冼 亮，秦 艷，朱 婧，李 億，梁 戈，左曉瓊，黃日波，王青艷

(廣西科學(xué)院，國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007)

0 引言

木聚糖是自然界中儲(chǔ)量第二大的自然多糖，將其資源化可帶來極大利益[1]。木聚糖有一條由木糖以β-1,4-木糖苷鍵連接而成的主鏈，部分木糖殘基帶有短側(cè)鏈。側(cè)鏈基團(tuán)含有乙?；?、阿拉伯糖基、半乳糖基、葡萄糖醛酸基、阿魏酸等的一種或幾種，另外，香豆酸也有可能屬于木聚糖的側(cè)鏈基團(tuán)[2]。

廣義的木聚糖酶是水解木聚糖主鏈和側(cè)鏈的酶的統(tǒng)稱，狹義的木聚糖酶僅指水解木聚糖主鏈的酶，即內(nèi)切木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)和木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)[3]。內(nèi)切木聚糖酶以隨機(jī)方式水解主鏈內(nèi)部的β-1,4-木糖苷鍵，是對(duì)木聚糖的快速解聚貢獻(xiàn)最大的酶，因而吸引了研究者的極大興趣，并且該酶已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用在多個(gè)領(lǐng)域中[4]。

近年來，有關(guān)內(nèi)切木聚糖酶的研究熱度不減，在新酶的發(fā)現(xiàn)和已有酶的改良、單一酶制劑的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用、復(fù)合酶制劑的開發(fā)、傳統(tǒng)方法改良菌株的產(chǎn)酶量和分子生物學(xué)水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面，均有持續(xù)不斷的報(bào)道。此外，有新結(jié)構(gòu)的木聚糖的發(fā)現(xiàn)也帶來了相應(yīng)新的內(nèi)切木聚糖酶，拓寬了人們對(duì)這個(gè)古老的酶的認(rèn)識(shí)。現(xiàn)有國(guó)內(nèi)綜述多為陳述較早前的研究結(jié)果，對(duì)近年來國(guó)內(nèi)和國(guó)際同行取得的較新研究結(jié)果較少涉及，基于此，本文結(jié)合近年來的報(bào)道，對(duì)內(nèi)切木聚糖酶與應(yīng)用相關(guān)的研究進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。

1 內(nèi)切木聚糖酶的分子特征

與大多數(shù)酶一樣，一個(gè)內(nèi)切木聚糖酶由一個(gè)基因編碼，由一個(gè)mRNA翻譯而來。內(nèi)切木聚糖酶一般以單體的形式存在，其分子量低者只有20 kDa[5]，高者可超過100 kDa[6]。內(nèi)切木聚糖酶群體的氨基酸序列的多樣性很大，分屬于糖苷水解酶第5，6[7]，7，8[8]，10，11，30[9]和43家族，其中以屬于家族10和11的個(gè)體為多見[10]。該酶的水解機(jī)制為酸堿催化[10]。

2 內(nèi)切木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

在內(nèi)切木聚糖酶群體中，不同個(gè)體之間的每一項(xiàng)酶學(xué)性質(zhì)都呈現(xiàn)出很強(qiáng)的多樣性，這就使該酶的不同個(gè)體可以被用于不同的反應(yīng)條件中，進(jìn)而拓寬了該酶的應(yīng)用范圍。已報(bào)道內(nèi)切木聚糖酶的最適作用pH值為4.0[11]—11.0[12]，可在pH值為4.0—11.5[13]區(qū)段穩(wěn)定；最適作用溫度為25[14]—100℃[15]，熱穩(wěn)定性極差[16]和極佳[15]的內(nèi)切木聚糖酶均有報(bào)道。有的內(nèi)切木聚糖酶只能水解木聚糖[17]，而有的卻能水解多種底物[18]。內(nèi)切木聚糖酶對(duì)木聚糖的比活力(U/mg蛋白質(zhì)，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)酶活力單位)變化區(qū)間極大，有僅為個(gè)位數(shù)的[6]，也有將近百萬的[19]。大多數(shù)內(nèi)切木聚糖酶的Km值為1—20 g/L木聚糖。

