羅巧妮　黎世嬋　佘婷婷　生書晶

摘要? ? 何首烏毛狀根體系因為遺傳穩(wěn)定、生長迅速的特點，在次生代謝產(chǎn)物合成和提取方面具有優(yōu)勢。本文概述了何首烏毛狀根體系的誘導(dǎo)和培養(yǎng)過程、影響何首烏毛狀根生長及其次生代謝產(chǎn)物積累的因素，并就何首烏毛狀根在生物轉(zhuǎn)化以及次生代謝工程方面的應(yīng)用前景進行了展望。

關(guān)鍵詞? ?何首烏;毛狀根;生物轉(zhuǎn)化;次生代謝工程

中圖分類號? ? R282.71? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）02-0054-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）

Abstract? ? Because of the characteristics of genetic stability and rapid growth，the hairy root system of Polygonum multiflorum has advantages in the synthesis and extraction of secondary metabolites.This paper summarized the induction and culture process of Polygonum multiflorum hairy roots，the factors affecting the growth of hairy roots and the accumulation of secondary metabolites and forecasted the application prospects of Polygonum multiflorum hairy roots in biotransformation and secondary metabolic engineering.

Key words? ? Polygonum multiflorum;hairy root;biotransformation;secondary metabolic engineering

何首烏是我國歷代常用的傳統(tǒng)中藥材，含有二苯乙烯苷類、蒽醌類、總糖及還原糖等重要化學(xué)成分，具有極大的藥用價值[1]。二苯乙烯苷作為何首烏的主要藥效成分，《中國藥典（2015年版）》將其確定為何首烏原藥材的質(zhì)量控制指標[2]。但是，因其為次生代謝產(chǎn)物，直接在何首烏中提取的量極微，因而利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速獲取二苯乙烯苷等有效成分成為一種研究趨勢。關(guān)于何首烏的組織培養(yǎng)，目前研究較多的為愈傷組織細胞培養(yǎng)以及毛狀根培養(yǎng)，兩者的培養(yǎng)體系目前均已相對成熟。但是由于二苯乙烯苷等有效成分主要在何首烏的塊根及老藤中積累，而何首烏毛狀根體系類似于何首烏的塊根組織，所以在有效成分的積累方面，毛狀根較之愈傷細胞具有優(yōu)勢。筆者多年來致力于何首烏二苯乙烯苷次生代謝途徑的研究，結(jié)合課題組研究成果，概述了何首烏毛狀根體系的誘導(dǎo)和培養(yǎng)過程、影響何首烏毛狀根生長及其次生代謝產(chǎn)物積累的因素，并就何首烏毛狀根在生物轉(zhuǎn)化以及次生代謝工程方面的應(yīng)用前景進行了展望。

1? ? 何首烏毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng)

早在1998年，何首烏毛狀根培養(yǎng)被初次報道，施和平等[3]利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601感染何首烏無菌葉片和葉柄，15 d后均能得到長勢良好的毛狀根。其后，何首烏毛狀根被相繼研究和利用?？傮w來講，影響何首烏毛狀根誘導(dǎo)及培養(yǎng)的因素主要有農(nóng)桿菌菌種、菌體誘導(dǎo)方式、培養(yǎng)基等。

1.1? ? 發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的選擇

不同菌株對何首烏毛狀根的誘導(dǎo)效果不同。目前研究報道，在何首烏毛狀根的誘導(dǎo)中使用較多的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株有ATCC15834、Rl601、LBA9402等，這些菌株中均含有侵入性農(nóng)桿堿型Ri致根質(zhì)粒。王? 莉等[4]利用發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402和R1601誘導(dǎo)何首烏無菌外植體得到了快速穩(wěn)定繁殖的何首烏毛狀根。朱寬鵬等[5]利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834建立了穩(wěn)定遺傳的毛狀根體系，并利用該體系進行了外源基因的超表達和RNA干擾，獲得了較好的效果。雖然在其他藥用植物毛狀根誘導(dǎo)過程中也有發(fā)根農(nóng)桿菌K599、A4等菌株的報道，但是在何首烏中其他菌株的應(yīng)用還有待進一步研究。

