劉文鑫 陳志成 代永欣 萬(wàn)賢崇

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所 北京100091； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 太谷 030800)

隨著全球氣候變化，氣溫的升高及降水格局的改變導(dǎo)致干旱或季節(jié)性干旱的頻發(fā)。近年來(lái)越來(lái)越多的研究報(bào)道干旱影響植株的正常生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致植株死亡(Swensonetal.,2017;Hartmannetal.,2018;王凱等，2018)。葉片在植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起重要作用，它們需要不斷地補(bǔ)充水分和CO2來(lái)實(shí)現(xiàn)光合作用。光合作用期間，CO2從葉片周?chē)髿馔ㄟ^(guò)氣孔到達(dá)氣孔下腔，然后擴(kuò)散到細(xì)胞壁周?chē)?，需要克服?xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體膜及葉綠體基質(zhì)的阻力，最后到達(dá)葉綠體基質(zhì)的羧化部位。CO2從氣孔下腔到達(dá)羧化位點(diǎn)擴(kuò)散的流暢程度稱(chēng)為葉肉導(dǎo)度(gm)。過(guò)去幾十年的大量證據(jù)證明葉肉導(dǎo)度很小，致使葉綠體中CO2濃度小于細(xì)胞間CO2濃度，因此葉肉導(dǎo)度也常常成為光合作用碳循環(huán)的限制因子(Flexasetal.,2002;Centrittoetal.,2003;Ethieretal.,2004)。葉肉導(dǎo)度的大小受到水通道蛋白(AQP)(Flexasetal.,2006;Perez-Martinetal.,2014)和碳酸苷酶(Hoetal.,2016)的調(diào)節(jié)。在植物體內(nèi)，水通道蛋白主要是質(zhì)膜水通道蛋白(PIPs)和液泡膜內(nèi)在蛋白(TIPs)。質(zhì)膜水通道蛋白(PIPs)家族分為2個(gè)亞族：PIP1和PIP2。PIP2蛋白作為主要的水分運(yùn)輸通道起作用(Chrispeelsetal.,2001)，而PIP1蛋白既協(xié)助CO2的擴(kuò)散(Uehleinetal.，2003)還與PIP2協(xié)作促進(jìn)水分的滲透(Fetteretal.,2004)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)PIP1水通道蛋白的表達(dá)還會(huì)改變質(zhì)膜對(duì)CO2的透性(Heckwolfetal.,2011)。水通道蛋白在葉片中對(duì)CO2的擴(kuò)散起促進(jìn)作用，提高了光合作用；當(dāng)水通道蛋白基因的表達(dá)受抑制時(shí)植株的光合作用降低(Heckwolfetal.,2011;Flexasetal.,2006)。用氯化汞抑制水通道蛋白導(dǎo)致光合作用和葉肉導(dǎo)度降低(Miyazawaetal.,2008)。另外許多研究發(fā)現(xiàn)，在逆境條件下水通道蛋白基因的上調(diào)在維持植物生命活動(dòng)中扮演重要的角色(Moshelionetal.,2015;Sreedharanetal.,2013)。因此，推測(cè)PIP1基因表達(dá)上調(diào)會(huì)導(dǎo)致葉肉導(dǎo)度的增加進(jìn)而促進(jìn)光合作用。

用水通道蛋白超表達(dá)或抑制表達(dá)的植株能更精確地探明水通道蛋白的功能(Heckwolfetal.,2011)。前期，作者所在實(shí)驗(yàn)室獲得了轉(zhuǎn)PtPIP1;3(GenBank登錄號(hào)：MN795092 ptopip1.3)基因的84K楊(Populusalba×P.glandulosa‘84K’)過(guò)表達(dá)植株。對(duì)野生型84K楊木質(zhì)部薄壁細(xì)胞、根、葉片及葉柄中質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因(PIPs)的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，PIP11;3基因的相對(duì)表達(dá)量最高。而且應(yīng)用生物信息學(xué)工具對(duì)PtPIPs的功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)PtPIP1;3含有1個(gè)微體C-末端定位信號(hào)，其結(jié)構(gòu)特異性可能意味其功能的特異性(冷華妮,2012)。因此，本研究選定PtPIP1;3基因進(jìn)行其參與功能調(diào)節(jié)的研究。

