于50 mL帶塞比色管中，經(jīng)紫外分光光度法測定后，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

按1∶1000的接種量將濃度為108CFU/mL的乳酸菌分別接種到含適量NaNO2(160 μg/mL)的MRS培養(yǎng)基后，將pH值調(diào)為6.5，30 ℃培養(yǎng)，每隔12 h吸取菌液測量其亞硝酸鹽含量。菌液均需經(jīng)過前處理才可對(duì)其進(jìn)行測量，前處理步驟如下：吸取菌液5 mL于250 mL的帶塞錐形瓶中，加入12.5 mL硼砂溶液后沸水浴15 min后將提取液轉(zhuǎn)移到200 mL容量瓶中，先后加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液和5 mL乙酸鋅溶液，搖勻，沉淀蛋白質(zhì)，加入去離子水至刻度，搖勻后室溫靜置30 min以去除上層脂肪，用濾紙過濾上清液，棄去30 mL初濾液，吸取2 mL剩下的濾液采用分光光度法測定亞硝酸鹽含量。

1.4 廣式臘腸的制備

將接種了植物乳桿菌H1的100 mL MRS培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，離心分離獲得菌體后，用無菌PBS洗滌并用10 mL PBS懸浮菌體，使菌體濃度達(dá)到105CFU/mL。

將新鮮豬肉中的肥瘦分開，攪碎后按比例混合，肥瘦比例為2∶8，按肉重加入300 mg/kg亞硝酸鈉、2%氯化鈉、0.1%抗壞血酸鈉、1%葡萄糖、0.6%蔗糖和0.88%香料混合物，充分?jǐn)嚢? min混合均勻。腌制1 h，紫外滅菌20 min。將腌制好的豬肉分成每份100 g，共6份。其中3份以1%的接種量(約為8.0 log CFU/g)的發(fā)酵劑接種在肉料中，另外3份則加入等量的生理鹽水。將接種后的肉料填充到豬腸衣中。制成的臘腸先存放在超凈工作臺(tái)中，以除去腸衣表面的水分。臘腸表面無明顯潤濕感時(shí)，將臘腸懸掛在室內(nèi)陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干，室內(nèi)溫度保持在20 ℃。

1.5 發(fā)酵的臘腸在發(fā)酵和干燥過程中微生物的檢測

將發(fā)酵的臘腸在不同時(shí)間(0，1，2，5，8，14，21 d)進(jìn)行取樣檢測其乳酸菌、霉菌和大腸菌群的數(shù)量。其中，乳酸菌采用溴甲酚紫固體培養(yǎng)基，霉菌采用孟加拉紅培養(yǎng)基，大腸菌群采用XLD瓊脂。計(jì)數(shù)方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)[11-13]。

1.6 臘腸在發(fā)酵和干燥過程中pH值與水活度的測定

將發(fā)酵的臘腸在不同時(shí)間(0，1，2，5，8，14，21 d)進(jìn)行取樣，分別采用pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)和水活度測定儀(無錫市華科儀器儀表有限公司)測定其pH值和水活度的大小。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析和統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物乳桿菌對(duì)氯化鈉和亞硝酸鈉耐受性的研究

由表1可知，H1和L1兩株菌在2.0%氯化鈉的培養(yǎng)基中生長不受抑制。300 mg/kg亞硝酸鈉不能對(duì)L1菌的生長產(chǎn)生抑制，而對(duì)H1菌有較小的抑制。已有研究表明起始濃度為6.0 log CFU/mL的植物乳桿菌可在濃度為100 mg/L(100 mg/kg)Na2NO2的條件下生長，表明該乳酸菌對(duì)亞硝酸鈉的耐受能力高[14]。因此，本研究結(jié)果表明H1菌和L1菌有更強(qiáng)的耐亞硝酸鹽能力。

表1 乳酸菌在含氯化鈉或亞硝酸鈉培養(yǎng)基中的活性Table 1 Activity of Lactobacillus in culture medium containing sodium chloride or sodium nitrite

