江虹，龐向東，向杰

(長江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，重慶, 408100)

食品添加劑已成為現(xiàn)代食品工業(yè)的重要組成部分，是食品工業(yè)技術(shù)進步和科技創(chuàng)新的重要推動力。山梨酸(sorbic acid)和苯甲酸(benzoic acid)均為食品添加劑，是目前食品業(yè)應(yīng)用最為廣泛的防腐劑。在食品生產(chǎn)、加工及儲藏過程中，為了防止微生物的生長、繁殖，延長食品的保質(zhì)期，常加入山梨酸或苯甲酸或二者的混合物。而其中的山梨酸是國際公認(rèn)的具有低毒及高效抗菌性能的防腐劑，其抑菌效果優(yōu)于苯甲酸，毒性只有苯甲酸的1/4，目前，山梨酸是食品業(yè)發(fā)展?jié)摿ο鄬^好的一種防腐劑。盡管如此，當(dāng)過量攝入山梨酸時也會引起某些較嚴(yán)重的副作用(如對皮膚、黏膜的刺激性和接觸性皮炎等)，給人們的健康造成一定危害，為此，世界各國對食品中山梨酸的含量均做出了嚴(yán)格限定，我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB2760 規(guī)定飲料中山梨酸的最大使用量為0.5 g/kg，糕點中山梨酸的最大使用量為1.0 g/kg。鑒于此，研究食品中山梨酸含量的檢測方法有著重要意義。近年，國內(nèi)外對山梨酸的檢測方法主要有：高效液相色譜法[1-5], 氣相色譜法[6-7]，氣-質(zhì)聯(lián)用法[8-11]、液-質(zhì)聯(lián)用法[12-17]、電化學(xué)法[18-19]和紫外-可見分光光度法[20-23]等。前4 種方法有高的準(zhǔn)確度，但分析成本較高，前處理工作也較繁雜；電化學(xué)法條件要求較為苛刻；紫外-可見分光光度法簡便、快速，長期以來深受分析工作者的喜愛，但他的靈敏度通常不高，選擇性欠佳，尤其是用于食品分析時，更需考慮選擇性這一重要條件。在食品生產(chǎn)中，為了延長保質(zhì)期，可能不止添加一種防腐劑，苯甲酸和山梨酸是最常用的2種防腐劑，可能共存于某食品中(苯甲酸可能干擾山梨酸的測定)，這樣一來，要想單獨測定某一物質(zhì)，就得采用分離、掩蔽等其他措施，使操作復(fù)雜化。本工作通過試驗找到了一種不需分離苯甲酸即可直接測定山梨酸的方法，目前尚未見文獻報道。本方法以三苯甲烷染料堿性紫作探針，在紫外光區(qū)及一定酸性條件下，采用單波長、雙波長或三波長紫外吸收光譜法來研究食品中山梨酸的檢測方法，實驗表明，在某一酸度和某一波長下，共存的苯甲酸不會干擾山梨酸的測定，從而實現(xiàn)不用分離苯甲酸就可直接測定山梨酸的目的。本方法有較高的靈敏度，是文獻[23] 的1.7～7.6 倍，且簡便、快速，適于飲料及糕點中山梨酸的定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

堿性紫(basic violet，BSV,99%)，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)：99.9%，上海吉至生化科技有限公司；HCl(AR級)，重慶川東(化工)集團有限公司；山梨酸(SBA,99.8%)，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；苯甲酸(BZA,≥99%)，成都化夏化學(xué)試劑有限公司；水,超純水;糕點(蛋糕1#、2#)，飲料(葡萄汁3#、尖叫4#、可口可樂5#、營養(yǎng)快線6#)，市售。

堿性紫溶液：1.00×10-3mol/L 水溶液；山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量山梨酸(精確至±0.000 1 g)于小燒杯中，加少許無水乙醇，攪拌，使其溶解，再用水定容，貯備液為1.00×10-3mol/L，操作液為1.00×10-4mol/L。苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量苯甲酸(精確至±0.000 1 g)于小燒杯中，加少許無水乙醇，待其溶解后，用水定容，配成貯備液為1.00×10-3mol/L，操作液為1.00×10-4mol/L；三羥甲基氨基甲烷溶液：0.20 mol/L 水溶液；HCl溶液：0.10 mol/L 水溶液；Tris-HCl 溶液：pH 3.0～9.2(用pH 計測定HCl 和Tris 的混合液)。

