李小玲，趙義蘭，華智銳

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛726000)

美容杜鵑(Rhndodendroncalophytum)屬于杜鵑花科、杜鵑花屬(RhododendronLinn)的植物，具有較高的園林觀賞及應(yīng)用價(jià)值。隨著城市化進(jìn)程的推進(jìn)及旅游業(yè)的發(fā)展，人類不合理的采挖導(dǎo)致杜鵑花資源破壞及流失，加之杜鵑花生長(zhǎng)緩慢，常用的扦插、嫁接等無(wú)性繁殖方式成苗率不高[1]，且都會(huì)受到諸如季節(jié)氣候、母株材料等很多條件的影響，難以擴(kuò)大規(guī)模、進(jìn)行商品化操作[2]。因此，種子繁殖成為杜鵑花規(guī)?；耘嗉胺庇缕贩N的主要方法，但杜鵑種子極為細(xì)小，萌發(fā)率又低，很難進(jìn)行大規(guī)模栽培[3]，而人工種子技術(shù)作為一門新興技術(shù)為杜鵑花的栽培提供了一條新途徑。

人工種子又稱合成種子，是指將離體培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體、不定芽及分生組織包埋在具有一定營(yíng)養(yǎng)成分及保護(hù)作用的人工種皮內(nèi)，在人為提供的培養(yǎng)條件下能夠發(fā)芽成苗的顆粒體[4]。近年來(lái),人工種子的包埋繁殖體已不僅僅局限于體細(xì)胞胚，即人工種子的制作已從單一的體細(xì)胞胚發(fā)展到能夠發(fā)育成完整植株的分生組織，如愈傷組織、原球莖、塊莖、不定芽、腋芽等[5-6]，所以當(dāng)采用分生組織作為包埋繁殖體制作人工種子獲得成功后便迅速成為熱點(diǎn)，也使得人工種子的研究從模式植物轉(zhuǎn)向具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的糧食作物和藥用植物。目前對(duì)杜鵑人工種子的制作研究較少，本試驗(yàn)以美容杜鵑腋芽為材料，研究了人工種子制作方法及萌發(fā)條件，旨在為美容杜鵑人工種子的研究提供理論依據(jù)，為杜鵑的規(guī)?；a(chǎn)提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

美容杜鵑(Rhndodendroncalophytum)腋芽于2019年4月上旬采自商洛市鎮(zhèn)安縣國(guó)家木王林場(chǎng)海拔1500 m左右的杜鵑花景區(qū)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理 選擇美容杜鵑帶腋芽莖段，經(jīng)流水沖洗數(shù)小時(shí)，后置于超凈工作臺(tái)上用75%酒精消毒30 s，用無(wú)菌水沖洗2～3次，再用0.1% HgCl2消毒8 min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5次，將消毒好的莖段切成2～4 mm作為人工種子包埋繁殖體備用。

1.2.2 人工種子制作 人工種子制作方法采用滴注法，具體操作步驟如下：將切好的外植體小段懸浮于半凝膠狀態(tài)的2%～4%海藻酸鈉溶液中，充分搖勻混合5～8 min后，用膠頭滴管吸取單個(gè)莖段，滴于2% CaCl2溶液中進(jìn)行離子反應(yīng)，即得人工種子。

1.2.3 人工種子萌發(fā) 撈出人工種子，用無(wú)菌水沖洗2～3次，用濾紙吸干表面水分，分別播種于不加激素的MS培養(yǎng)基上，加有激素的MS培養(yǎng)基和鋪有用無(wú)菌水浸潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)溫度設(shè)為(25±1) ℃，光照時(shí)間為12 h/d，光照強(qiáng)度為1000～2000 lx；20 d后觀察人工種子萌發(fā)率。

以上所有美容杜鵑人工種子萌發(fā)試驗(yàn)中，以突破種皮2 mm視為萌發(fā)，萌發(fā)率=萌發(fā)的人工種子數(shù)/播種的人工種子總數(shù)×100%。

1.2.4 不同人工胚乳及人工種皮配方對(duì)人工種子萌發(fā)的影響 選用1/2 MS液體培養(yǎng)基與不同濃度激素配比(0.2∶0.1、 0.3∶0.1、0.4∶0.1激素單位為mg/L)NAA∶GA3(A)及3%、4%、5%的海藻酸鈉(B)，與2%殼聚糖組成人工胚乳配方；與0～0.2 mg/L苯甲酸鈉(C)、0～0.2 mg/L多菌靈(D)及 2%、8%、10%的CaCl2(E)組成種皮配方；以10、15、20 min的不同離子反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行5因素3水平的正交試驗(yàn)(表1)。將制作好的人工種子播于MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理為10粒，重復(fù)3次。放于無(wú)菌培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度設(shè)為(25±1) ℃，光照強(qiáng)度為1000～2000 lx，光照時(shí)間12 h/d；20 d后統(tǒng)計(jì)不同人工胚乳組分下人工種子的萌發(fā)數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)因素L18(35)水平表

