韓貝貝，張書飛，吳風(fēng)霞史榮君黃洪輝

1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510300

2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306

0 前言

近年來，藻華發(fā)生頻率增加、規(guī)模擴(kuò)大、危害加劇，已成為一個(gè)全球性的環(huán)境健康問題[1]。而中肋骨條藻(Skeletonema costatum)作為一種廣溫廣鹽性近岸硅藻，廣泛分布在我國沿海地區(qū)，每年在我國沿海都會(huì)引發(fā)藻華，對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重影響。因此，尋求一種有效的藻華治理方法顯得尤為迫切。

海洋中細(xì)菌是微生物種群的重要組成部分，與藻類共同調(diào)控海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[2]。在藻際環(huán)境中存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的菌藻互作關(guān)系，一方面，藻類對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的促進(jìn)或抑制:藻類為細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)；藻類也可以通過釋放抗菌物質(zhì)殺死部分細(xì)菌[3-4]，或通過抑制細(xì)菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)，抑制細(xì)菌的代謝[5]。另一方面，細(xì)菌對(duì)藻類生長(zhǎng)的促進(jìn)或抑制:細(xì)菌可以重新礦化藻源物質(zhì)為藻類的生長(zhǎng)提供無機(jī)營(yíng)養(yǎng)和必要的生長(zhǎng)因子[6]，包括氮[7]、磷[8]、維生素[9]、鐵載體[10]和生長(zhǎng)素[11]等；有些溶藻菌可以直接或間接地抑制藻類的生長(zhǎng)，甚至裂解藻細(xì)胞。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)雜的“藻—菌”關(guān)系在藻華的消亡過程中發(fā)揮著重要的作用。在藻華末期，溶藻菌的大量繁殖加速了藻華的衰退。溶藻菌的發(fā)現(xiàn)為藻華的控制提供了可能途徑，因此，海洋溶藻菌的溶藻作用成為藻華治理領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

目前，已有大量關(guān)于溶藻菌的研究和報(bào)道，但關(guān)于嗜鹽桿菌的溶藻研究還鮮有報(bào)道，以往大多數(shù)文獻(xiàn)是關(guān)于嗜鹽桿菌的分離與基因組序列分析研究的報(bào)道[12-13]，也有文獻(xiàn)報(bào)道該屬細(xì)菌在微生物工業(yè)發(fā)酵中的應(yīng)用[14]等，本實(shí)驗(yàn)室前期從深圳大鵬灣藻華爆發(fā)海域分離篩選到了一株嗜鹽桿菌(Halobacillus kuroshimensis，HSQAY1，Genbank 登陸號(hào) JX308828)[15]，該菌株為革蘭氏陽性、桿狀中等嗜鹽細(xì)菌，菌落呈圓形、黃橙色[12]。研究發(fā)現(xiàn)該菌株的上清液對(duì)中肋骨條藻具有強(qiáng)烈的溶藻作用，但對(duì)其溶藻作用機(jī)理尚不清楚。因此本研究以中肋骨條藻為研究對(duì)象，通過研究溶藻作用下中肋骨條藻細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、相關(guān)生理參數(shù)以及與氮代謝、抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活性等的變化，對(duì)其中的溶藻作用機(jī)理進(jìn)行了探討，研究結(jié)果將拓展我們對(duì)藻華過程中“藻—菌”關(guān)系的認(rèn)識(shí)，對(duì)藻華的生物治理具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 溶藻細(xì)菌及無菌上清液的制備

嗜鹽桿菌菌株HSQAY1于深圳大鵬灣藻華爆發(fā)海域分離并保藏[15]。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌落接種至100 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置活化24 h，再以1:100比例接種至2216E液體培養(yǎng)基中，28℃、160 rpm 振蕩培養(yǎng) 48 h，將培養(yǎng)后的菌液以6000 g離心20 min、0.22 μm濾膜過濾并用平板法檢驗(yàn)無菌后，獲得溶藻菌的無菌上清液(簡(jiǎn)稱上清液)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藻種及培養(yǎng)條件