注：數(shù)據(jù)中的“±”表示標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)菌的活性在100%以下時(shí)，可視為該菌在對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中的生長受到抑制；當(dāng)菌的活性約為100%時(shí)，可視為該菌在對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中的生長不受影響；當(dāng)菌的活性在100%以上時(shí)，可視為該菌對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中存在能促進(jìn)該菌生長的因素。

2.2 植物乳桿菌對(duì)亞硝酸鹽降解能力的研究

圖1 兩株植物乳桿菌對(duì)亞硝酸鹽的降解能力Fig.1 Degradation capability of nitrite by twoLactobacillus plantarum strains

由圖1可知，兩株植物乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中對(duì)亞硝酸鹽均具有較好的降解能力，在第12～24 h期間，降解速度最快，H1菌對(duì)亞硝酸鹽的降解率從11.8%增加到92.9%，L1菌對(duì)亞硝酸鹽的降解率從9.6%增加到77.0%，在第36 h時(shí)，兩株植物乳桿菌幾乎將亞硝酸鹽全部降解。有文獻(xiàn)表明，來自泡菜的植物乳桿菌5-7-3對(duì)亞硝酸鹽的降解率為89.94%[15]。因此，在本實(shí)驗(yàn)中同樣來自泡菜的植物乳桿菌L1和H1也表現(xiàn)出了較好的亞硝酸鹽降解能力。

2.3 臘腸在發(fā)酵過程中乳酸菌活菌數(shù)、pH值和水活度的變化

在傳統(tǒng)的廣式臘腸中添加H1菌作為發(fā)酵劑，通過在不同時(shí)間下測定其乳酸菌活菌數(shù)、pH值以及水活度來探討該菌株作為發(fā)酵劑的可行性，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵臘腸中乳酸菌活菌數(shù)、pH和水活度的變化Fig.2 Changes in the number of live bacteria, pH and wateractivity of Lactobacillus in fermented sausage

注：A表示臘腸在發(fā)酵過程中乳酸菌活菌數(shù)與發(fā)酵天數(shù)的關(guān)系；B表示臘腸在發(fā)酵過程中pH值與發(fā)酵天數(shù)的關(guān)系；C表示臘腸在發(fā)酵過程中水活度與發(fā)酵天數(shù)的關(guān)系。

由圖2中A可知，添加了H1菌的發(fā)酵臘腸的乳酸菌活菌數(shù)多于不添加H1菌的發(fā)酵臘腸的乳酸菌活菌數(shù)。在發(fā)酵的前2 d內(nèi)，兩種發(fā)酵臘腸中的乳酸菌都快速生長，乳酸菌處在對(duì)數(shù)生長期。在發(fā)酵的第2～8 d之間，添加了H1菌的發(fā)酵臘腸的乳酸菌活菌數(shù)生長速率減小，但總活菌數(shù)還是有增長的趨勢，乳酸菌處于生長平穩(wěn)期。而沒有添加H1菌的發(fā)酵臘腸的乳酸菌活菌數(shù)先增長后減少。到第8天后，兩種發(fā)酵臘腸的乳酸菌總數(shù)都呈現(xiàn)持續(xù)減少的趨勢，且隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，減少的速率越快。

由圖2中B可知，在發(fā)酵的第0～5 d，兩種發(fā)酵臘腸的pH值持續(xù)快速降低，添加了H1菌的發(fā)酵臘腸的pH值比未添加H1菌的發(fā)酵臘腸的pH值低。在發(fā)酵的第5天后，兩者的pH值都持續(xù)緩慢下降，但添加H1菌的pH值始終比不添加H1菌的低，說明添加H1菌會(huì)降低臘腸的pH值。

