井 然， 侯 欣， 肖 盟， 康 梅， 陳淑蘭， 李若瑜， 羅燕萍， 孫自鏞， 廖 康，馮羨菊， 胡志東， 潘玉紅0，褚云卓，梅亞寧，劉文恩，楊 青，蘇丹虹，鄒桂玲，俞云松，劉麗文，胡辛蘭，周鐵麗0，張 嶸，喻 華，邵海楓，倪語星，王 勇，宋秀蘭，侯鐵英，呂火祥，徐修禮，張智潔0，賈 偉，李克誠，馬 玲，李國雄，鄧林強(qiáng)，孟 靈，宋衛(wèi)青，徐元宏，王 晶，許小敏0，張 瓊，章強(qiáng)強(qiáng)，楊 濱，雷金娥，徐英春

近年來對(duì)侵襲性念珠菌病的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌是引起侵襲性念珠菌病的主要病原體，但非白念珠菌的分離率逐漸升高且耐藥率往往高于白念珠菌，特別是光滑念珠菌對(duì)唑類藥物的敏感性逐漸降低[1-2]。對(duì)侵襲性酵母病患者進(jìn)行準(zhǔn)確診斷和早期合理的抗真菌治療至關(guān)重要[3-4]。本研究收集2010－2014年中國侵襲性真菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)（CHIF-NET）成員單位重癥監(jiān)護(hù)室（ICU） 侵襲性酵母菌株，對(duì)菌株進(jìn)行菌種復(fù)核鑒定；同時(shí)，分析其對(duì)唑類藥物的敏感性，為我國侵襲性酵母感染的臨床診治提供參考依據(jù)[5]。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究的菌株均來自CHIF-NET 2010－2014年62所監(jiān)測(cè)中心ICU分離到的所有引起侵襲性感染的酵母，共計(jì)2 863株。標(biāo)本類型包括血液、腹水、腦脊液、胸水等無菌體液。

1.2 菌種復(fù)核鑒定

以法國生物梅里埃公司的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）鑒定為主，與分子生物學(xué)方法相結(jié)合，對(duì)酵母rDNA的ITS區(qū)域或28S rRNA的D1/D2區(qū)測(cè)序，從而對(duì)酵母進(jìn)行菌種復(fù)核鑒定，并比較菌株的復(fù)核鑒定正確 率。

1.3 藥物敏感性檢測(cè)

依據(jù)CLSI M60紙片擴(kuò)散法中現(xiàn)有的一些常見念珠菌的藥敏折點(diǎn)對(duì)兩種唑類藥物氟康唑和伏立康唑的藥敏結(jié)果進(jìn)行判讀[6]，對(duì)沒有藥敏折點(diǎn)的其他酵母，則依據(jù)CLSI M44-S3標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判讀[7]。近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258作為藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌株[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。連續(xù)變量的比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)；類別變量的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌種分布

收集5年間來自中國62所監(jiān)測(cè)中心ICU的菌株，總計(jì)2 863株。其中，念珠菌屬2 771株，占96.8%；隱球菌屬39株，占1.4%；毛孢子菌屬17株，占0.6%；其他非常見酵母36株，占1.3%。在念珠菌屬中，最終復(fù)核鑒定到22個(gè)種 /復(fù)合體；其中，常見念珠菌屬中以白念珠菌為主，占44.5%（1 234/2 771）；其次是熱帶念珠菌，占16.9%（467/2 771）；近平滑念珠菌和光滑念珠菌分別占18.6%（515/2 771）和12.3%（340/2 771）。在隱球菌屬中，新型隱球菌復(fù)合體占9 4.9%（37/39）；其次，在毛孢子菌屬中，以阿薩希毛孢子菌為主，占76.5%（13/17）；其他非常見酵母中，以膠紅酵母為主，占47.2%（17/36）。

2.2 菌種復(fù)核鑒定情況

對(duì)2 863株酵母進(jìn)行質(zhì)譜和分子測(cè)序復(fù)核鑒定，結(jié)果顯示復(fù)核鑒定結(jié)果正確率為86.2%（2 467/2 863），錯(cuò)誤率為11.6%（332/2 863），其余64株菌復(fù)核鑒定的結(jié)果存在不確定性，占2.2%。白念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和新型隱球菌復(fù)合體的復(fù)核鑒定正確率較高（83.7%～97.8%）。但其余352株罕見酵母的復(fù)核鑒定正確率僅為40.3%（142/352）。

2.3 標(biāo)本類型分布

2 863株酵母分離自血液等12種無菌體液標(biāo)本，50.8%（1 453/2 863）菌株分離自血液，其次分離自腹水（22.1%，632/2 863）和靜脈導(dǎo)管（9.2%，263/2 863）。念珠菌屬中1 404株分離自血液，占血液標(biāo)本的96.6%，其他無菌體液標(biāo)本也分離出念珠菌屬，如腹水（621/632，98.3%）、靜脈導(dǎo)管（259/263，98.5%）等；其次，48.7%（1 9/3 9）隱球菌屬分離自腦脊液；6 4.7%（11/17）和23.5%（4/17）毛孢子菌屬分別分離自血液和腹水。ICU分離的侵襲性酵母菌種標(biāo)本類型分布見表1。

2.4 酵母對(duì)唑類藥物敏感性

對(duì)2 863株酵母的唑類藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，白念珠菌對(duì)氟康唑和伏立康唑敏感，敏感率＞99.0%；近平滑念珠菌對(duì)氟康唑耐藥率為8.7%（45/515），對(duì)伏立康耐藥率較低，為4.7%（24/515）；相比之下，光滑念珠菌對(duì)氟康唑耐藥率較高，為21.8%（74/340）；熱帶念珠菌對(duì)氟康唑和伏立康唑的耐藥率較高，均為14.1%（66/467）?？巳崮钪榫鷮?duì)氟康唑天然耐藥[6]；94.6%（35/37）克柔念珠菌對(duì)伏立康唑敏感，5.4%（2/37）中介。見表2。