3 內(nèi)切木聚糖酶的用途

3.1 飼料添加劑

內(nèi)切木聚糖酶的用途很廣泛，其中最成熟的用途是作為動(dòng)物的飼料添加劑，目前已經(jīng)出臺(tái)了飼料用木聚糖酶的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[20]。內(nèi)切木聚糖酶可以將飼料中的木聚糖預(yù)水解，提高飼料的適口性，減輕動(dòng)物的消化壓力，提高飼料的消化度。已有多項(xiàng)飼料用木聚糖酶的研究發(fā)表，涉及的動(dòng)物有奶牛[21]、斷奶仔豬[22]、幼雞[23]、魚類[24]和刺參[25]等。由于植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，市售木聚糖酶試劑除了含有內(nèi)切木聚糖酶之外，還含有纖維素酶和果膠酶等，不同酶之間相互搭配可以達(dá)到更好的使用效果[26]。

3.2 食品

內(nèi)切木聚糖酶在食品方面的應(yīng)用也比較成熟。在烘焙食品方面，內(nèi)切木聚糖酶可以增加糕點(diǎn)體積、降低硬度和粘度、提升口感和幫助消化[27]。特別是在含有纖維素質(zhì)原料的食品中，加入內(nèi)切木聚糖酶后會(huì)有更明顯的效果提升[28]。在白酒釀酒方面，添加內(nèi)切木聚糖酶可以促進(jìn)原料的水解，提高原料的利用率和產(chǎn)品的酒度[29]。內(nèi)切木聚糖酶也可以促進(jìn)啤酒糟的水解，降低其粘度，提高濾過率[30]。果汁的生產(chǎn)主要用到果膠酶[31]，加入內(nèi)切木聚糖酶可以起一定的輔助作用[32]。

3.3 營(yíng)養(yǎng)品和甜味劑

內(nèi)切木聚糖酶在營(yíng)養(yǎng)品方面也已有實(shí)際應(yīng)用。內(nèi)切木聚糖酶將木聚糖完全水解后釋放出木糖和低聚木糖(主要由木糖構(gòu)成的寡糖，聚合度為2-7)，其中低聚木糖可以促進(jìn)腸道益生菌的生長(zhǎng)，增進(jìn)腸道健康，改善人體脂質(zhì)代謝，進(jìn)而促進(jìn)人體健康[33]。已有不少學(xué)者對(duì)低聚木糖的生產(chǎn)進(jìn)行研究，他們立足于所在區(qū)域，選材因地制宜。例如馮家勛教授等以廣西產(chǎn)量豐富的甘蔗渣為原料[34]，江正強(qiáng)教授等以北方產(chǎn)量豐富的玉米芯為原料生產(chǎn)低聚木糖[35]。除了可用于生產(chǎn)低聚木糖之外，內(nèi)切木聚糖酶亦可聯(lián)用木糖苷酶將木聚糖徹底水解為木糖，用于生產(chǎn)木糖醇[36]。低聚木糖[37，38]和木糖醇[36,39]都是有益人體健康的甜味劑，且均已有相關(guān)商品出售。

3.4 生物質(zhì)轉(zhuǎn)化

內(nèi)切木聚糖酶在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用一直是熱門研究方向。由于不可再生燃料的儲(chǔ)量日益減少，所以迫切需要開發(fā)可再生燃料[40]。將木聚糖徹底水解為木糖后，可使用微生物將木糖轉(zhuǎn)化為乙醇[41，42]、丙酮[43]、丁醇[44]和油脂[45]等可再生燃料，也可轉(zhuǎn)化為丁二酸等其他化工原料[46]。

木聚糖和其他多糖與纖維素構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)之一，木聚糖酶的水解可以增大纖維素與纖維素酶的接觸面以提高纖維素酶的水解率[47]，纖維素水解產(chǎn)生的葡萄糖可以用于生產(chǎn)第二代燃料乙醇[48]等大宗產(chǎn)品。迄今已有不少內(nèi)切木聚糖酶對(duì)纖維素的水解起促進(jìn)作用的報(bào)道[49，50]。在纖維素質(zhì)原料的實(shí)驗(yàn)室水解中，用各種預(yù)處理方法去除部分木質(zhì)素和部分半纖維素等物質(zhì)，再聯(lián)用內(nèi)切木聚糖酶和纖維素酶就可以實(shí)現(xiàn)纖維素質(zhì)原料的高效水解[34,51]。