中肋骨條藻由近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廈門大學(xué))海洋藻類保種中心提供。藻種經(jīng)活化后采用 f/2培養(yǎng)基[16]培養(yǎng)，溫度20℃，光照強(qiáng)度100 μE·m-2·s-1，光暗周期 14 h:10 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 上清液最適濃度的確定及樣品收集

隨著國家“一帶一路”戰(zhàn)略的實(shí)施，中國走向世界的步伐加快，文化的交流也顯得尤為重要，國際學(xué)術(shù)文化、知識(shí)資源的相互交流與促進(jìn)將成為科技發(fā)展的重要推動(dòng)劑。黨的十九大報(bào)告中指出推動(dòng)文化事業(yè)和文化產(chǎn)業(yè)發(fā)展，推進(jìn)國際傳播能力建設(shè)，講好中國故事，展現(xiàn)真實(shí)、立體、全面的中國，提高國家文化軟實(shí)力。而國家學(xué)術(shù)文化、科技文化的發(fā)展能夠展現(xiàn)國家科技的實(shí)力與水平。

上清液分別按2.5%、5%、7.5%、10%(v/v)添加至指數(shù)期的中肋骨條藻藻液中，對(duì)照組為未添加上清液的正常培養(yǎng)，另設(shè)置一組添加10%(v/v)的2216E培養(yǎng)基。各組每天相同時(shí)間取1 mL藻液，盧戈試劑染色后于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，最終根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線，確定最適的上清液處理濃度。

根據(jù)上清液最適濃度結(jié)果，取指數(shù)期的中肋骨條藻藻液，設(shè)置3組平行并分別加入5%(v/v)的上清液進(jìn)行培養(yǎng)，分別收集處理0 h、2 h、12 h、24 h的藻液，其中15 mL藻液用于細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察、15 mL藻液用于葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定、4 L藻液經(jīng)3 μm濾膜過濾，5000 g離心15 min后用于酶活性測(cè)定、20 mL藻液采用相同方法收集用于葉綠素a含量測(cè)定、200 mL藻液采用相同方法收集用于總氮含量測(cè)定。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

向收集的藻液中加入 0.5%(v/v)戊二醛固定，光學(xué)顯微鏡(AX10；Carl Zeiss Meditec AG)下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)并隨機(jī)選取50個(gè)細(xì)胞測(cè)量其單細(xì)胞長(zhǎng)度、單細(xì)胞直徑以及胞間支持突長(zhǎng)度。

1.2.3 總蛋白質(zhì)、葉綠素a及總氮含量的測(cè)定

總蛋白質(zhì)含量采用總蛋白含量測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程公司)測(cè)定。將藻細(xì)胞重懸于生理鹽水，4℃超聲波破碎。細(xì)胞勻漿以4000 g、4 ℃離心10 min后取上清液，根據(jù)試劑盒操作步驟測(cè)定總蛋白質(zhì)含量。

葉綠素a含量采用甲醇提取法進(jìn)行測(cè)定[17]。向收集的藻細(xì)胞中加入5 mL甲醇混勻，4 ℃避光萃取24 h后，7000 g離心5 min取上清，用酶標(biāo)儀(xMark；Bio-rad)測(cè)定上清液在750 nm、665 nm和652 nm波長(zhǎng)處的吸光度。葉綠素a含量(μg·mL-1)的計(jì)算公式:

其中，A652、A665和A750分別代表上清液在652 nm、665 nm和750 nm處的吸光度，葉綠素a含量的最終結(jié)果以每107個(gè)細(xì)胞中葉綠素a含量表示(μg·107cell-1)。

其中，VMeOH代表甲醇的體積(5 mL)，Vsample代表樣本的體積(20 mL)，X 代表藻細(xì)胞密度(cells·mL-1)。

細(xì)胞總氮含量參照Abreu等[18]的方法測(cè)定。將收集的藻細(xì)胞于60 ℃烘干24 h后稱其干重，烘干的樣品于研缽中磨成粉末狀，用35 mm×35 mm的錫紙將樣品包埋并精確稱重之后利用C/H/N/S/O元素分析儀(Vario ELIII；Elemetar Analysensysteme Gmbh)進(jìn)行測(cè)定(%)，最終結(jié)果以每 109個(gè)細(xì)胞中氮含量表示(mg·109cell-1)。