1.2? ? 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植株的方法

發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植株的常用方法有直接注射法和接種感染法。直接注射法是用活化好的新鮮菌液對無菌幼苗進行2～3次注射，注射處往往在2周內(nèi)會產(chǎn)生毛狀根。接種感染法則是將何首烏無菌外植體切割后，放入已活化的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液共孵育，然后接種到培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，一般2～4周后可以誘導(dǎo)出毛狀根。如今多數(shù)研究均采用接種感染法轉(zhuǎn)化何首烏外植體，因為王? 莉等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與直接感染法相比，接種感染法誘導(dǎo)率相對較高，但由于該法菌侵染的概率較大，后期可能會導(dǎo)致除菌困難。

1.3? ? 培養(yǎng)基的選擇

多項研究表明，MS培養(yǎng)基是目前最適合何首烏毛狀根生長的培養(yǎng)基。邱立鵬[6]在試驗中比較了MS、1/2MS、B5和White 4種不同培養(yǎng)基對毛狀根生長的影響，結(jié)果表明，經(jīng)過40 d的培養(yǎng)，毛狀根在MS培養(yǎng)基的增長倍數(shù)最高;嚴春艷等[7] 也進行了類似試驗，并繪制了生長曲線，也發(fā)現(xiàn)毛狀根在MS培養(yǎng)基中的生長曲線高于其他3個，說明MS培養(yǎng)基最適合轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根的生長。MS培養(yǎng)基屬于高鹽濃度的培養(yǎng)基，含有較高濃度的NH4+、NO3-、PO43-、Ca2+等無機鹽和離子，究其原因可能是何首烏毛狀根生長比較旺盛，需要MS這樣的高鹽度培養(yǎng)基提供充足的營養(yǎng)。

2? ? 影響毛狀根生長及其次生代謝產(chǎn)物形成的因素

毛狀根培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于提高藥用植物的有效藥成分含量，通過控制不同的培養(yǎng)條件，添加相應(yīng)的化學(xué)因子可以達到提高次生代謝產(chǎn)物的目的。目前，對于毛狀根培養(yǎng)的影響因素，研究較多的有光照、pH值、溫度等物理因素以及外源添加激素、誘導(dǎo)子等化學(xué)因子。由于目前對何首烏毛狀根的培養(yǎng)影響因素沒有系統(tǒng)全面的試驗研究，本文結(jié)合其他藥用植物在該領(lǐng)域的研究，指出可能影響何首烏毛狀根生長及其次生代謝產(chǎn)物形成的因素。

2.1? ? 物理因子

光照、溫度、pH值以及培養(yǎng)基中的碳源和氮源等都會影響毛狀根的生長及其次生代謝產(chǎn)物的合成，良好的毛狀根體系往往是多個因素共同作用的結(jié)果。楊? 睿等[8]研究了影響水母雪蓮毛狀根生長和總黃酮生物合成的理化因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，合適的碳源和氮源濃度、添加一定的激素、24 ℃培養(yǎng)并給予一定的光強、pH值為5.8時最有利于毛狀根的生長及總黃酮的生物合成;除了上述條件，搖床轉(zhuǎn)速也會影響其生長和代謝。在何首烏的毛狀根培養(yǎng)中，還未見對特定物理因素如光照、溫度、pH值等的綜合研究。潘瑞幟等[3]誘導(dǎo)何首烏毛狀根采用的是光強2 000 lx、光照時間14 h/d，1個月后誘導(dǎo)得到何首烏毛狀根;王? 莉等[4]則是采用25 ℃暗培養(yǎng)40 d，對于光照如何影響何首烏毛狀根的誘導(dǎo)和生長，甚至對其次生代謝產(chǎn)物的合成有沒有影響，至今還未見報道，下一步研究可以對其進行深入探討。