1.2.5 不同海藻酸鈉濃度及離子交換時(shí)間對(duì)人工種子成形的影響 將3%、4%、5%的海藻酸鈉溶液分別與2%、8%、10% CaCl2溶液進(jìn)行離子交換反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間設(shè)10、15、20 min，觀察人工種子成形情況。

1.2.6 不同萌發(fā)基質(zhì)對(duì)人工種子萌發(fā)及成苗的影響 將制作好的人工種子分別播種于不加激素的MS培養(yǎng)基和加有激素的MS培養(yǎng)基(0.2 mg/L NAA，0.1 mg/L GA3)以及用無(wú)菌水浸潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿和用1/2 MS浸潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿，每個(gè)處理為10粒，重復(fù)3次。放于無(wú)菌培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度設(shè)為(25±1) ℃，光照時(shí)間設(shè)每天12 h，光照強(qiáng)度設(shè)1000～2000 lx；20 d后統(tǒng)計(jì)人工種子萌發(fā)率及成苗率。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉濃度以及離子交換時(shí)間對(duì)人工種子成形的影響

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2%海藻酸鈉+2% CaCl2種子成形不理想，表現(xiàn)為種子顆粒不均勻，看似成形，實(shí)際撈出即破，無(wú)彈性，種子成形時(shí)間長(zhǎng)，易粘連且易碎(圖1a～1c)。故增加海藻酸鈉濃度到5%，并將CaCl2濃度提高到8%、10%、15%，并根據(jù)孫筱筠等[7]的研究結(jié)果，將人工種子胚乳成分稍加完善，以添加1.5%的可溶性淀粉來(lái)增加人工種子透氣性，并且對(duì)一次成形不好的人工種子進(jìn)行二次包埋。經(jīng)調(diào)整后發(fā)現(xiàn)15%的CaCl2濃度太高，種子硬度大，無(wú)彈性且透明度低(圖1d～1f)因此舍棄這兩個(gè)濃度，后續(xù)試驗(yàn)按照海藻酸鈉濃度2%～5%，CaCl2濃度為2%、8%、10%來(lái)進(jìn)行。由表2可知不同海藻酸鈉濃度和CaCl2濃度及離子反應(yīng)時(shí)間，均對(duì)人工種子成形有較大影響，當(dāng)海藻酸鈉濃度過(guò)低時(shí)，人工種子不能成球形且形狀不規(guī)則，較軟，塌扁并易粘連，無(wú)彈性，種子成形時(shí)間長(zhǎng)；而當(dāng)海藻酸鈉濃度過(guò)高時(shí)，雖然縮短了成形時(shí)間，但人工種子拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，硬度大且透明度低，渾濁[8,9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，4%海藻酸鈉溶液在2% CaCl2溶液中反應(yīng)15 min和3%海藻酸鈉溶液在2%、8% CaCl2溶液中反應(yīng)20 min形成的人工種子呈透明狀，顆粒均勻，富有彈性(圖1g～1i)。

表2 不同海藻酸鈉濃度及離子交換時(shí)間對(duì)人工種子成形的影響

a、b、c分別為2%海藻酸鈉溶液在2% CaCl2溶液中反應(yīng)10、15、20 min；d、e、f分別為5%海藻酸鈉溶液在2% CaCl2溶液中反應(yīng)10、15、20 min；g、h、i分別為4%海藻酸鈉溶液在2% CaCl2溶液中反應(yīng)15 min，3%海藻酸鈉溶液在2% CaCl2溶液中反應(yīng)20 min，3%海藻酸鈉溶液在8% CaCl2溶液中反應(yīng)20 min。