植物光合作用是最容易受到干旱影響的生理活動(dòng)，不管應(yīng)對(duì)短期干旱還是長(zhǎng)期干旱，氣孔關(guān)閉是植物必然采取的保護(hù)措施(Trenberthetal.,2013)。但氣孔并不是限制光合作用的唯一因素，在植物中光合作用受到氣孔導(dǎo)度(gs)、葉肉導(dǎo)度(gm)(Flexasetal.,2012;Galmésetal.,2013;Grassietal.,2005;Zhouetal.,2013；2014)或與最大羧化速率(Vcmax)(Zhouetal.,2013；2014)、最大電子傳遞速率(Jmax)有關(guān)的光合生物化學(xué)過(guò)程的限制(Tosensetal.,2016;Veromann-Jürgensonetal.,2017;Zhouetal.,2014)。在干旱及復(fù)水過(guò)程中究竟是哪些因素限制了光合作用，目前并沒(méi)有定論(Camposetal.,2014;Chenetal.,2015;Flexasetal.,2009；2014)，這限制了對(duì)植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫生理響應(yīng)的全面了解。因此，本研究利用楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因植株研究PIP1s對(duì)光合參數(shù)和葉肉導(dǎo)度的影響，比較轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在干旱期間的光合參數(shù)和葉肉導(dǎo)度下降幅度及復(fù)水后的恢復(fù)速度，分析干旱及復(fù)水期間氣孔導(dǎo)度、葉肉導(dǎo)度和光合作用中生物化學(xué)過(guò)程對(duì)光合作用的限制程度。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因過(guò)表達(dá)(PB13)和野生型(WT)84K楊的組培苗由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育，于2018年6月底，選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的組培苗轉(zhuǎn)移至規(guī)格為19 cm(上口)×17 cm(下口)× 21 cm(高)的花盆中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 轉(zhuǎn)基因材料檢測(cè)

根據(jù)Qiagen RNAeasy Mini Kit試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取楊樹(shù)葉片總RNA。用Promega SuperScriptTM Ⅲ第1鏈合成試劑盒用于反轉(zhuǎn)錄來(lái)合成cDNA第1鏈。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA溶液稀釋20倍后用于熒光定量PCR(RT-qPCR)分析。熒光定量PCR反應(yīng)根據(jù)TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作(劉文鑫,2015)。在LightCyler480熒光定量PCR儀上完成PCR的擴(kuò)增。

PtPIP1;3基因引物序列，上游引物：5′-CATC AGCTCAAACAGACAAGGAC-3′；下游引物：5′-CAG GCTTAGTAACACCCATGACAAT-3′。內(nèi)參基因ACT引物序列，上游引物：5′-AAACTGTAATGGTCCTCC CTCCG-3′；下游引物：5′-GCATCATCACAATCACTC TCCGA-3′。

1.3 干旱脅迫及復(fù)水處理

2018年11月中旬，選取株高(123±4.8)cm的野生型84K楊(WT)、(125±6.1)cm的轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因的過(guò)表達(dá)植株(PB13)的苗木，在溫室內(nèi)進(jìn)行水分控制試驗(yàn)，試驗(yàn)期間在夜晚進(jìn)行補(bǔ)光2 h。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定干旱處理時(shí)間，使植物的光合作用降到盡可能低之后再進(jìn)行復(fù)水。共設(shè)置2個(gè)處理：對(duì)照組(正常澆水，保持土壤含水量為田間持水量的75%左右)；脅迫組(利用稱(chēng)重法觀(guān)察水量變化，同時(shí)少量多次補(bǔ)水以保證各盆達(dá)到預(yù)定的含水量，即達(dá)到田間持水量的35%，然后復(fù)水到75%左右的田間持水量)?？厮陂g，對(duì)照組保持設(shè)定的水分含量，脅迫組在干旱處理10天后復(fù)水至75%左右的田間持水量。分別于干旱處理后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天和復(fù)水后1、2、3、4天測(cè)定光合參數(shù)、土壤含水量，測(cè)定干旱第10天和復(fù)水第1、2、3天的熒光參數(shù)和CO2響應(yīng)曲線(xiàn)。每處理18盆，6次重復(fù)。