2.2? ? 化學(xué)因子

2.2.1? ? 外源激素。雖然毛狀根在不添加外源激素的情況下也能快速生長，但其次生代謝產(chǎn)物的形成和積累離不開激素。不同的激素可以通過調(diào)節(jié)植物細胞中不同的酶體系影響次生代謝產(chǎn)物的形成[8]。因此，可以通過添加外源激素以及調(diào)節(jié)激素的濃度和比例，提高毛狀根中目標活性成分的積累，從而有利于人們對藥用植物活性成分的大量提取。于榮敏等[9]在試驗中研究了3種常見的外源激素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAA、2，4-D會促進何首烏毛狀根的生長，而6-BA則會抑制何首烏毛狀根的生長及其次生代謝產(chǎn)物蒽醌類的積累。

2.2.2? ? 誘導(dǎo)子。在培養(yǎng)基中添加的可以刺激毛狀根產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)或生物因子就是誘導(dǎo)子。酵母提取物、茉莉酸甲酯、水楊酸等多種物質(zhì)常常被作為誘導(dǎo)子對藥用植物毛狀根中的活性成分進行刺激合成。張金家等[10]考察了酵母提取物、茉莉酸甲酯、水楊酸和銀離子等誘導(dǎo)子對丹參毛狀根及其中丹酚酸的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種誘導(dǎo)子對丹參毛狀根的生長均無顯著影響;茉莉酸甲酯和水楊酸能提高丹酚酸的含量，酵母提取物反而會降低丹酚酸，Ag+無顯著影響。郭? 雙等[11]在研究誘導(dǎo)子對顛茄毛狀根的影響時發(fā)現(xiàn)，AgNO3是提高顛茄毛狀根中托品烷類生物堿含量的最佳誘導(dǎo)子，酵母提取物可以同時促進顛茄毛狀根的生長及其次生代謝。關(guān)于何首烏誘導(dǎo)子的研究報道還不多見，嚴春艷等[7]發(fā)現(xiàn)，水楊酸、茉莉酮酸甲酯這2種誘導(dǎo)子會抑制何首烏毛狀根的生長，但誘導(dǎo)子對其次生代謝產(chǎn)物的影響還未見報道。

3? ? 何首烏毛狀根的生物轉(zhuǎn)化

生物體系中會存在各種各樣的酶，而這些酶系統(tǒng)能夠?qū)ν庠葱缘孜镞M行糖基化、羥基化、甲基化、氧化、還原等結(jié)構(gòu)修飾，即為生物轉(zhuǎn)化。由于多酶催化作用的不確定性，還可能產(chǎn)生一些新的活性物質(zhì)。朱建華等[12]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根可以將青蒿酸轉(zhuǎn)化為3個青蒿素類化合物和1個羥基化產(chǎn)物;嚴春艷等[13]利用轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根對青蒿素等8種活性化合物進行生物轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中3個底物發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化;鄧文娟等[14]研究顯示，瑞香素在何首烏毛狀根懸浮培養(yǎng)體系中發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化，生成了瑞香素-8-O-β-D-葡萄糖苷（Ⅱ）。另外，還有關(guān)于何首烏毛狀根對于麝香草酚、氯代香豆素、倍半萜類化合物[15-16]等物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，都得到了不同程度的糖基化、氧化、還原等反應(yīng)底物，可見何首烏在生物轉(zhuǎn)化方面有著廣闊的應(yīng)用前景，對于豐富新化合物資源，甚至研制開發(fā)新藥都是一個可行的方法，值得進一步研究挖掘。

4? ? 何首烏毛狀根在代謝工程方面的研究

藥用植物次生代謝工程是利用基因工程的手段對次生代謝途徑進行修飾、調(diào)控甚至改變，以期提高次生代謝產(chǎn)物的含量。何首烏含有二苯乙烯苷、蒽醌類等次生代謝產(chǎn)物，有利于提高植物的抗逆性，并且在治療心血管疾病、炎癥等方面表現(xiàn)出較好的效果，但是由于次生代謝產(chǎn)物含量的局限，次生代謝工程成為解決這一問題的有效途徑。筆者前期研究表明[5]，芪合酶是何首烏二苯乙烯苷合成途徑的關(guān)鍵酶，將含有芪合酶基因的過表達質(zhì)粒和RNA干擾載體導(dǎo)入野生型發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834中，轉(zhuǎn)化何首烏外植體誘導(dǎo)生成毛狀根，結(jié)果表明，芪合酶過表達的何首烏毛狀根中二苯乙烯苷含量是空白組的2.41倍，而RNA干擾組則二苯乙烯苷合成明顯減少。