1.2.4 酶活性的測(cè)定

將收集的藻細(xì)胞重懸于相應(yīng)勻漿介質(zhì)中，4 ℃超聲波破碎后細(xì)胞勻漿以4000 g、4 ℃離心10 min，上清液即為粗酶液。細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)相關(guān)的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性以及細(xì)胞氮代謝相關(guān)的硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)及谷氨酰胺合成酶(GS)活性均采用相應(yīng)試劑盒(南京建成生物工程公司、北京百奧萊博科技有限公司)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定

藻細(xì)胞光合系統(tǒng) II(PS II)中的光合熒光效率使用超便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(MINI-PAM- II；Walz)測(cè)定。將收集的藻液暗處理30 min后測(cè)定最大量子產(chǎn)量Fv/Fm。在光化光條件下(光照強(qiáng)度設(shè)定為90 μmol·m-2·s-1)測(cè)定實(shí)際量子產(chǎn)量Y(II)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用one-way ANOVA(SPSS 22.0 for Windows)檢驗(yàn)各個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組之間的顯著性差異(p＜0.05)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度上清液對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，加入 10%(v/v)2216E培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的中肋骨條藻生長(zhǎng)趨勢(shì)無顯著差異(圖1)，表明2216E培養(yǎng)基不影響中肋骨條藻的正常生長(zhǎng)。而加入不同濃度上清液的處理組中，溶藻效果隨著上清液濃度的升高而增強(qiáng)，5%(v/v)上清液處理后24 h內(nèi)中肋骨條藻細(xì)胞處于抑制狀態(tài)且大部分細(xì)胞未破裂死亡，因此本研究選用5%(v/v)的上清液濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2 溶藻作用下細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

正常培養(yǎng)條件下，中肋骨條藻細(xì)胞呈鏈狀結(jié)構(gòu)，單細(xì)胞呈凸鏡或短圓柱狀(圖2a、2b)。上清液處理2 h后，藻細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與0 h無明顯變化，細(xì)胞鏈狀結(jié)構(gòu)及單細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整(圖2c、2d)。上清液處理12 h后，部分細(xì)胞鏈狀結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂，細(xì)胞多以短鏈或單細(xì)胞存在，同時(shí)發(fā)現(xiàn)少量細(xì)胞形成泡狀(圖2e-2h)。24 h后，細(xì)胞多以單體存在，少見鏈狀細(xì)胞，部分泡狀細(xì)胞發(fā)生破裂降解(圖2i-2l)。

圖1 不同濃度上清液處理下中肋骨條藻的生長(zhǎng)曲線Figure 1 Growth curves of Skeletonema costatum after treated with different amounts of bacterial supernatant

圖2 上清液處理?xiàng)l件下中肋骨條藻細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化Figure 2 Variation of Skeletonema costatum cells structure after treated with bacterial supernatant

溶藻作用下，單細(xì)胞長(zhǎng)度、單細(xì)胞直徑以及細(xì)胞間支持突長(zhǎng)度的測(cè)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3所示。上清液處理 2 h后，中肋骨條藻單細(xì)胞長(zhǎng)度顯著增加(p＜0.01)，12 h 后達(dá)到最大值，約為 0 h 組的 2.8 倍。而單細(xì)胞直徑和細(xì)胞間支持突長(zhǎng)度在各處理組間差異均不顯著。

圖3 上清液處理?xiàng)l件下中肋骨條藻細(xì)胞的大小變化Figure 3 Cell dimension variation of Skeletonema costatum after treated with bacterial supernatant

2.3 溶藻作用下藻細(xì)胞總蛋白質(zhì)、葉綠素a、總氮含量的變化

上清液處理2 h后，藻細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)、葉綠素a以及總氮含量與0 h組無顯著差異，而處理12 h和24 h后，藻細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)含量分別下降 44%和46%(p＜0.01)，葉綠素a含量分別下降48%和56%(p＜0.01)，總氮含量分別下降 41%和42%(p＜0.01)(圖4)。