用鋁盒烘干法測(cè)定土壤含水量，每個(gè)基因型測(cè)6盆，取完后立刻稱(chēng)取鮮質(zhì)量(FW)。之后，土樣在烘箱中105 ℃烘48 h，稱(chēng)干質(zhì)量(DW)。土壤含水量=(FW-DW)/DW×100%。在試驗(yàn)開(kāi)始前期測(cè)定最大田間持水量，土壤含水量最終表示為占最大田間持水量的百分比。

1.4 參數(shù)測(cè)定和計(jì)算

1.4.1 光合參數(shù)測(cè)定 使用Li-6400光合作用系統(tǒng)(帶紅藍(lán)光源葉室)于每天的10:00—11:00測(cè)定氣體交換，所有測(cè)定葉片均選取第4片完全展開(kāi)葉，光強(qiáng)為1 500 μmol·m-2s-1，葉室溫度控制在25 ℃左右。記錄凈光合作用速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)、大氣溫度(Tair)、葉片飽和水汽壓虧缺(VPDL)等參數(shù)。

在每個(gè)取樣日(停止?jié)菜牡?0天及復(fù)水的第1、2、3天)用帶有熒光葉室的Li-6400測(cè)定CO2曲線(xiàn)和葉綠素?zé)晒狻?/p>

在光強(qiáng)為1 500 μmol·m-2s-1、大氣CO2濃度(Ca)在50～1 800 μmol·mol-1變化時(shí)測(cè)定Pn-Ci曲線(xiàn)，設(shè)定CO2濃度為400、300、250、200、150、120、100、50、400、600、800、1 000、1 200、1 300、1 500、1 800 μmol CO2·mol-1，2個(gè)相鄰點(diǎn)的時(shí)間間隔為2 min。Pn-Ci曲線(xiàn)用于估算Rubisco的最大羧化速率(Vcmax)和最大電子傳遞速率(Jmax)(Sharkeyetal.,2007)，用非直角雙曲線(xiàn)模型(Farquharetal.,1980)擬合Pn-Ci曲線(xiàn)。

1.4.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 暗適應(yīng)一夜后，于凌晨6:00測(cè)定最小初始熒光(Fo)。計(jì)算光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)=(Fm-Fo)/Fm。式中：Fv為暗適應(yīng)葉片可變熒光，F(xiàn)m為暗適應(yīng)葉片最大熒光。

1.4.3 葉肉導(dǎo)度(gm)的計(jì)算 采用J變量方法計(jì)算葉肉導(dǎo)度(gm)(Harleyetal.,1992)，公式如下：

(1)

式中：Pn和Ci從Pn-Ci曲線(xiàn)獲得，Jflu為同一葉片的葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)，Г*為無(wú)線(xiàn)粒體呼吸時(shí)CO2補(bǔ)償點(diǎn)(Bernacchietal.,2002)，Rd為光下線(xiàn)粒體呼吸速率(Flexasetal.,2009)。用變化范圍在100～300 μmol·mol-1的Ci對(duì)應(yīng)的凈光合速率計(jì)算葉肉導(dǎo)度(gm)。估算葉綠體內(nèi)CO2濃度(Cc)=Ci-(Pn/gm)。

考慮到葉室內(nèi)部和外部CO2濃度差異，采用沸水煮葉片法來(lái)校準(zhǔn)Pn(Flexasetal.,2007)。經(jīng)測(cè)定CO2滲漏值較小(Pn<0.5 μmol·m-2s-1)，因此不采用此校準(zhǔn)值。

圖1 PB13植株和WT植株飽和水汽壓虧缺和土壤含水量在試驗(yàn)期間的變化Fig.1 Variations in leaf saturated vapor pressure deficit (VPDL) and soil moisture content of PB13 and wild type poplar during experimentPB13:PtPIP1;3過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因84K楊;WT:野生型84K楊。箭頭代表復(fù)水第1天。*表示各自的處理與對(duì)照組間存在顯著差異(P<0.05)。下同。PB13:PtPIP1;3 overexpression of poplar 84K;WT:Wild type of poplar 84K.The arrow indicates the first day of re-watering.Asterisks indicate statistical significant difference between control and treatment for the same gene type (P<0.05).The same below.

