付士朋 沈宏偉 王謙博 李俊萍 王聰 郭盛磊 王振月

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定不同采收期赤芍中6種有效成分含量的方法，并探討其變化規(guī)律，以確定最佳采收期。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定樣品中沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷的含量并進(jìn)行主成分分析。色譜柱為T(mén)hermo C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 ?L。結(jié)果：上述6種成分的質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.013 2～0.25 mg/mL（r=0.999 2）、0.013 2～0.25 mg/mL（r=0.999 9）、0.026 8～0.51 mg/mL（r=0.999 7）、0.42～8.01 mg/mL（r=0.999 2）、0.016～0.31 mg/mL（r=0.999 4）、0.02～0.38 mg/mL（r=0.999 8）;定量限分別為0.009 3、0.008 5、0.016 3、0.021 7、0.011 3、0.017 4 mg/mL，檢測(cè)限分別為0.003 3、0.002 7、0.005 4、0.007 3、0.003 8、0.005 9 mg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%;加樣回收率為 96.01%～99.43%（RSD=1.23%，n=9）、97.95%～100.45%（RSD=0.79%，n=9）、97.98%～100.11%（RSD=0.68%，n=9）、98.83%～100.09%（RSD=0.65%，n=9）、98.58%～100.95%（RSD=1.35%，n=9）、96.28%～103.26%（RSD=1.76%，n=9）。赤芍藥材（根）中上述6種成分的含量分別為0.016%～0.057%、0～0.067%、0.207%～0.640%、2.350%～5.887%、0.030%～0.245%、0.054%～0.381%。5月30日采收的赤芍藥材折干率最低（約33%），9月15日折干率最高（約49%）。7-10月采收的赤芍葉中沒(méi)食子酸、芍藥內(nèi)酯苷的含量均高于根部。主成分分析結(jié)果顯示，前2個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為71.845%、18.170%，累積方差貢獻(xiàn)率為90.015%;綜合得分較高的月份為5-6月、9-10月。結(jié)論：所建含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性、精密度較好，可用于測(cè)定不同采收期赤芍藥材中6種有效成分的含量測(cè)定;赤芍藥材的最佳采收期為9月30日-10月15日，葉可在7月15日前后采收。

關(guān)鍵詞 赤芍;根;葉;采收期;高效液相色譜法;含量測(cè)定;變化規(guī)律;主成分分析

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for content determination of 6 active ingredients in Paeonia lactiflora during different harvest periods， and to investigate its variation rules so as to determine the optimal harvesting period. METHODS： HPLC method was adopted to determine the contents of gallic acid， catechin， alibiflorin， paeoniflorin， benzoic acid and benzoylpaeoniflorin， and principal component analysis was conducted. The determination was performed on Thermo C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 230 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 10 ?L. RESULTS： The linear range of the above 6 ingredients were 0.013 2-0.25 mg/mL（r=0.999 2）， 0.013 2-0.25 mg/mL （r=0.999 9）， 0.026 8-0.51 mg/mL（r=0.999 7）， 0.42-8.01 mg/mL（r=0.999 2）， 0.016-0.31 mg/mL （r=0.999 4）， 0.02-0.38 mg/mL（r=0.999 8）， respectively. The limits of quantification were 0.009 3， 0.008 5， 0.016 3， 0.021 7， 0.011 3， 0.017 4 mg/mL， and the limits of detection were 0.003 3， 0.002 7， 0.005 4， 0.007 3， 0.003 8， 0.005 9 mg/mL. RSDs of precision， stability and repeatability tests were less than 2%. The recoveries were 96.01%-99.43% （RSD=1.23%， n=9）， 97.95%-100.45% （RSD=0.79%， n=9）， 97.98%-100.11% （RSD=0.68%， n=9）， 98.83%-100.09% （RSD=0.65%， n=9）， 98.58%-? 100.95% （RSD=1.35%， n=9）， 96.28%-103.26% （RSD=1.76%， n=9）. The contents of above 6 ingredients in Radix Paeoniae Rubra （roots） were 0.016%-0.057%， 0-0.067%，0.207%-0.640%， 2.350%-5.887%， 0.030%- 0.245%，0.054%-

0.381%， respectively. On May 30th， the drying rate of Radix Paeoniae Rubra was the lowest （about 33%）， and on Sept. 15th， the drying rate was the highest （about 49%）. The contents of gallic acid and paeoniflorin in the leaves of P. lactiflora were higher than the root during Jul.-Oct. Results of principal component analysis showed that the variance contribution rates of the first two principal components were 71.845% and 18.170%， respectively; cumulative variance contribution rate was 90.015%. The months with higher comprehensive scores were May to Jun. and Sept. to Oct.? CONCLUSIONS： Established method is simple， accurate， reproducible and precise. It can be used to determine the contents of 6 active ingredients in Radix Paeoniae Rubra during different harvest periods. Sept. 30th to Oct. 15th is the optimum harvesting? periods for Radix Paeoniae Rubra， and leaves can be harvested around Jul. 15th.