圖1 海藻酸鈉濃度以及離子交換時(shí)間對(duì)人工種子成形的影響

2.2 不同人工胚乳及人工種皮配方對(duì)人工種子萌發(fā)的影響

以1/2 MS液體培養(yǎng)基作為包埋溶劑，選用3水平5因素的正交試驗(yàn)L18(35)(表1)，將不同的人工胚乳成分與不同的人工種皮成分進(jìn)行離子反應(yīng)10、15、20 min。由表3[10]中的極差分析可知：5個(gè)因素對(duì)于美容杜鵑人工種子萌發(fā)的影響程度依次為B>E>D>C>A，即海藻酸鈉>CaCl2>多菌靈>苯甲酸鈉>激素比(NAA∶GA3)；海藻酸鈉、CaCl2、多菌靈對(duì)人工種子萌發(fā)率的影響程度均達(dá)到顯著水平，其次是苯甲酸鈉、NAA與GA3； NAA與GA3的激素配比對(duì)人工種子萌發(fā)影響最小；但根據(jù)后期萌發(fā)結(jié)果可知激素對(duì)人工種子萌發(fā)起到促進(jìn)作用，但促進(jìn)效果不顯著；最優(yōu)組合為A2B2C3D3E1，這與本次試驗(yàn)結(jié)果一致。

綜合分析，最佳人工胚乳與種皮配方為4%海藻酸鈉+0.2 mg/L多菌靈+0.2 mg/L苯甲酸鈉+NAA∶GA3(0.3∶0.1)+2% CaCl2；經(jīng)后期萌發(fā)結(jié)果可知該組合配方制作的人工種子萌發(fā)率達(dá)87%以上。

表3 正交因素對(duì)人工種子萌發(fā)分析表

2.3 不同萌發(fā)基質(zhì)對(duì)人工種子萌發(fā)的影響

本試驗(yàn)將制作好的人工種子分別播于普通MS培養(yǎng)基，加有激素的MS培養(yǎng)基(0.2 mg/L NAA，0.1 mg/L GA3)以及用無(wú)菌水浸潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿和用1/2 MS浸潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中。結(jié)果表明：用1/2 MS浸潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中的人工種子在14 d左右逐漸出現(xiàn)污染情況，種子無(wú)失水，20 d時(shí)的萌發(fā)率達(dá)31%；而用無(wú)菌水浸潤(rùn)濾紙作為對(duì)照培養(yǎng)的培養(yǎng)皿中的人工種子，在12 d左右種子則逐漸失水變干，但并無(wú)污染情況，且20 d時(shí)的萌發(fā)率為20.3%(圖2a～2b)；經(jīng)二次包埋的人工種子雖也會(huì)失水，但失水情況較一次包埋減輕許多，在15 d左右時(shí)種子逐漸失水，并且萌發(fā)率較一次包埋有所提高，說(shuō)明二次包埋有效地降低了種子失水率，提高了萌發(fā)率；培養(yǎng)基組的人工種子則并無(wú)太大差異，加有激素的MS培養(yǎng)基中的人工種子在10 d左右開始萌發(fā)，20 d時(shí)萌發(fā)率達(dá)87%，而普通MS培養(yǎng)基中的人工種子萌發(fā)相對(duì)較慢，在12 d時(shí)逐漸開始萌發(fā)，20 d時(shí)的萌發(fā)率達(dá)84%(圖2c～2d)。對(duì)4種不同萌發(fā)基質(zhì)的萌發(fā)效果進(jìn)行方差分析(表4)可知，美容杜鵑人工種子在加激素的培養(yǎng)基中萌發(fā)率顯著高于其它處理組，其次是不加激素的MS培養(yǎng)基，而用1/2 MS液體浸潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中的人工種子萌發(fā)效果最不顯著；加激素的培養(yǎng)基是人工種子的最適萌發(fā)基質(zhì)。