5? ? 總結(jié)及展望

現(xiàn)代藥理學(xué)研究已經(jīng)證明何首烏中二苯乙烯苷等次生代謝產(chǎn)物的諸多功效，但是由于次生代謝產(chǎn)物含量較低，原植物提取含量有限，獲得生長迅速、穩(wěn)定遺傳的毛狀根成為何首烏有效成分提取的一個重要來源。但目前對于影響何首烏毛狀根生長及其次生代謝產(chǎn)物形成的因素研究還不夠深入，有待進一步研究。利用何首烏毛狀根進行生物轉(zhuǎn)化的研究越來越多，給未來利用何首烏毛狀根進行目標產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化提供了可能。而隨著次生代謝工程研究的深入，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因改良的何首烏毛狀根，從而在根源上提高二苯乙烯苷等有效成分的含量，也為將來大量獲取有效成分提供了一條便捷的途徑[17]。

6? ? 參考文獻

[1] 崔真真，王海凌，張冰，等.何首烏研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2019，21（1）：172-174.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[3] 施和平，潘瑞熾.何首烏毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報，1998，6（2）：169-171.

[4] 王莉，于榮敏，張輝，等.何首烏毛狀根的誘導(dǎo)及其培養(yǎng)[J].藥物生物技術(shù)，2002，9（2）：110-114.

[5] 朱寬鵬，趙樹進.芪合酶基因Fm-STS在何首烏毛狀根中的過量表達及dsRNA干擾[J].中國生物工程雜志，2012，32（8）：41-48.

[6] 邱立鵬.轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)及其代謝產(chǎn)物的初步研究[D].沈陽：沈陽藥科大學(xué)，2004.

[7] 嚴春艷，黃冰，邱紅燕，等.轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根培養(yǎng)條件優(yōu)化及誘導(dǎo)子對其生長的影響[J].中藥材，2013，36（8）：1219-1221.

[8] 楊睿，付春祥，金治平，等.不同理化因子對雪蓮毛狀根生長和總黃酮生物合成的影響[J].生物工程學(xué)報，2005（2）：233-238.

[9] 于榮敏，馬娜，嚴春艷，等.外源激素對何首烏毛狀根生長及蒽醌類成分生物合成的影響[J].生物工程學(xué)報，2006（4）：619-623.

[10] 張金家，談榮慧.誘導(dǎo)子對丹參毛狀根丹酚酸類化合物積累的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，31（5）：91-94.

[11] 郭雙，劉佳盧，克歡，等.誘導(dǎo)子對顛茄毛狀根有效成分及代謝關(guān)鍵酶基因表達的影響[J].中草藥，2018，49（4）：897-902.

[12] 朱建華，于榮敏.轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根生物轉(zhuǎn)化青蒿酸的研究[J].中草藥，2012，43（6）：1065-1067.

[13] 嚴春艷，馬偉麗，梁建，等.轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根對8種活性成分的生物轉(zhuǎn)化研究[J].中國生物工程雜志，2008（4）：78-81.

[14] 鄧文娟，周良彬，于榮敏.轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根生物轉(zhuǎn)化瑞香素的研究[J].中國中藥雜志，2011，36（3）：351-355.

[15] 董權(quán)鋒，賈郡璋，朱建華，等.轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根生物轉(zhuǎn)化麝香草酚[J].中藥材，2009，32（10）：1495-1499.

[16] 嚴春艷，馬偉麗，顏雯雯，等.何首烏毛狀根對倍半萜類化合物的生物轉(zhuǎn)化研究[J].中藥材，2008，31（5）：633-635.

[7] 薛達元.轉(zhuǎn)基因生物安全與管理[M].北京：科學(xué)出版社，2018.