非念珠菌屬中，新型隱球菌復(fù)合體對(duì)伏立康唑全部敏感；除黏性絲包酵母（Trichosporon mucoides）和弗比恩畢赤酵母（Pichia fabianii）等對(duì)氟康唑和伏立康唑全部敏感外，其他酵母對(duì)氟康唑和伏立康唑耐藥率整體較高，分別為43.6% （24/55）和32.7% （18/55）。見表2。

在氟康唑耐藥的熱帶念珠菌中，有98.5%（65/66）對(duì)伏立康唑也耐藥；鏈狀念珠菌和膠紅酵母也出現(xiàn)交叉耐藥。

表1 2 863 株ICU 侵襲性酵母菌種標(biāo)本類型分布及構(gòu)成比Tab1e 1 Specimen distribution of 2863 strains of invasive yeast isolates from ICUs in terms of species[n（ %）]

表2 2 863 株ICU 侵襲性酵母對(duì)氟康唑和伏立康唑的耐藥性歷年變化趨勢(shì)Table 2 Changing resistance profile of 2 863 strains of ICU-derived invasive yeasts to fluconazole and voriconazole

2010－2014年5年間變化趨勢(shì)顯示，熱帶念珠菌對(duì)氟康唑和伏立康唑的耐藥率顯著升高，均從12.2%升至23.1%（P＜0.01）；光滑念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥率也顯著升高，從14.7%升至27.7%（P＜0.01）。

2013年開始分離出對(duì)氟康唑耐藥的新型隱球菌復(fù)合體（見表2）和毛孢子菌屬；2014年開始分離出對(duì)伏立康唑耐藥的毛孢子菌屬。

3 討論

ICU患者發(fā)生念珠菌血癥和侵襲性念珠菌病可導(dǎo)致高病死率（35%～67%）[8]，一項(xiàng)北美研究顯示念珠菌血癥患者會(huì)發(fā)生感染性休克和多器官功能衰竭，且60%因念珠菌血癥導(dǎo)致感染性休克的患者在28 d內(nèi)的病死率高[9]。美國和西班牙監(jiān)測(cè)研究顯示ICU發(fā)生念珠菌血癥的患者占總共納入研究的念珠菌血癥患者的1/3[10-11]；從2004－2006年，英國每10 000例ICU患者中有4.9%～9.1%為侵襲性念珠菌病患者[12]。免疫抑制的ICU危重患者念珠菌血癥和侵襲性念珠菌病的危險(xiǎn)因素包括長(zhǎng)期接受化療，使用廣譜抗生素，植入中心靜脈導(dǎo)管、留置針，接受腎透析、呼吸機(jī)和腸外營(yíng)養(yǎng)等[8]。一項(xiàng)從2007－2016年法國尼姆大學(xué)附屬醫(yī)院的ICU念珠菌菌種分布研究顯示，分離出的念珠菌屬占總分離菌株的96%，以白念珠菌為主（55.8%），其次是光滑念珠菌占14.4%，熱帶念珠菌占10%。其中，43%和22.1%念珠菌分別分離自腹水和血液[13]，以腹腔內(nèi)感染為主。與法國的研究相比，本研究結(jié)果顯示我國ICU侵襲性真菌感染分離菌株以念株菌屬為主，主要分離自血液標(biāo)本。

本研究中菌種復(fù)核鑒定的正確率為86.2%，特別是罕見菌種的復(fù)核鑒定正確率較低。質(zhì)譜結(jié)合分子測(cè)序方法復(fù)核鑒定酵母菌種在CHIF-NET研究中發(fā)揮重要作用，但由于價(jià)格昂貴，缺乏標(biāo)準(zhǔn)方法和質(zhì)量控制等，對(duì)于基層醫(yī)院全面開展存在一定困難。對(duì)于鑒定結(jié)果不確定或難鑒定的菌種，可通過分子生物學(xué)方法進(jìn)行復(fù)核鑒定。

5年間，白念珠菌對(duì)兩種唑類藥物保持高度敏感，而熱帶念珠菌和光滑念珠菌的耐藥率顯著升高；克柔念珠菌對(duì)氟康唑天然耐藥[6]，對(duì)伏立康唑基本敏感；熱帶念珠菌、鏈狀念珠菌和膠紅酵母出現(xiàn)交叉耐藥。逐漸出現(xiàn)新型隱球菌復(fù)合體對(duì)氟康唑耐藥，這與CHIF-NET（2009－2014年）的一項(xiàng)新型隱球菌復(fù)合體藥敏結(jié)果分析一致[14]。目前，CLSI M60的紙片擴(kuò)散法[6]僅對(duì)白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌有藥敏折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于其他念珠菌還需依據(jù)CLSI M44-S3來判斷[7]；此外，紙片擴(kuò)散法中沒有流行病學(xué)界值，無法判斷野生型和非野生型；基于紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法有較好的相關(guān)性[15-16]，所以只能參照CLSI M44-S3來判斷非念珠菌屬的藥敏結(jié)果。

綜上所述，念珠菌屬是我國ICU侵襲性真菌感染的主要酵母，以血流感染為主；5年間，白念珠菌是最常見的侵襲性念珠菌，但氟康唑和伏立康唑?qū)ζ渥饔梅浅ｏ@著；而非白念珠菌的耐藥率有不同程度的升高及交叉耐藥的出現(xiàn)，臨床需要加以重視。本研究結(jié)果有助于我國臨床醫(yī)師合理地篩選抗真菌藥物，針對(duì)性治療ICU侵襲性酵母感染的患 者。