1.4.4 光合作用限制分析 光合作用限制分析有助于確定脅迫下影響光合作用的因素(Buckleyetal.,2015;Grassietal.,2005)。因此，為了比較干旱脅迫及復(fù)水期間光合作用的限制因素，采用Grassi等(2005)定量限制分析的方法，對(duì)光合作用的限制分為氣孔限制(ls)、葉肉限制(lm)和葉片生物化學(xué)限制(lb)，公式如下：

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：gt是總導(dǎo)度，gsc=gs/1.6，?A/?C是Pn-Cc曲線(xiàn)在Cc變化范圍為50～100 μmol CO2·mol-1時(shí)的斜率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS21.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，在0.05水平上檢驗(yàn)同一天處理和對(duì)照間的差異顯著性。用Sigmaplot 12.5進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株葉片質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因表達(dá)量

水分脅迫處理前對(duì)轉(zhuǎn)基因84K楊葉片中PtPIP1;3基因表達(dá)量進(jìn)行RT-qPCR分析，以ACT基因?yàn)閮?nèi)參基因。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因84K楊(PB13)葉片中PtPIP1;3的相對(duì)表達(dá)量是野生型植株(WT)的2.02倍，差異顯著。

2.2 葉片飽和水汽壓虧缺和土壤含水量在試驗(yàn)期間的變化

試驗(yàn)期間對(duì)照和脅迫植株的葉片飽和水汽壓虧缺(VPDL)維持在0.8 kPa以上，野生型(WT)和轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因植株(PB13)最大的VPDL值分別出現(xiàn)在停止?jié)菜牡?天和第9天，分別為1.58、1.56 kPa(圖1A)。試驗(yàn)期間土壤含水量在干旱第10天降到田間持水量的35%左右，此時(shí)開(kāi)始進(jìn)行復(fù)水，復(fù)水到田間持水量的80%左右(圖1B)。

2.3 PtPIP1;3上調(diào)表達(dá)楊樹(shù)的光合作用對(duì)干旱和復(fù)水的響應(yīng)

試驗(yàn)期間正常澆水條件下，PB13植株的凈光合速率(Pn)(13.8～20.5 μmol CO2·m-2s-1)顯著高于WT(10.4～13.1 μmol CO2·m-2s-1)。干旱處理的最初5天PB13和WT的處理與其對(duì)照之間的Pn均無(wú)明顯差異，干旱至第6天，Pn均快速降低；到第10天 WT和PB13的Pn分別只有其對(duì)照的15%和7%(圖2A)。復(fù)水1天后恢復(fù)到對(duì)照的36%(WT)和64%(PB13)，復(fù)水4天后恢復(fù)到對(duì)照的79%(WT)和96%(PB13)，PB13已經(jīng)恢復(fù)到對(duì)照水平。

PB13植株的氣孔導(dǎo)度(gs)(0.36 mol CO2·m-2s-1)總體上明顯高于WT植株(0.265 mol CO2·m-2s-1)。干旱至第4～5天，gs開(kāi)始緩慢降低，分別降到對(duì)照的78%(WT)和83%(PB13)；到第7～10天，氣孔幾乎完全關(guān)閉，gs降到0.05 mol CO2·m-2s-1左右(圖2B)。復(fù)水1天后WT的gs恢復(fù)到對(duì)照的25%，PB13恢復(fù)到對(duì)照的32%；復(fù)水4天后分別為對(duì)照的66%和76%。干旱脅迫后2種植株gs的下降速度快于Pn，但復(fù)水后的恢復(fù)速度較慢。

干旱期間胞間CO2濃度(Ci)的下降幅度相對(duì)較小，前5天逐漸降低，第6天迅速降低，在第10天迅速增加，甚至高于對(duì)照；復(fù)水后恢復(fù)(圖2C)。蒸騰速率(Tr)的變化規(guī)律(圖2D)與gs基本一致。