3.5 造紙

內(nèi)切木聚糖酶在造紙方面的應(yīng)用已有不少研究。內(nèi)切木聚糖酶可以水解紙漿中的木聚糖，改善紙漿的物理性能，使卡帕值下降[52]；可以脫除廢紙漿上吸附的油墨，使白度提高[53]。使用該酶處理紙漿后再聯(lián)用化學(xué)法處理能進(jìn)一步提升紙漿的質(zhì)量，該酶的處理還可以降低漂白用化學(xué)用品的用量，減輕環(huán)境壓力[54]。

4 新酶的開發(fā)

4.1 從可培養(yǎng)和未培養(yǎng)微生物中獲得新酶

內(nèi)切木聚糖酶主要由微生物產(chǎn)生，從環(huán)境樣品中篩選新的產(chǎn)酶菌株是獲得新酶的有效方法[55]。將酶純化后可評(píng)估該酶的應(yīng)用效果，并可將性能優(yōu)異的酶的編碼基因克隆表達(dá)，大量獲得該酶[56，57]。如Zheng等[58]從棉花秸稈堆中篩選得到一株類芽孢桿菌，從其液態(tài)培養(yǎng)液中純化得到一個(gè)高度耐熱的內(nèi)切木聚糖酶。Yang等[59]從土壤樣品中篩選得到一株煙曲霉，其液態(tài)培養(yǎng)液水解甘蔗渣堿提取物主要釋放出木二糖，進(jìn)一步從培養(yǎng)液中純化得到起作用的內(nèi)切木聚糖酶，并克隆表達(dá)其編碼基因。He等[60]從以竹子為原料的造紙廠樣品中篩選得到一株鏈霉菌，并從菌株的培養(yǎng)液中純化得到一個(gè)胞外內(nèi)切木聚糖酶，其可在pH值3.0—11.0區(qū)間穩(wěn)定，并克隆表達(dá)其編碼基因。

除了從可培養(yǎng)微生物中獲得新酶外，也可從各種環(huán)境所含未培養(yǎng)微生物中直接克隆表達(dá)獲得新酶[61]。如Mo等[62]通過活性篩選的方法，從堆肥樣品的宏基因組文庫中獲得一種新的耐熱內(nèi)切木聚糖酶。

4.2 通過蛋白質(zhì)工程改變野生酶的性質(zhì)

蛋白質(zhì)工程可以改變內(nèi)切木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，獲得更具應(yīng)用潛力的酶。例如Ventorim等[63]通過蛋白質(zhì)工程，將野生酶的熱穩(wěn)定性(T1/250℃為0.77 h)提升了數(shù)倍(T1/250℃為29.46 h)；Gibbs等[64]將最適作用pH值為6.6的野生酶突變，得到最適作用pH值為8.5的突變體。另一方面，從學(xué)術(shù)的角度來看，蛋白質(zhì)工程可以幫助人們認(rèn)識(shí)氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等對(duì)酶活力的影響，拓寬認(rèn)知，有助于人們對(duì)有應(yīng)用潛力的酶進(jìn)行改造。

5 酶制劑的開發(fā)

5.1 單一型酶制劑

單一型酶制劑是指主要含某個(gè)酶的酶制劑，在造紙方面，高纖維素酶活力會(huì)損害紙漿，故適合用主要含內(nèi)切木聚糖酶的單一型酶制劑[65]。關(guān)于富含單一酶的酶制劑的開發(fā)，已有的研究多是將某個(gè)酶的編碼基因在某個(gè)缺乏植物細(xì)胞壁成分水解酶的宿主中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，獲得富含該酶的制劑[17]。常見的宿主有大腸桿菌和畢赤酵母等。但此法的產(chǎn)酶成本高，培養(yǎng)工藝較復(fù)雜，并且酶的生產(chǎn)往往需要誘導(dǎo)，難以低成本持續(xù)高產(chǎn)。通過菌株篩選或選育獲得高產(chǎn)菌株是用于生產(chǎn)單一型內(nèi)切木聚糖酶制劑的好方法，因?yàn)檫@樣獲得的菌株容易培養(yǎng)，誘導(dǎo)生產(chǎn)目標(biāo)酶所用成本較低[66，67]。