2.4 溶藻作用下藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)、氮代謝相關(guān)酶活性的變化

上清液處理2 h后，細(xì)胞內(nèi)MDA含量與0 h組無顯著差異，而處理12 h后，藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量急劇升高，顯著高于 0 h 組(p＜0.01)。處理 24 h 后，藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量雖略有下降，但仍顯著高于0 h組(p＜0.05)(圖5a)。T-SOD活性在處理12 h后升高53%，顯著高于 0 h組(p＜0.05)。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，T-SOD活性繼續(xù)升高，24 h后活性達(dá)到0 h組的1.8倍(圖5b)。POD活性隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸升高的趨勢(shì)，各處理組均顯著高于0 h組(p＜0.05)且處理12 h和24 h后活性分別升高至0 h組的5.6倍和6.1倍(圖5c)。

溶藻作用下，各處理組NR、NiR的活性均顯著低于0 h組(p＜0.05)，而GS的活性在處理2 h時(shí)無顯著變化，但在處理 12 h及 24 h后均顯著降低(p＜0.01)(圖5d-5f)。

圖4 上清液對(duì)中肋骨條藻細(xì)胞蛋白質(zhì)、葉綠素 a、總氮含量的影響Figure 4 The effect of bacterial supernatant on the contents of protein, chlorophyll a and nitrogen of Skeletonema costatum cells

2.5 溶藻作用下藻細(xì)胞Fv/Fm、Y(II)的變化

溶藻作用下，各處理組藻細(xì)胞的Fv/Fm和Y(II)均顯著低于0 h組(p＜0.01)。處理2 h后，F(xiàn)v/Fm和Y(II)分別下降 9%和 19%，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)下降，處理24 h后，F(xiàn)v/Fm和Y(II)均下降42%(p＜0.01)(圖6)。

3 討論

3.1 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

研究表明，不同種屬的骨條藻細(xì)胞在形態(tài)上存在一定的差異[19]，相同種屬的骨條藻細(xì)胞長(zhǎng)度也可能隨生長(zhǎng)周期[20]或環(huán)境條件的變化而變化[21]。此外，當(dāng)骨條藻細(xì)胞進(jìn)入分裂期之后，細(xì)胞由于受到某些環(huán)境脅迫而無法分裂時(shí)細(xì)胞長(zhǎng)度也可能呈現(xiàn)增長(zhǎng)的狀態(tài)。如中肋骨條藻細(xì)胞在UVB紫外線脅迫條件下，細(xì)胞無法分裂且處于分裂之前的狀態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞長(zhǎng)度變長(zhǎng)[22]；Cu2+通過抑制硅藻細(xì)胞對(duì)硅的吸收利用，抑制細(xì)胞分裂，最終使細(xì)胞長(zhǎng)度增加[23]。類似的，本研究發(fā)現(xiàn)，溶藻作用下中肋骨條藻細(xì)胞單細(xì)胞長(zhǎng)度顯著增加，結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示5%(v/v)濃度的上清液處理下，24 h內(nèi)中肋骨條藻細(xì)胞數(shù)量處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)(圖1)，表明溶藻作用下藻細(xì)胞的分裂活動(dòng)受到抑制。因此，本研究中細(xì)胞長(zhǎng)度的增加可能是由于溶藻物質(zhì)抑制了細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞周期相關(guān)的代謝過程，或直接作用于細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)過程而使細(xì)胞周期停止，細(xì)胞無法分裂而一直處于分裂前細(xì)胞增長(zhǎng)的狀態(tài)。

3.2 氧化脅迫與藻細(xì)胞完整性

圖5 上清液對(duì)中肋骨條藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)、氮代謝相關(guān)酶活性的影響Figure 5 The effect of bacterial supernatant on the activity of antioxidant and nitrogen metabolism enzymes of Skeletonema costatum cells

