◆作者：鞏華 張洪業(yè) 賴迎迢 孫承文劉春花陶家發(fā) 焦彩虹

◆單位：1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所；2.廣州海誠生物科技有限公司

大口黑鱸（Largemouth bass，Micropterus salmoides），俗稱加州鱸，屬廣溫性魚類，原產(chǎn)美國，我國自1983年引入，現(xiàn)主要分布在廣東、江蘇、浙江、江西、四川和福建等省份。因生長(zhǎng)快、病害少、耐低溫、肉質(zhì)鮮美且易捕撈，大口黑鱸已成為我國重要的淡水養(yǎng)殖品種，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年產(chǎn)量 37.4萬噸，2017年產(chǎn)量達(dá)45.7萬噸，年增長(zhǎng)率31.57%。在廣東佛山市，順德區(qū)的勒流、龍江、均安、杏壇、樂從等鎮(zhèn)養(yǎng)殖大口黑鱸區(qū)域比較集中。近年來，由于養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度大幅提升，大口黑鱸生長(zhǎng)過程中出現(xiàn)的病害情況日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)殖戶帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。

生產(chǎn)中使用益生菌調(diào)節(jié)水質(zhì)減少病害發(fā)生，乳酸菌屬于異養(yǎng)型微生物，在厭氧或兼性厭氧條件下都能分解和利用多種有機(jī)碳、氮物質(zhì)，是生物法處理污水的重要微生物，在污水處理、湖泊及河道治理、養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應(yīng)用日益廣泛。近年來從魚體或使用乳酸菌調(diào)控水質(zhì)提高魚體免疫力有很多報(bào)道，也有使用植物乳桿菌進(jìn)行污水或養(yǎng)殖廢水處理，但在淡水池塘底泥中尚未見報(bào)道。本研究在順德地區(qū)多年使用乳酸菌的池塘中分離到27株乳酸菌，利用從引起大口黑鱸“爛身病”的嗜水氣單胞菌為指示菌進(jìn)行拮抗作用試驗(yàn)，篩選獲得一株具有顯著抑菌活性的乳酸菌XTL3，并對(duì)該菌株進(jìn)行了研究，以期為指導(dǎo)生產(chǎn)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣池塘

廣東省佛山市順德區(qū)勒流鎮(zhèn)，主養(yǎng)大口黑鱸，套養(yǎng)少量鯽魚和鳙魚，選擇的池塘多年來使用乳酸菌等相關(guān)微生態(tài)產(chǎn)品保持水質(zhì)，多年來養(yǎng)魚透明度保持在30～40cm左右。多數(shù)池塘在增氧機(jī)上安裝溶氧控制器，根據(jù)養(yǎng)殖需要，設(shè)定池水溶氧的上、下限，實(shí)行全自動(dòng)增氧，始終保持池水溶氧在5mg/L以上。

1.1.2 樣品采集

釆樣時(shí)間為2018年3-4月，水溫20～27℃。使用采泥器在池塘的水深約2.0米處的兩個(gè)點(diǎn)位分別采集池底底泥的表層物 (約5 cm)，將其混合，取約 50mL（約50g）帶水的底泥樣品置于經(jīng)滅菌處理的容積為200 mL的錐形瓶中，密封，放入加冰袋的泡沫箱內(nèi)，當(dāng)天返回實(shí)驗(yàn)室，用于細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑

LB培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒 ，DNA marker-D，TagPCR Master mix，上海生工生物工程有限公司；乳酸菌生化鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)與分離

將污泥水樣品1mL（約1g），用無菌水50mL制成懸浮液，以300目篩絹網(wǎng)過濾，濾液6000 r/min離心，棄去上清液，再以無菌水制成混懸液。

用微量移液器吸取lmL水樣滴于盛有100mL的MRS液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，滴一滴溴甲酚紫溶液作指示劑。置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)。培養(yǎng)液變黃后，先將培養(yǎng)液搖勻，再用微量移液器吸取0.1mL培養(yǎng)液滴在MRS固體平板上，用玻璃刮鏟涂勻。長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)菌落顏色、大小、邊緣光滑程度等形態(tài)學(xué)特征對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類，用接種環(huán)挑取少量菌在MRS固體平板上劃線，直至出現(xiàn)單菌落。挑取單菌落在MRS固體平板上劃線，獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 拮抗菌的篩選

以實(shí)驗(yàn)室前期保存的大口黑鱸“爛身病”的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila） 為指示菌，采用牛津杯法測(cè)定所分離的乳酸菌對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制效果。用接種環(huán)刮取少量指示菌，使用滅菌生理鹽水稀釋后均勻涂布于牛津杯打孔的LB平板上。同樣，用接種環(huán)刮取活化24h的分離菌株，使用滅菌生理鹽水稀釋后取150μL置于小孔內(nèi)，28℃培養(yǎng)24～36 h，觀察小孔周圍抑菌圈情況。最后，選取具有最佳抑菌效果的乳酸菌XTL3作為候選益生菌。