在干旱第10天后葉肉導(dǎo)度(gm)分別降到對(duì)照的7%(WT)和1%(PB13)。復(fù)水1天后WT植株恢復(fù)到對(duì)照的41%，而PB13植株的gm超過(guò)對(duì)照；復(fù)水3天后分別為對(duì)照的73%和76%(表1)。干旱期間，gm的降低導(dǎo)致葉綠體CO2濃度(Cc)也受到抑制。干旱第10天Cc為對(duì)照的41%(WT)和28%(PB13)。復(fù)水后由于gm的恢復(fù)，復(fù)水1天后2種植株的Cc恢復(fù)到對(duì)照水平，PB13高于對(duì)照；復(fù)水3天后WT的Cc顯著高于對(duì)照，而PB13的低于對(duì)照(表1)。

與對(duì)照相比，Rubisco的最大羧化速率(Vcmax)在干旱10天后降為對(duì)照的35%(WT)和19%(PB13)(表1)。復(fù)水3天后，Vcmax和最大電子傳遞速率(Jmax)分別為對(duì)照的70%和66%(WT)、66%和92%(PB13)，其中PB13的Jmax已經(jīng)恢復(fù)到對(duì)照水平(表1)。

圖2 PB13植株和WT植株光合參數(shù)在試驗(yàn)期間的變化Fig.2 Variations in photosynthetic parameters of PB13 and WT during the experiment

表1 脅迫和復(fù)水期間PB13和WT的葉肉導(dǎo)度(gm)、Rubsico最大羧化速率(Vcmax)、最大電子傳遞速率(Jmax)和葉綠體CO2濃度(Cc)的變化①Tab.1 Variations in mesophyll conductance(gm),Rubisco maximum carboxylation rate(Vcmax),maximum electron transport rate(Jmax),and chloroplast CO2 concentration(Cc) of PB13 and WT under water stress and re-watering

① 數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。此處脅迫(S)是干旱處理10天，RE1、RE2、RE3分別代表復(fù)水1、2、3天。不同字母表示同一天對(duì)照和處理組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05)。Data are means±SD.The stress(S) here is drought treatment for 10 days.The RE1,RE2 and RE3 refer to re-watering for one,two or three days.Different letters indicate statistical differences between control and treatment in the same day (P<0.05).

圖3 PB13植株和WT植株葉綠素?zé)晒鈪?shù)在試驗(yàn)期間的變化Fig.3 Variations in chlorophyll fluorescence parameters of PB13 and WT during the experimentStress代表干旱脅迫10天，RE1、RE2、RE3分別代表復(fù)水1天、2天、3天。*表示各自的處理和對(duì)照組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。The “Stress” here is drought treatment for 10 days.The RE1,RE2 and RE3 refer to re-watering for one,two or three days.Asterisks indicate statistically significant difference between control and treatment for the same gene type (P<0.05).

2.4 葉綠素?zé)晒鈱?duì)干旱和復(fù)水的響應(yīng)

光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)的值在試驗(yàn)期間維持在0.78以上，與對(duì)照相比沒(méi)有顯著變化(圖3A)。光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)淬滅(qP)在干旱10天后降為對(duì)照的55%(PB13)和85%(WT)(圖3B)。光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)量子效率(ФPSII)在干旱處理后降為對(duì)照的43%(PB13)和80%(WT)(圖3C)。電子傳遞速率(Jflu)降為對(duì)照的44%(PB13)和80%(WT)(圖3D)。PB13植株在復(fù)水第3天時(shí)qP、ФPSII和Jflu都恢復(fù)到對(duì)照水平，而WT尚未明顯恢復(fù)(圖3B、C、D)。

2.5 光合作用的限制因素

從Pn和gs的變化來(lái)看，在干旱的前5天，氣孔不是限制光合作用的主要因素，可能受到葉肉和生物化學(xué)的限制。隨著干旱程度的加劇，葉肉限制(lm)成為主要的限制因素，甚至為氣孔限制(ls)的4倍(WT)和13倍(PB13)(表2)，其次為ls。復(fù)水后，光合作用的主要限制因素是葉肉導(dǎo)度(lm)和生物化學(xué)限制(lb)，而且二者交替變化。復(fù)水1天后lb迅速增加并成為主要的限制因素。隨后，lm逐漸增加，成為更主要的限制因素(表2)。

表2 干旱脅迫及復(fù)水后PB13和WT植株的光合作用限制因素分析①Tab.2 Limitation factors of photosynthesis of PB13 and WT under water stress and re-watering

① 數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。此處脅迫是干旱處理10 天，RE1、RE2、RE3分別代表復(fù)水1、2、3 天。Data are means±SD.The stress here is drought treatment for 10 days.The RE1,RE2 and RE3 refer to re-watering for one,two or three days.