1.2 儀器與設(shè)備

EL104型電子天平，上海精密儀器儀表有限公司；pHS-3C 精密酸度計，上海虹益儀器儀表有限公司；KQ-200VDE 超聲波清洗機,昆山市超聲儀器有限公司；TD5A-WS型離心機,湖南湘儀離心機儀器有限公司；U-3010型紫外-可見分光光度計,日本日立公司。

1.3 樣品處理

1.3.1 糕點

準(zhǔn)確稱取粉碎、混勻后的1# 和2# 樣品各25～30 g(精確至±0.000 1 g)，加適量水，攪拌，40 ℃ 水浴超聲提取20～30 min，于4 000 r/min 離心分離5～10 min，清液用水定容至100 mL，搖勻，待用。

1.3.2 非乳飲料

準(zhǔn)確移取3#～5# 飲料樣品各10 mL，于40 ℃水浴超聲20～30 min，取出冷至室溫后用水定容至100 mL，搖勻，待用。

1.3.3 乳飲料

準(zhǔn)確移取6# 樣品10.00 mL于小燒杯中，加20 mL 無水乙醇(沉淀蛋白質(zhì))，攪拌5 min，超聲提取20～30 min，4 500 r/min 離心分離5～10 min，清液移入100 mL 容量瓶中，用水定容，待用。

1.4 實驗方法

于10 mL 比色管中，準(zhǔn)確依次加入一定量的山梨酸標(biāo)準(zhǔn)操作液、1.00 mL pH 3.25 Tris-HCl 溶液及1.50 mL 堿性紫溶液，用水稀至刻度，搖勻，15 min 后，在紫外-可見分光光度計上，掃描吸收光譜(以試劑空白作參比)，分別在紫外區(qū)測定254 nm、305 nm 及223 nm 處的吸光度A。

2 結(jié)果與分析

2.1 SBA-BSV 與BZA-BSV 的吸收光譜特征比較

圖1是山梨酸-堿性紫體系與可能共存的苯甲酸-堿性紫體系的紫外吸收光譜圖，表1 是兩體系的吸收光譜特征比較。由圖1可知，堿性紫溶液在紫外光區(qū)吸收信號較弱(在可見光區(qū)有很強的吸收信號)，他們的吸收峰分別位于594 nm、306 nm 及223 nm，如曲線1所示。山梨酸溶液自身和苯甲酸溶液自身在可見光區(qū)幾乎無吸收，在紫外光區(qū)有較強吸收，最大吸收峰分別位于的256 nm 和226 nm，如曲線2和曲線3 所示。當(dāng)在山梨酸的酸性溶液(pH 3.25 Tris-HCl 溶液)中加入一定濃度的堿性紫溶液后，在可見光區(qū)出現(xiàn)2個吸收強度不大的吸收峰(峰位見表1)，在紫外光區(qū)則出現(xiàn)3個具有較強吸光度的吸收峰，分別位于254 nm(紫移340 nm)、305 nm(紫移289 nm)和223 nm(紫移371 nm)，曲線5～10所示，且在這3個峰處，隨著山梨酸濃度的增大，吸光強度逐漸增強，山梨酸在一定濃度范圍內(nèi)，其濃度與體系的吸光強度A呈線性關(guān)系，并服從朗伯-比爾定律。而可能與山梨酸-堿性紫體系共存的苯甲酸-堿性紫體系在同條件下的紫外光區(qū)的吸收光譜見曲線4，可知，在山梨酸-堿性紫體系的3個特征吸收峰(254 nm、305 nm 和223 nm)處，苯甲酸-堿性紫體系的吸收強度很弱，借此可以直接測定山梨酸，共存的苯甲酸不干擾。兩體系的其他吸收特征見表1。