5.2 復(fù)合型酶制劑

單一型酶制劑的缺陷非常明顯，由于菌株本身的其他細(xì)胞大分子聚合物水解酶的活力低，當(dāng)以多成分水解為目標(biāo)時(shí)(應(yīng)用于食品、飼料、生物煉制和營(yíng)養(yǎng)品方面)，這些酶制劑的用途會(huì)受到限制[68]。復(fù)合型酶制劑是指含有多種細(xì)胞大分子聚合物水解酶的酶制劑。復(fù)合型酶制劑的開發(fā)可從菌株入手，篩選新的產(chǎn)酶菌株，獲得高產(chǎn)量和兼具不同酶的酶制劑[69]；使用傳統(tǒng)誘變方法可以使菌株的基因組引入隨機(jī)突變，從而提高菌株的產(chǎn)酶能力和調(diào)節(jié)菌株產(chǎn)生其他酶，進(jìn)而改良原有酶制劑[70-72]。

對(duì)產(chǎn)酶調(diào)控機(jī)理進(jìn)行研究不但能增進(jìn)人們對(duì)微生物基因表達(dá)調(diào)控的了解，還能獲得優(yōu)良的產(chǎn)酶菌株，從而得到優(yōu)良的酶制劑。馮家勛教授、曲音波教授和周志華研究員等團(tuán)隊(duì)各自對(duì)通過傳統(tǒng)誘變獲得高產(chǎn)酶的草酸青霉菌株的基因組進(jìn)行測(cè)序，分析在不同產(chǎn)酶能力對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)條件下的基因表達(dá)差異，尋找目標(biāo)酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過基因缺失和回補(bǔ)等方法驗(yàn)證，從分子水平上揭示了產(chǎn)酶調(diào)控機(jī)理，獲得了同時(shí)含木聚糖酶、纖維素酶和淀粉酶等酶的復(fù)合酶制劑[73，74]。突變的草酸青霉菌株可以以多種農(nóng)林業(yè)廢棄物為碳源快速生長(zhǎng)并高產(chǎn)酶，所產(chǎn)的復(fù)合酶可以將紙漿[51]和堿處理甘蔗渣[34]高效糖化，耦合酵母后還可以將糖化液中的單糖轉(zhuǎn)化為乙醇，故這些酶制劑在食品、飼料、生物煉制和營(yíng)養(yǎng)品方面均具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力。趙心清教授團(tuán)隊(duì)對(duì)瑞氏木霉產(chǎn)生物質(zhì)水解酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，也獲得了優(yōu)良的產(chǎn)復(fù)合酶的重組菌株[75，76]。

5.3 菌株培養(yǎng)產(chǎn)酶制劑的優(yōu)化

菌株培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化是提高產(chǎn)量和調(diào)節(jié)其他酶產(chǎn)量的有效方法。個(gè)別因素可能對(duì)產(chǎn)酶的影響較大，例如Zhang等[77]改變了液態(tài)培養(yǎng)基pH值和控制溶解氧的量之后，StreptomycesgriseorubensJSD-1的木聚糖酶活力提高到優(yōu)化前的3.2倍。Yin等[78]優(yōu)化了多個(gè)因素后，將Kluyveromyceslactis的木聚糖酶活力從16 U/mL提升至49 U/mL。除了使用搖瓶培養(yǎng)外，也有報(bào)道對(duì)使用發(fā)酵罐培養(yǎng)的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化[79，80]。

使用農(nóng)業(yè)廢棄物和下腳料為原料可以變廢為寶并節(jié)約酶的生產(chǎn)成本[81]。在液態(tài)培養(yǎng)中，麥麩是最常用的[79,82-84]，玉米芯[82,85]和黃豆粉[85]等也有報(bào)道使用，這些原料的配比使用會(huì)使培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)更全面，能夠獲得更好的產(chǎn)酶效果[82,85]。農(nóng)業(yè)廢棄物和下腳料也可以用作固態(tài)發(fā)酵(Solid-state Fermentation)產(chǎn)酶的基質(zhì)。與液態(tài)發(fā)酵的方法相比，固態(tài)發(fā)酵的傳質(zhì)、傳熱、pH值等參數(shù)難以實(shí)時(shí)控制，但也有可能獲得更好的產(chǎn)酶效果[86，87]。