圖6 上清液對(duì)中肋骨條藻細(xì)胞Fv/Fm、Y(II)的影響Figure 6 The effect of bacterial supernatant on the Fv/Fm and Y(II) of Skeletonema costatum cells

活性氧(ROS)是細(xì)胞內(nèi)一類信號(hào)分子，在光合生物中主要由光合作用和呼吸作用等代謝過程產(chǎn)生，包括超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫等[24]。細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和清除通常處于平衡狀態(tài)，但外界條件的刺激可打破這種平衡而使細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS，從而引起脂質(zhì)過氧化，對(duì)細(xì)胞膜造成氧化損傷，破壞細(xì)胞膜的完整性與通透性。如 Liu等[25]發(fā)現(xiàn)添加抗生素后，中肋骨條藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量ROS，破壞了細(xì)胞膜的完整性與通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) pH增加以及細(xì)胞膨脹。Qian等[26]研究了鏈霉素對(duì)小球藻和銅綠微囊藻生理指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示ROS含量增加的同時(shí)MDA含量以及電解液滲透量均增加，表明過量ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷，致使細(xì)胞膜通透性增大?？宗S等[27]同樣發(fā)現(xiàn)在溶藻菌無菌濾液處理后，銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi) ROS含量增加，細(xì)胞膜完整性受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)K+和Ca2+外滲。吳培楓等[28]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)東海原甲藻受到溶藻菌 DH-e脅迫后，細(xì)胞ROS含量會(huì)急劇上升，同時(shí)，MDA含量增加，SOD活性增強(qiáng)。管偉城等[29]在溶藻菌 LP-10溶藻機(jī)制的研究中也得到類似的結(jié)果:LP-10能夠刺激球形棕囊藻細(xì)胞產(chǎn)生過量 ROS，細(xì)胞內(nèi)部氧化水平升高，抗氧化系統(tǒng)中的SOD和POD等酶活性出現(xiàn)不同程度的升高，與本文研究結(jié)果相似。本研究中，溶藻作用下中肋骨條藻細(xì)胞 MDA 含量、SOD和POD的活性均顯著升高。SOD和POD活性的升高表明溶藻物質(zhì)刺激中肋骨條藻細(xì)胞產(chǎn)生了過量的ROS。而MDA含量的顯著升高則說明ROS已對(duì)細(xì)胞膜內(nèi)脂質(zhì)造成損傷效應(yīng)，因?yàn)?MDA 是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，也是衡量細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)，間接反映了細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損傷程度[30]。另外，光學(xué)顯微鏡的觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在溶藻作用后期，中肋骨條藻細(xì)胞原生質(zhì)體會(huì)在細(xì)胞一端形成泡狀并逐漸膨脹破裂(圖2)。因此本研究推測(cè)溶藻作用發(fā)生的原因之一可能是由于中肋骨條藻細(xì)胞的細(xì)胞膜受到過量的ROS損傷而通透性發(fā)生變化，大量胞外物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)而使細(xì)胞膨脹破裂死亡。相關(guān)文獻(xiàn)也有類似的報(bào)道[31]。

3.3 溶藻物質(zhì)對(duì)中肋骨條藻細(xì)胞氮代謝的影響

氮是浮游植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要營(yíng)養(yǎng)元素，而硝態(tài)氮是藻類利用的主要形式[32]。硝態(tài)氮首先通過硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞[33]，再通過 NR和NiR的催化轉(zhuǎn)化為能被細(xì)胞直接利用的銨態(tài)氮[34]，隨后在 GS等酶的催化反應(yīng)下完成氨的同化，為葉綠素、核酸和蛋白質(zhì)等富氮化合物的合成提供原料[35]。在這一系列過程中，NR、NiR和GS是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶，在氮代謝過程中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，溶藻作用下中肋骨條藻細(xì)胞內(nèi) NR、NiR、GS的活性均顯著降低，表明溶藻物質(zhì)抑制了藻細(xì)胞對(duì)氮的吸收利用，而這一抑制作用也可能影響了葉綠素、蛋白質(zhì)等富氮化合物的合成，導(dǎo)致處理組中葉綠素a、總蛋白質(zhì)以及細(xì)胞總氮含量均顯著低于 0 h組(圖4)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)氮是藻類細(xì)胞分裂繁殖過程中的重要元素，因此，本研究中，氮的吸收利用受到抑制也可能是溶藻作用發(fā)生的一個(gè)原因，溶藻作用下中肋骨條藻細(xì)胞氮代謝過程受阻，細(xì)胞因缺氮而無法分裂。高越等[36]和Olson等[37]研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，在氮限制條件下，藻細(xì)胞分裂受到抑制，細(xì)胞周期停滯于G1期或G2/M期。