由上可知，在紫外光區(qū)及pH 3.25 Tris-HCl 介質(zhì)存在下，山梨酸-堿性紫體系在紫外光區(qū)的254 nm、305 nm 及223 nm處，有較強的吸光強度，并遵從朗伯-比爾定律，而同條件下的苯甲酸-堿性紫體系在紫外光區(qū)的254 nm、305 nm 及223 nm處的吸收很弱。故在這3 個波長處，可以不經(jīng)分離，直接定量檢測與苯甲酸共存的山梨酸。

1-2.00×10-5 mol/L 堿性紫, 水作參比; 2-1.00×10-5 mol/L苯甲酸, 水作參比; 3-1.00×10-5 mol/L 山梨酸, 水作參比;4-1.00×10-5 mol/L 苯甲酸-1.50×10-4 mol/L 堿性紫,試劑空白作參比；5～10-(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20)×10-5 mol/L山梨酸-1.50×10-4mol/L堿性紫，試劑空白作參比；pH3.25圖1 山梨酸-堿性紫體系及苯甲酸-堿性紫體系的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of sorbic acid-basic violet systems and benzoic acid-basic violet systems

表1 山梨酸-堿性紫體系與苯甲酸-堿性紫體系吸收光譜特征Table 1 Absorption spectrum characteristics of sorbic acid- basic violet system and benzoic acid- basic violet system

注：—表示無

若要提高方法的靈敏度，可在254 nm、305 nm 及223 nm處，采用雙波長或三波長吸收光譜法來定量檢測有苯甲酸共存時的山梨酸(依據(jù)吸光度的加和性)，其靈敏度可提高到1.5～4.4 倍。

2.2 反應(yīng)條件

2.2.1 溶液酸度及用量的選擇

室溫下，以254 nm為例，考察了山梨酸-堿性紫體系及可能與之共存的苯甲酸-堿性紫體系在同條件下，不同pH值的Tris-HCl 溶液在254 nm處對不同體系締合物吸光度A的影響，見圖2。由圖2可知，山梨酸-堿性紫體系在pH 3.25 Tris-HCl 條件下，有相對較強的吸光度，此時靈敏度也相對較大。而苯甲酸-堿性紫體系在254 nm處，當(dāng)pH在3.5～9.2時，酸度對體系負吸光度有較大影響，只有當(dāng)pH<3.5時，體系基本不受酸度的影響(締合物的吸收強度十分微弱)，故在pH<3.5的條件下測定山梨酸，共存的苯甲酸不會干擾測定。由此說明，嚴(yán)格控制溶液的酸度(pH <3.5)，即可實現(xiàn)不分離苯甲酸而直接定量檢測山梨酸的目的。

隨即又考察了254 nm 處，pH 3.25 Tris-HCl 溶液用量0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL時對山梨酸-堿性紫體系吸光度的影響，結(jié)果表明，用量為1.00 mL 時，體系有相對較大的吸光度，靈敏度也相對較高。故后續(xù)實驗用pH 3.25 Tris-HCl 溶液1.00 mL。

圖2 Tris-HCl溶液 pH 對締合物A的影響Fig.2 Effect of Tris-HCl solution pH on association A

圖3 BSV溶液濃度對締合物A的影響Fig.3 Effect of BSV solution concentration on association A

2.2.2 堿性紫溶液濃度的選擇

室溫下，考察了254 nm、305 nm 及223 nm 處堿性紫溶液用量為0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL 時對山梨酸-堿性紫體系生成的締合物吸光度A的影響，見圖3?？芍谶@三波長處，堿性紫溶液用量為1.50 mL 時，吸光度相對較大，即堿性紫溶液濃度為1.50×10-4mol/L 時，體系有相對較高的靈敏度。當(dāng)堿性紫溶液用量大于1.50 mL 時，因用量過大而使自身聚集作用增強，從而導(dǎo)致吸光強度降低；當(dāng)堿性紫溶液用量小于1.50 mL 時，因用量不夠，使山梨酸反應(yīng)不完全，致使吸光度有所降低。故后續(xù)實驗用1.50 mL 堿性紫溶液。由圖3 還可看出，以254 nm 作為單波長法的測定波長時，靈敏度相對最高，其次是223 nm。若采用雙波長(254 nm+305 nm 或254 nm+223 nm)法或三波長(254 nm+305 nm+223 nm)法測定，靈敏度均較單波長法高(見表2)。