1.2.3 革蘭氏染色與鏡檢

取新鮮單菌體進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)觀察進(jìn)行形態(tài)鑒別，步驟參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。

1.2.4 菌株的生理生化鑒定

參照麥?zhǔn)媳葷岱ㄖ苽?.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，以?xì)菌微量檢定進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測(cè)定，步驟參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》。

1.2.5 16Sr DNA序列分析

利用滅菌去離子水將純化的乳酸菌XTL3制成菌懸液，采用北京天根生物細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取。利用細(xì)菌16Sr DNA基因通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’） 對(duì)細(xì)菌總DNA的相應(yīng)序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過Blast檢索程序與NCBI基因庫中相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，并通過MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 養(yǎng)殖池塘安全性和效力檢驗(yàn)

將獲得的菌株進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，調(diào)節(jié)優(yōu)化得到各項(xiàng)生產(chǎn)參數(shù)（另文發(fā)表），最終得到1.1×1010CFU的菌液。

2018年10-11月在順德區(qū)勒流鎮(zhèn)某養(yǎng)殖池2口分別設(shè)置為實(shí)驗(yàn)池和對(duì)照池，面積為10畝，池形呈東西向的長(zhǎng)方形，建有獨(dú)立的進(jìn)排水系統(tǒng)，水深為2.0米左右，放養(yǎng)大口黑鱸1800尾左右，體重約 200～300g，套養(yǎng)少量鯽魚和鳙魚。配備相應(yīng)的增氧機(jī)、投飼機(jī)等生產(chǎn)設(shè)施，試驗(yàn)期間每天開2h的增氧機(jī)，保持透明度為35cm左右。

其中實(shí)驗(yàn)池塘于10月25日、11月3日分別使用分離到的乳酸菌液，劑量為每畝0.5L。

連續(xù)1個(gè)月跟蹤檢測(cè)使用情況，每天記錄生產(chǎn)管理情況，每天上午8點(diǎn)左右使用便攜式水質(zhì)分析儀檢測(cè)水體溶氧和氨氮的水平的變化，設(shè)置差異顯著性水平P為0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著，當(dāng)P＜0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)及菌體狀態(tài)

利用MRS培養(yǎng)基對(duì)養(yǎng)殖池塘底泥樣品中的乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)、分離與純化，共獲得27株乳酸菌。通過對(duì)指示菌的拮抗實(shí)驗(yàn)篩選出1株具有顯著拮抗作用的乳酸菌XTL3，該菌株對(duì)的生長(zhǎng)均有良好的抑制作用。該菌株形成的群落表面光滑，有光澤，中央隆起，不透明，乳白色或淡黃色，具有酸味。顯微鏡下呈直或彎桿狀，兩端呈圓形突起，革蘭氏染色陽性，無鞭毛，無芽孢(圖 1、圖 2）。

圖1 MRL培養(yǎng)基分離池塘乳酸菌

圖2 菌株XTL3革蘭氏染色

2.2 菌株鑒定結(jié)果

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等，2001)和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(布坎南等，1984)植物乳桿菌和芽孢桿菌屬特征，比對(duì)測(cè)試結(jié)果顯示，菌株XTL3生理生化特性與植物乳桿菌一致（見表1）。

表1 菌株XTL3生理生化特性

采用通用引物對(duì)菌株XTL3的16Sr DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。使用Blast軟件對(duì)所獲得測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。結(jié)果表明，本研究分離獲得的菌株XTL3屬于乳桿菌科(Lactobacillaceae)乳桿菌屬(Lactobacillus)，與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ATCC14917）的相似性為100%。

圖3 菌株XTL3基于16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 養(yǎng)殖池塘安全性和效力檢驗(yàn)結(jié)果

分別在2018年10月25日和11月3日，在順德區(qū)池塘的兩口養(yǎng)殖場(chǎng)池塘全池潑灑該乳酸菌液，在使用過程中的一個(gè)月內(nèi)，經(jīng)歷一次暴雨天氣，無異常死亡，無病害發(fā)生。

對(duì)池塘的溶氧和氨氮進(jìn)行檢測(cè)，日際變化如圖4、圖5所示。經(jīng)檢驗(yàn)，兩口池塘的溶氧變化差異不顯著（P＞0.05），氨氮的變化差異顯著（P＜0.05）。從變化曲線上看，實(shí)驗(yàn)池塘的兩項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)總體優(yōu)于對(duì)照塘，而且實(shí)驗(yàn)塘的水質(zhì)變化小，顯示池塘環(huán)境變化小，更穩(wěn)定。