3 討論

本試驗(yàn)采用帶腋芽莖段制作人工種子有許多優(yōu)點(diǎn)：可避免體細(xì)胞胚胎發(fā)生的變異，且取材容易，成本低[11]；海藻酸鈉凝膠包埋系統(tǒng)具有無(wú)毒、使用方便、易成膠、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[12,13]。本次試驗(yàn)利用海藻酸鈉作為包埋基質(zhì)對(duì)美容杜鵑進(jìn)行了包埋處理，得出人工胚乳的最佳制作條件為4%海藻酸鈉與2% CaCl2水溶液離子反應(yīng)15 min，形成的人工種子顆粒均勻，軟硬適中，富有彈性。這與張明生等[14]的研究結(jié)果一致，但與已報(bào)道的張建彬等[15]的大花蕙蘭類原球莖的人工種子的制作中海藻酸鈉的濃度有所差異。同時(shí)從本次試驗(yàn)還可看出海藻酸鈉作為包埋系統(tǒng)的一些缺點(diǎn)，如：保水性較差，易使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)流失，同時(shí)膠粒在空氣中容易失水變干，致使人工種子在后期的培養(yǎng)中萌發(fā)受阻，這與秦自清等[16-18]的研究結(jié)果一致。孫筱筠等[7]研究發(fā)現(xiàn)在海藻酸鈉凝膠系統(tǒng)中加入淀粉形成混合包埋基質(zhì)，不僅改善了單一海藻酸鈉凝膠系統(tǒng)所造成的保水性差的問(wèn)題，同時(shí)也提高了人工種子的萌發(fā)率。本試驗(yàn)吸取前人的經(jīng)驗(yàn)，在人工胚乳成分中添加了可溶性淀粉，結(jié)果表明加入淀粉后能有效增加人工胚乳的保水性并提高人工種子的萌發(fā)率；分析原因可能是淀粉分子中疏松的多孔結(jié)構(gòu)改變了海藻酸鈉的緊密結(jié)構(gòu)，增加了海藻酸鈉凝膠的透氣性和保水性，從而提高了人工種子萌發(fā)率。同時(shí)曾穎蘋等[19]研究發(fā)現(xiàn)人工種子的萌發(fā)率還與其失水率有關(guān)。本次試驗(yàn)將部分人工種皮進(jìn)行了二次包埋，主要是為了降低種子的失水率，并與一次包埋種子形成對(duì)照，結(jié)果表明二次包埋明顯降低了失水率，利于種子萌發(fā)。

a.培養(yǎng)皿組變干的人工種子；b.人工種子在培養(yǎng)皿中萌發(fā)；c.培養(yǎng)基組污染的人工種子；d.人工種子在培養(yǎng)基中萌發(fā)。圖2 不同萌發(fā)基質(zhì)對(duì)人工種子萌發(fā)率的影響

表4 不同萌發(fā)基質(zhì)下人工種子萌發(fā)率差異

注:同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著。

本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在不同萌發(fā)基質(zhì)中，1/2 MS浸潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中的人工種子在14 d左右逐漸出現(xiàn)污染情況，種子無(wú)失水，20 d時(shí)的萌發(fā)率達(dá)31%；而用無(wú)菌水浸潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中的人工種子，在12 d左右時(shí)種子逐漸失水變干，但并無(wú)污染情況，分析其原因可能是培養(yǎng)皿密封不嚴(yán)，加之1/2 MS高營(yíng)養(yǎng)物濃度導(dǎo)致增加染菌幾率，從而降低人工種子萌發(fā)率。作為調(diào)整，后續(xù)培養(yǎng)皿組試驗(yàn)均用封口膜封住培養(yǎng)皿邊緣來(lái)減少染菌情況，但經(jīng)后期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此現(xiàn)象并無(wú)減少。加有激素的MS培養(yǎng)基中的人工種子在10 d左右開始萌發(fā)，20 d時(shí)萌發(fā)率達(dá)87%，而普通MS培養(yǎng)基中的人工種子萌發(fā)較慢，在12 d時(shí)逐漸開始萌發(fā)，20 d時(shí)的萌發(fā)率達(dá)84%，分析原因是激素對(duì)人工種子的萌發(fā)起到促進(jìn)作用，但不明顯。通過(guò)上述正交試驗(yàn)因素分析也可得出此結(jié)論，這與薛建平[20]對(duì)半夏人工種子的研究結(jié)果一致。

人工胚乳為人工種子的萌發(fā)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)在人工胚乳中添加植物激素、碳水化合物、殺菌劑、防腐劑可提高人工種子萌發(fā)率[21-22]。本試驗(yàn)得出殺菌劑多菌靈影響人工種子萌發(fā)的效果達(dá)到顯著水平，但在本試驗(yàn)中雖然殺菌劑和防腐劑會(huì)起到降低污染率的作用，但仍然存在污染，可能是操作過(guò)程不嚴(yán)謹(jǐn)，導(dǎo)致染菌，因此人工種子制作過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌才能保證人工種子的質(zhì)量。

綜上分析，人工種子制作及培養(yǎng)過(guò)程中，失水和污染是影響種子萌發(fā)的最重要兩大制約因素，因此人工種子制作過(guò)程中人工外膜和胚乳成分的改進(jìn)還是有待突破的難題，雖然目前已有很多良好的復(fù)合型包裹材料，如Elvax4260、半疏水聚合物等[23]。但考慮到有些制膜程序復(fù)雜，成本高及胚乳的不保水、機(jī)械性能差、易粘連等問(wèn)題，所以人工種子外膜及胚乳成分這一領(lǐng)域仍有待深入研究。