3 討論

水通道蛋白(AQP)除了具有運(yùn)輸水分的能力，其運(yùn)輸CO2的能力也在植物生長(zhǎng)過(guò)程中起重要的作用。如煙草(Nicotianatabacum)中NtAQP1的表達(dá)促進(jìn)了CO2在植物細(xì)胞中的運(yùn)輸，說(shuō)明水通道蛋白能增加質(zhì)膜對(duì)CO2的透性(Uehleinetal.,2003)。免疫學(xué)和翻譯融合方法進(jìn)一步證明了NtAQP1存在于保衛(wèi)細(xì)胞和葉肉細(xì)胞中，在質(zhì)膜和葉綠體內(nèi)膜都有分布；后者的分布預(yù)示了水通道蛋白在CO2吸收方面的作用(Uehleinetal.,2008)。從正常澆水的轉(zhuǎn)基因和野生型的84K楊的光合參數(shù)看，水通道蛋白過(guò)表達(dá)植株的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(gs)和蒸騰速率(Tr)高于野生型植株，說(shuō)明水通道蛋白過(guò)表達(dá)能促進(jìn)植株的光合作用。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)敲除PIP1;2基因?qū)е氯~肉導(dǎo)度(gm)降低40%(Heckwolfetal.,2011)；而本研究發(fā)現(xiàn)在正常澆水植株中，過(guò)表達(dá)植株葉肉導(dǎo)度比野生型的高40%左右。盡管葉肉導(dǎo)度還與細(xì)胞壁和碳酸苷酶有關(guān)(Evansetal.,2009)，但從上述結(jié)果來(lái)看CO2的跨膜透性是葉肉導(dǎo)度的限制因子。

3.1 光合作用對(duì)干旱脅迫和復(fù)水的響應(yīng)

干旱脅迫導(dǎo)致的Pn、gs和gm的降低速度比復(fù)水后的恢復(fù)速度慢。復(fù)水1天后PtPIP1;3過(guò)表達(dá)植株的gm恢復(fù)到對(duì)照水平之上。復(fù)水3天后，過(guò)表達(dá)植株的Pn恢復(fù)到對(duì)照水平。gs的降低導(dǎo)致CO2的擴(kuò)散阻力增加，降低了葉綠體中CO2的可利用性，從而導(dǎo)致光合作用的降低(Flexasetal.,2002)。復(fù)水后，過(guò)表達(dá)植株光合作用的恢復(fù)程度大于野生型植株，說(shuō)明水通道蛋白過(guò)表達(dá)后轉(zhuǎn)基因植株的光合參數(shù)恢復(fù)速度更快。干旱脅迫除了導(dǎo)致氣孔關(guān)閉外，非氣孔因素的作用也扮演很重要的角色。在干旱脅迫期間氣孔導(dǎo)度和葉肉導(dǎo)度都降低，這在其他物種中已經(jīng)得到證實(shí)(Galmésetal.,2007;Flexasetal.,2008)。本試驗(yàn)中在干旱脅迫10天后，葉肉導(dǎo)度的下降幅度最大，其次為氣孔導(dǎo)度。干旱脅迫后Rubisco最大羧化速率(Vcmax)降為對(duì)照的35%(野生型)和19%(轉(zhuǎn)基因植株)，這可能是由于Rubisco酶活性降低導(dǎo)致的(Lawloretal.,2009)。而Rubisco最大羧化速率(Vcmax)和最大電子傳遞速率(Jmax)的下降幅度沒(méi)有氣孔導(dǎo)度(gs)和葉肉導(dǎo)度(gm)的下降幅度大，說(shuō)明光合作用的降低主要受到氣孔導(dǎo)度和葉肉導(dǎo)度的制約。復(fù)水1天后轉(zhuǎn)基因植株的葉肉導(dǎo)度迅速恢復(fù)，可能與其Vcmax和Jmax的恢復(fù)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，Vcmax的增加以響應(yīng)gm的降低可以促進(jìn)光合作用能力的提升，有助于復(fù)水期間光合作用能力的維持(Galleetal.,2011)。