3 討論

乳酸菌屬于異養(yǎng)型微生物，在厭氧或兼性厭氧條件下都能分解和利用多種有機(jī)碳、氮物質(zhì)，是生物法處理污水的重要微生物，在污水處理、湖泊及河道治理、養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應(yīng)用日益廣泛。乳酸菌作為主導(dǎo)菌應(yīng)用于水質(zhì)凈化的效果良好，在成魚養(yǎng)殖池中使用乳酸菌，實(shí)驗(yàn)池溶氧量比對(duì)照池提高 11.2%，NH4+-N和NO2-N含量分別降低了54%、55%，餌料系數(shù)降低8.2%，單位面積凈產(chǎn)量提高14.4%。范毛毛等（2011）在草魚飼料中添加0.2%～0.4%的高性能乳酸菌，每10d拌餌投喂1次，使用3個(gè)月后，水體中的 NH4+-N、NO2-N、HS等有害物質(zhì)含量下降，溶氧量和水體透明度顯著增加，草魚的產(chǎn)量有所提高。

在河蟹養(yǎng)殖過程中，會(huì)因藻類、水草的生長(zhǎng)消耗大量的鈣磷鎂碳等，造成水體堿度快速下降，但直接使用生石灰，會(huì)造成pH急劇升高，易誘發(fā)氨中毒，還會(huì)對(duì)河蟹造成一定的應(yīng)激反應(yīng)。目前生產(chǎn)上使用鈣鎂合劑和乳酸菌一起使用，平衡河蟹池塘水體pH值升高和總堿度下降的問題。

圖4 使用植物乳桿菌調(diào)節(jié)池塘水溶解氧濃度變化比較

圖5 使用植物乳桿菌調(diào)節(jié)池塘水氨氮濃度變化比較

2016年起，在生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，潑灑使用植物乳桿菌調(diào)節(jié)池塘水質(zhì)，使用初期3-5天內(nèi)水色不同程度地調(diào)節(jié)到傳統(tǒng)要求的“肥、活、嫩、爽”狀態(tài)，但之后水色又會(huì)漸漸恢復(fù)到原來狀態(tài)。針對(duì)這種情況，有觀點(diǎn)認(rèn)為，目前水產(chǎn)中使用的乳酸菌等都是從畜牧業(yè)或者食品加工業(yè)中移用的微生物，不適應(yīng)水體環(huán)境，因而在潑灑后很快發(fā)揮作用，之后漸漸被環(huán)境淘汰。

針對(duì)這種情況，2018年3-4月，對(duì)使用菌液后的池塘采用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)查，共計(jì)篩選到27株乳酸菌。以引起大口黑鱸“爛身病”的嗜水氣單胞菌為指示菌進(jìn)行拮抗作用試驗(yàn)，篩選獲得一株具有顯著抑菌活性的乳酸菌XTL3。該乳酸菌來自池塘環(huán)境中，可見乳酸菌能夠在養(yǎng)殖環(huán)境中有效存活，并發(fā)揮其生理功能，因此在可以有效應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中。

在本實(shí)驗(yàn)中，使用乳酸菌，對(duì)各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)會(huì)有改善，特別是溶氧，在使用后總體會(huì)穩(wěn)步提高，顯然一方面能降低水體內(nèi)包括大多數(shù)病原菌在內(nèi)的兼性厭氧菌的存活，另一方面還能降低養(yǎng)殖動(dòng)物因?yàn)榄h(huán)境因子劇烈變化而產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。我們也發(fā)現(xiàn)，確實(shí)存在使用3-5天后水色有轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，從水質(zhì)變化上也能顯示出這種現(xiàn)象，因?yàn)槭褂?-5天后，水質(zhì)因子就開始出現(xiàn)變化。許多研究表明，乳酸菌等能通過氧化、氨化、固氮、硝化和反硝化等作用，將養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的殘餌、糞便以及其它的有害物質(zhì)迅速地分解為CO2、硝酸鹽、磷酸鹽等無毒無害的營養(yǎng)物質(zhì)來達(dá)到凈化水質(zhì)的目的；同時(shí)提高水體中的溶解氧，保證養(yǎng)殖水環(huán)境的潔凈，促進(jìn)養(yǎng)殖生物的健康生長(zhǎng)（李詠梅等，2018），這些作用同時(shí)也是抑菌作用。另外，乳酸菌可以連續(xù)使用，如本實(shí)驗(yàn)中第二次使用后，水質(zhì)總體穩(wěn)定時(shí)間比較長(zhǎng)。

但是乳酸菌在水環(huán)境中如何代謝生長(zhǎng)，其群落如何演替，對(duì)病原菌的抑制是否同時(shí)也抑制了環(huán)境常在菌，這些需要進(jìn)一步研究，以指導(dǎo)生產(chǎn)科學(xué)規(guī)范地使用該類制品。