6 β-1,3-內(nèi)切木聚糖酶

研究者從某些海洋藻類的細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)一種由木糖以β-1,3-木糖苷鍵連接而成的多糖，雖然與常見的以β-1,4-連接的木聚糖不同，但該多糖也屬于木聚糖[88,89]。在已報(bào)道的水解β-1,3-木聚糖的酶中，有底物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該酶不能水解β-1,4-木聚糖，亦不能水解Avicel、羧甲基纖維素鈉、昆布多糖和甘露聚糖，證實(shí)該酶所具有水解β-1,3-木聚糖的功能不是某些酶的兼有功能[90]，因此該酶被稱為β-1,3-內(nèi)切木聚糖酶，并擁有專屬的酶學(xué)編號(hào)EC 3.2.1.32。根據(jù)氨基酸序列同源性，該酶屬于糖苷水解酶家族26[91]。

雖然關(guān)于該酶的報(bào)道較少，但該酶的應(yīng)用前景不可忽視[92]。海洋藻類有可觀的生物量，能用作生物煉制的材料生產(chǎn)眾多有用的化工品[93]。將β-1,3-木聚糖部分水解可產(chǎn)低聚木糖[94]，完全水解生成的木糖可以進(jìn)一步生物轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)品[43-46]。在已有報(bào)道中，該酶主要由微生物產(chǎn)生[94,95]?？紤]到微生物基因組的多樣性，該酶可能廣泛存在于多種微生物的基因組中，只是由于人們對(duì)該酶的認(rèn)識(shí)不足而未被廣泛發(fā)現(xiàn)。該酶的不同個(gè)體的分子量和各項(xiàng)酶學(xué)性質(zhì)都存在很大差異，隨著人們對(duì)海洋藻類生物煉制研究的持續(xù)進(jìn)行，對(duì)該酶的研究必定取得更多進(jìn)展[90,94]。

7 展望

人們對(duì)內(nèi)切木聚糖酶的研究由來已久，并已取得了很好的成就，但仍舊存在一些亟待解決的問題。

在營(yíng)養(yǎng)品的生產(chǎn)方面，原材料的處理成本往往占生產(chǎn)成本的較大比例，已有內(nèi)切木聚糖酶難以直接從原材料高效地生產(chǎn)低聚木糖，而是只能以預(yù)處理后的材料[96]或提取物[17,35,97,98]為原料生產(chǎn)。同樣的問題也限制了內(nèi)切木聚糖酶在食品和生物煉制方面的應(yīng)用[99]。通過蛋白質(zhì)工程獲得高效水解植物細(xì)胞壁其他大分子聚合物的內(nèi)切木聚糖酶應(yīng)該可以使成本降低，這或許是未來的研究方向。

在蛋白質(zhì)工程方面存在兩個(gè)主要問題。一是非催化氨基酸的突變和酶學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系仍未十分清楚，目前仍然難以準(zhǔn)確評(píng)估非催化氨基酸在野生酶中所起的功能和精準(zhǔn)預(yù)測(cè)突變后的結(jié)果。在多個(gè)報(bào)道中，往往僅突變1個(gè)氨基酸就可能造成多項(xiàng)酶學(xué)性質(zhì)的改變，并且有可能產(chǎn)生不符合研究人員初衷的突變體[100]，這都印證了已有的研究仍然不足。二是知識(shí)產(chǎn)權(quán)的壁壘，如果使用某些酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的酶作為出發(fā)酶，通過蛋白質(zhì)工程進(jìn)一步改良該項(xiàng)酶學(xué)性質(zhì)會(huì)更有實(shí)用意義[101]，但這往往很難實(shí)現(xiàn)。因?yàn)楝F(xiàn)有專利往往保護(hù)了某個(gè)酶的本身及其少數(shù)幾個(gè)氨基酸的突變體，在保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的同時(shí)也可能會(huì)降低非專利權(quán)研究人員使用該酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程研究的熱情。

關(guān)于β-1,3-內(nèi)切木聚糖酶的報(bào)道仍然很少，人們對(duì)該酶的了解有限，亟待獲得新的酶進(jìn)行研究。在不斷獲得新酶后，還應(yīng)對(duì)某些可能符合應(yīng)用要求的酶進(jìn)行應(yīng)用試驗(yàn)并評(píng)估其作用效果，才能真正實(shí)現(xiàn)海洋藻類生物質(zhì)資源的綜合利用。