3.4 溶藻物質(zhì)對(duì)中肋骨條藻細(xì)胞光合系統(tǒng)的影響

光合作用是藻細(xì)胞中的重要代謝過程之一，為藻細(xì)胞提供有機(jī)物質(zhì)和能量，光合作用的強(qiáng)弱直接影響著藻細(xì)胞的正常生長(zhǎng)[38]。葉綠素a在光能收集和能量轉(zhuǎn)換過程中起著重要的作用，常被用來評(píng)估藻細(xì)胞對(duì)環(huán)境脅迫反應(yīng)的程度。Fv/Fm表示藻細(xì)胞PS II中的潛在最大光合能力，反映藻細(xì)胞最大光能轉(zhuǎn)換效率，可作為反映光合作用變化的重要指標(biāo)[39]，而 Y(II)表示藻細(xì)胞的實(shí)際光合效率。傅麗君等[40]研究發(fā)現(xiàn)在溶藻細(xì)菌 BS03上清液處理后，塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素a含量和Fv/Fm隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加呈逐漸下降趨勢(shì)，與本文研究結(jié)果相似。本研究中，溶藻作用下，藻細(xì)胞的葉綠素a 含量(圖4b)、Fv/Fm 和 Y(II)均顯著下降(圖6)，表明溶藻物質(zhì)對(duì)藻細(xì)胞的光合系統(tǒng)可能造成了一定的損傷。研究表明，光化學(xué)反應(yīng)和電子傳遞主要依賴于類囊體上的電子載體以及相關(guān)酶的移動(dòng)，光合作用受類囊體結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性的影響[41]，而過量的 ROS會(huì)對(duì)光合系統(tǒng)包括類囊體等造成氧化損傷，從而影響藻細(xì)胞的光合作用[42-43]。因此，本研究中 Fv/Fm和Y(II)被顯著抑制可能與類囊體膜受氧化損傷而不完整有關(guān)，MDA含量的顯著升高也間接地印證了這一推斷。Yang等[24]也認(rèn)為靈菌紅素是通過破壞銅綠微囊藻類囊體膜的完整性而使光合作用功能受損。此外，氮對(duì)藻細(xì)胞光合作用中光反應(yīng)和暗反應(yīng)的一系列酶的活性也有重要影響，在一定范圍內(nèi)，藻細(xì)胞的光合速率與氮的營(yíng)養(yǎng)水平呈正相關(guān)[44]。因此，溶藻作用下，中肋骨條藻細(xì)胞內(nèi)氮含量的降低也可能是藻細(xì)胞光合速率下降的原因之一。

4 結(jié)論

本研究以中肋骨條藻為研究對(duì)象，通過顯微觀察以及對(duì)相關(guān)生理參數(shù)及酶活性的測(cè)定，探討了嗜鹽桿菌HSQAY1對(duì)中肋骨條藻的溶藻作用機(jī)理。根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)嗜鹽桿菌上清液中的溶藻物質(zhì)可顯著抑制中肋骨條藻對(duì)氮的吸收利用，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、葉綠素a等重要生命物質(zhì)的合成受阻，細(xì)胞的正常代謝過程受到抑制，最終細(xì)胞分裂活動(dòng)停止。同時(shí)溶藻物質(zhì)的脅迫刺激中肋骨條藻細(xì)胞產(chǎn)生過量的活性氧，細(xì)胞膜系統(tǒng)受到氧化損傷而使其通透性發(fā)生變化，大量胞外物質(zhì)透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞最終膨脹破裂死亡。