由圖2中C可知，添加了植物乳桿菌H1的發(fā)酵臘腸的水活度與傳統(tǒng)發(fā)酵臘腸相比，在發(fā)酵的第0～5 d水分活度變化不大，但第5天后，添加植物乳桿菌H1會(huì)影響臘腸的水活度，相對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵，能使其水活度降低。

2.4 臘腸在發(fā)酵過程中有害菌的測定

表2 發(fā)酵臘腸中霉菌生長情況Table 2 Growth of mold in fermented sausage

注：涂布平板使用的樣液均稀釋至104倍；“+”表示培養(yǎng)基上霉菌菌落的數(shù)量為0～50個(gè)，“++”表示培養(yǎng)基上霉菌菌落的數(shù)量為50～100個(gè)，“+++”表示培養(yǎng)基上霉菌菌落的數(shù)量在100個(gè)以上，“-”表示培養(yǎng)基上無霉菌菌落。

由表2可知，兩種臘腸在發(fā)酵的第0天時(shí)，已經(jīng)存在霉菌。不添加H1菌的發(fā)酵臘腸中的霉菌菌落數(shù)量隨著發(fā)酵天數(shù)的增加而增多，到發(fā)酵第14天才開始減少。添加了H1菌的臘腸中霉菌在發(fā)酵第0～5 d之間呈增長趨勢，而第5天時(shí)，霉菌的數(shù)量開始減少，到第14 天時(shí)，已經(jīng)檢測不到霉菌。說明添加H1菌可以減少有害菌的數(shù)量。

2.5 發(fā)酵臘腸中大腸桿菌的測定

表3 發(fā)酵臘腸中大腸桿菌數(shù)量Table 3 Quantity of Escherichia coli in fermented sausage

注：國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定大腸桿菌在食品中含量不得超過30 CFU/100 g，如超過則判定為樣品不合格。

由表3可知，兩種臘腸在發(fā)酵第0天時(shí)，都未檢測到大腸桿菌。在發(fā)酵的第1～3 d，在不添加H1菌的發(fā)酵臘腸中檢測到大腸桿菌，而在同時(shí)期添加H1菌的發(fā)酵臘腸中未檢測到大腸桿菌，說明H1菌對(duì)大腸桿菌的生長繁殖有抑制效果。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)廣式臘腸制作的過程中，參與發(fā)酵的微生物種類很多，乳酸菌是非常重要的一類。文中的兩株植物乳桿菌均具有良好的耐鹽和耐亞硝酸鈉能力，同時(shí)表現(xiàn)出對(duì)亞硝酸鈉有良好的降解能力。選擇H1菌作為臘腸進(jìn)行發(fā)酵劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測了發(fā)酵臘腸的乳酸菌活菌數(shù)、霉菌數(shù)、大腸桿菌含量、pH值和水活度，對(duì)比空白對(duì)照的發(fā)酵臘腸，探討H1菌應(yīng)用到發(fā)酵臘腸后對(duì)這些數(shù)值造成的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，H1菌對(duì)發(fā)酵臘腸的pH值影響較大，可以降低產(chǎn)品的水活度，同時(shí)有可能會(huì)對(duì)大腸桿菌和霉菌造成抑制效果。說明所選乳酸菌菌株具有較好的環(huán)境適應(yīng)性，并顯示出很大的酸化潛力，可以通過抑制致病菌的生長來提高生物安全性。因此，H1菌有望成為一種具有生物安全性的本土發(fā)酵劑。另外，臘腸發(fā)酵中，菌株的種類多樣，植物乳桿菌與其他菌可能存在著營養(yǎng)的競爭關(guān)系，也可能是脅迫條件的協(xié)同生存。我們將深入研究臘腸中的菌群結(jié)構(gòu)，以及發(fā)酵劑菌株與其他菌株之間的相互作用，使產(chǎn)品優(yōu)良的性狀具有穩(wěn)定性。為實(shí)現(xiàn)廣式臘腸生產(chǎn)的規(guī)?；?、規(guī)范化以及保證產(chǎn)品的安全性研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。