3.2 葉綠素?zé)晒鈱?duì)干旱脅迫和復(fù)水的響應(yīng)

干旱脅迫后PtPIP1;3過(guò)表達(dá)植株的光化學(xué)淬滅(qp)、光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ФPSⅡ)，以及電子傳遞速率(Jflu)的下降幅度大于野生型，而且在復(fù)水第3天恢復(fù)到對(duì)照水平，野生型則沒(méi)有，反映了在復(fù)水條件下過(guò)表達(dá)植株光系統(tǒng)的恢復(fù)能力更強(qiáng)。結(jié)合氣體交換的數(shù)據(jù)來(lái)看，光合作用降低，用于光化學(xué)消耗的能量減少，所以熱量逐漸通過(guò)葉黃素(非光化學(xué)淬滅)消散(Demmig-Adamsetal.,2000)。如果干旱程度嚴(yán)重或持續(xù)時(shí)間很長(zhǎng)，植物就難以安全地消散額外的熱量，植物的光保護(hù)機(jī)制也會(huì)退化(Chavesetal.,2009)，這可能導(dǎo)致光系統(tǒng)Ⅱ性能受損(Kalajietal.,2016)，光合能力降低(Flexasetal.,2004)，直接影響光合電子傳遞和CO2的同化(云菲等,2010)。本研究中在嚴(yán)重干旱的情況下野生型84K楊的qp、ФPSⅡ及Jflu都下降，表明光系統(tǒng)Ⅱ的性能可能受損，且復(fù)水后不能恢復(fù)；而PtPIP1;3過(guò)表達(dá)植株在干旱期間也有損傷，但復(fù)水后能很快修復(fù)，說(shuō)明轉(zhuǎn)水通道蛋白基因的植株在復(fù)水后光系統(tǒng)Ⅱ的恢復(fù)速度更快，其機(jī)制尚不清楚。

3.3 干旱脅迫和復(fù)水期間光合作用限制因素分析

轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因植株在復(fù)水后很快恢復(fù)了葉肉導(dǎo)度，使得葉綠體內(nèi)CO2供應(yīng)充足，光合作用的光反應(yīng)和暗反應(yīng)(碳還原)相對(duì)平衡；而野生型植株的葉肉導(dǎo)度沒(méi)有及時(shí)恢復(fù)，CO2短缺，使得光反應(yīng)產(chǎn)生的還原力不能及時(shí)消耗，導(dǎo)致產(chǎn)生光氧化(Kozakietal.,1996)，使得光合系統(tǒng)受到損害，因而在復(fù)水期間恢復(fù)緩慢。之前筆者所在實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)(劉文鑫等,2019)發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫過(guò)程中野生型84K楊的光合速率降到最低時(shí)立即復(fù)水，葉肉導(dǎo)度完全恢復(fù)到對(duì)照水平，生物化學(xué)限制是復(fù)水期間光合作用的主要限制因素；而本研究在光合速率降到最低時(shí)少量補(bǔ)水，并繼續(xù)維持在最低點(diǎn)附近干旱處理3天，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因和野生型植株的葉肉導(dǎo)度沒(méi)有完全恢復(fù)并成為限制光合的主要因素之一。

分析光合限制因素發(fā)現(xiàn)，在干旱第10天，葉肉導(dǎo)度限制(lm)成為主要的限制因素。氣孔導(dǎo)度、葉肉導(dǎo)度和光合生物化學(xué)對(duì)光合的限制因物種而異，在干旱條件下光合作用的抑制首先是因?yàn)闅饪讓?dǎo)度和葉肉導(dǎo)度的降低，然后在更嚴(yán)重的干旱脅迫下光合作用中生物化學(xué)過(guò)程抑制增加(Flexasetal.,2009;Galleetal.,2009;Galmésetal.,2017;Grassietal.,2005)。而本研究中葉肉導(dǎo)度限制是干旱脅迫后期限制光合作用的主要因素。對(duì)復(fù)水的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，光合作用的恢復(fù)受葉肉導(dǎo)度限制影響最大，其次為光合作用中生物化學(xué)限制(lb)。本研究的結(jié)果與Galmés等(2007)的結(jié)果一致，即葉肉導(dǎo)度(gm)是嚴(yán)重干旱后限制光合作用恢復(fù)的主要因素。目前關(guān)于葉肉導(dǎo)度是嚴(yán)重干旱脅迫后主要限制因素的報(bào)道比較少。本研究強(qiáng)調(diào)了葉肉導(dǎo)度在楊樹(shù)干旱脅迫和復(fù)水后光合作用響應(yīng)方面的重要性，因此有必要進(jìn)一步了解葉肉導(dǎo)度的調(diào)節(jié)作用，尤其與環(huán)境和葉片解剖結(jié)構(gòu)相關(guān)的方面。