2.2.3 試劑加入順序的選擇

室溫下，以雙波長(254 nm+305 nm)法為例，考察1.00 mL 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)操作液、1.50 mL 堿性紫溶液及1.00 mL pH 3.25 Tris-HCl溶液在不同加入順序時對山梨酸-堿性紫體系締合物吸光度A的影響，結(jié)果表明，這幾種物質(zhì)的先后加入順序?qū)w系靈敏度有一定影響。實驗表明，靈敏度相對較高時的加入順序為：山梨酸溶液、Tris-HCl溶液、堿性紫溶液。后續(xù)實驗按物質(zhì)的最佳加入順序進行。

2.2.4 反應(yīng)速度及締合物的穩(wěn)定性

室溫下，考察了254 nm、305 nm 及223 nm 處，山梨酸與堿性紫溶液的反應(yīng)時間對體系締合物A的影響。實驗顯示，在這3 個波長處，反應(yīng)在15 min 內(nèi)均可進行完全，15 min 時，吸光度達最大，之后至80 min 內(nèi)，吸光度基本不變，80 min 后，吸光度逐漸下降。這些現(xiàn)象表明，締合物的穩(wěn)定時間約為1 h。后續(xù)實驗選在締合物的穩(wěn)定時間內(nèi)進行。

2.3 山梨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法的靈敏度

準(zhǔn)確移取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)操作液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL 于10 mL比色管中，再加入前述選定條件的其他試劑溶液，配制山梨酸的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，掃描吸收光譜，在254 nm、305 nm及223 nm處，作單波長法、雙波長法及三波長法測定時的各標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。方法的靈敏度及其他相關(guān)參數(shù)見表2。從表可知，用單波長法、雙波長法及三波長法測定的靈敏度順序為：三波長法>雙波長法>單波長法。

圖4 山梨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of sorbic acid

2.4 干擾試驗

表2 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)Table 2 Related parameters of standard curves of sorbic acid

2.5 樣品分析

取1#～6# 待測液各2.00 mL，按實驗方法配制溶液后，以雙波長(254 nm+305 nm)法為例測定各樣液及原始樣品中山梨酸的含量。

加標(biāo)回收試驗：準(zhǔn)確稱取已粉碎、混勻的1#和2#樣品各25～30 g(精準(zhǔn)至±0.000 1 g)，各稱取3份，分別加入5.00、10.00、20.00 mL 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)操作液，后續(xù)操作同1.3.1項中樣品的處理方法(3 種加標(biāo)水平各平行處理5份)，最后用水定容至100 mL，待測。另準(zhǔn)確移取3#、4# 和5# 飲料樣各10.00 mL(各3份)，分別加入5.00、15.00、30.00 mL 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)操作液，后續(xù)操作同1.3.2 項中樣品的處理方法(3 種加標(biāo)水平各平行處理5 份)，最后用水定容至100 mL，待測。另準(zhǔn)確移取6# 樣品10.00 mL 3 份，分別加入5.00、15.00、30.00 mL 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)操作液，后續(xù)操作同1.3.3 項中樣品的處理方法(3 種加標(biāo)水平各平行處理5 份)，最后用水定容至100 mL，待測。取各定容液適量，以雙波長(254 nm+305 nm)法為例，按實驗方法測其含量，并計算回收率。

樣品測定結(jié)果及回收試驗見表3。

表3 飲料及糕點中山梨酸的分析結(jié)果及回收試驗Table 3 Analysis results and recovery test of sorbic acid in beverages and pastries

注：ND 為未檢出；樣品含量<檢出限的按檢出限的1/2 計算回收率

3 結(jié)論

山梨酸-堿性紫體系的單波長法、雙波長法及三波長法均可在苯甲酸共存的條件下定量檢測山梨酸，方法有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度，且簡便、快速，樣品處理簡單。該體系適于市售飲料及糕點中山梨酸的快速定量測定。