3.4 復(fù)水后PtPIP1;3基因促進(jìn)楊樹(shù)光合能力的恢復(fù)

從干旱第6天起，PtPIP1;3基因過(guò)表達(dá)植株的gs下降和恢復(fù)速度均大于野生型植株。Wang等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，MdPIP1;3基因增加番茄(Solanumlycopersicum)對(duì)干旱脅迫的忍耐，復(fù)水后轉(zhuǎn)基因植株迅速恢復(fù)，野生型死亡；轉(zhuǎn)基因番茄的氣孔在正常生長(zhǎng)條件下開(kāi)放更大，干旱12天后，77%的氣孔關(guān)閉，而野生型的有65%還在開(kāi)放，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株在響應(yīng)干旱脅迫時(shí)氣孔關(guān)閉比野生型快。轉(zhuǎn)基因植株的氣孔關(guān)閉迅速說(shuō)明耐旱性的增加部分是因?yàn)闇p少了水分流失，與本研究結(jié)果相同。在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因植株保衛(wèi)細(xì)胞迅速降低膨壓來(lái)關(guān)閉氣孔，以減少水分通過(guò)氣孔的流失。在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)NtAQP1和VfPIP1在鹽脅迫和干旱脅迫下改變轉(zhuǎn)基因植株的氣孔導(dǎo)度(Cuietal.,2008;Sadeetal.,2014)。轉(zhuǎn)MusaPIP1;2基因超表達(dá)的香蕉(Musaacuminata)在非生物脅迫(干旱、鹽和寒冷)后的恢復(fù)能力比非轉(zhuǎn)基因的更強(qiáng)(Sreedharanetal.,2013)。因此本研究的結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因的楊樹(shù)可能通過(guò)有效的氣孔關(guān)閉來(lái)減少蒸騰減少水分流失。另外，PtPIP1;3基因過(guò)表達(dá)也改變了復(fù)水后光合作用的恢復(fù)動(dòng)態(tài)。轉(zhuǎn)基因植株葉肉導(dǎo)度(gm)迅速恢復(fù)，使得復(fù)水初期主要是lb限制光合作用，隨著CO2供應(yīng)充足，葉綠體內(nèi)光反應(yīng)和暗反應(yīng)過(guò)程趨于平衡，光氧化降低、光合化學(xué)機(jī)制逐漸恢復(fù)，lb限制減弱；而野生型的相反，gm恢復(fù)緩慢，所以葉肉導(dǎo)度限制(lm)一直是主要的限制因子，另一方面，光合化學(xué)機(jī)制恢復(fù)也較慢，至復(fù)水第3天，lb仍相對(duì)較大。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)水通道蛋白基因及野生型84K楊進(jìn)行干旱及復(fù)水處理后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因84K楊的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率對(duì)干旱脅迫反應(yīng)更加敏感。在嚴(yán)重干旱時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的光合作用都主要受到葉肉導(dǎo)度的限制。與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株葉肉導(dǎo)度和光合作用在復(fù)水后恢復(fù)更迅速。在復(fù)水過(guò)程中，氣孔導(dǎo)度持續(xù)恢復(fù)，而葉肉導(dǎo)度和光合作用的生物化學(xué)過(guò)程交替恢復(fù)。此時(shí)，光合作用除了受到葉肉導(dǎo)度的主要限制外，還受到與Rubisco最大羧化速率(Vcmax)有關(guān)的生物化學(xué)特性的限制。