KEYWORDS? ?Paeonia lactiflora; Roots; Leaves; Harvesting period; HPLC; Content determination; Variation rule; Principal component analysis

赤芍為毛茛科芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（Paeonia vitchii Lynch）的干燥根，具有清熱涼血、散淤止痛的功效[1]。該藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品[2]，其藥理活性成分主要包括酚酸類(lèi)、單帖苷類(lèi)及苯肽類(lèi)成分[2-3]。現(xiàn)代研究表明，該藥具有調(diào)節(jié)免疫、解痙攣、抗炎、抗驚厥、改善心肺功能、抑制癌細(xì)胞增殖等作用[4-6]。目前，有關(guān)赤芍的研究主要集中在藥理作用、化學(xué)成分提取與分離等方面[7-8]，而對(duì)其最佳采收期的研究較少，僅有2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中規(guī)定赤芍可在春秋二季采挖[1]。

同一地區(qū)藥材因采收時(shí)間不同，其有效成分的含量也會(huì)存在差異，這對(duì)藥材的質(zhì)量有較大的影響，因此可通過(guò)有效成分含量的高低來(lái)確定最佳采收期[9]，以確保藥材質(zhì)量。本課題組在研究刺五加時(shí)發(fā)現(xiàn)，其葉中所含成分與根中基本一致[10-11]，提示中藥不同部位的成分可能相似;同時(shí)，目前關(guān)于赤芍葉中有效成分的研究較少。為此，本研究從開(kāi)發(fā)藥材新的藥用部位、避免資源浪費(fèi)的角度出發(fā)，在探討同一年不同月份內(nèi)赤芍化學(xué)成分是否存在規(guī)律性變化的同時(shí)，比較了其根與葉中有效成分含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以確定赤芍的最佳采收期，旨在為其規(guī)范化種植與采收提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、EmpowerTM 3色譜工作站（美國(guó)Waters公司）;FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）;AE240型十萬(wàn)分之一電子天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司];H1650型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）;KM-822C型超聲波清洗機(jī)（廣州市科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：Y19M8C36143，純度：≥98%）、兒茶素對(duì)照品（批號(hào)：Y89W8F4653，純度：≥98%）、芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品（批號(hào)：Y25F8H30152，純度：≥98%）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：X12A8C33672，純度：≥98%）、苯甲酸對(duì)照品（批號(hào)：Z18S7H21155，純度：≥98%）、苯甲酰芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：P02D7F26004，純度：≥98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;乙腈為色譜純，甲醇等其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

11批赤芍樣品（編號(hào)：S1～S11;其中，赤芍根以“赤芍藥材”表示，葉以“赤芍葉”表示）均采集于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王振月教授鑒定為毛茛科芍藥（P. lactiflora Pall.）的干燥根或葉，樣品信息來(lái)源見(jiàn)表1。赤芍藥材采集后立即洗去泥沙，稱(chēng)定鮮質(zhì)量，于40 ℃烘干，稱(chēng)定干質(zhì)量。赤芍藥材和赤芍葉粉碎后過(guò)40目篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil ODS-2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，5%A→9%A;8～20 min，9%A→10%A;20～24 min，10%A→13%A;24～28 min，13%A;28～38 min，13%A→16%A;38～48 min，16%A→23%A;48～52 min，23%A→30%A;52～70 min，30%A→70%A）;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：10 ?L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷對(duì)照品適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解制成含上述6種成分質(zhì)量濃度分別為0.25、0.25、0.51、8.01、0.31、0.38 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取赤芍藥材或赤芍葉粉末1 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加80%甲醇10 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率：480 W，頻率：40 kHz）提取45 min，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，以4 000 r/min離心3 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 以80%甲醇為陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（編號(hào)：S1）、陰性對(duì)照溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)不低于3 000，陰性對(duì)照無(wú)干擾，各成分分離度均大于3，詳見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥刹煌|(zhì)量濃度的系列線性工作溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷的定量限分別為0.009 3、0.008 5、0.016 3、0.021 7、0.011 3、0.017 4 mg/mL，檢測(cè)限分別為0.003 3、0.002 7、0.005 4、0.007 3、0.003 8、0.005 9 mg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD分別為0.63%、0.65%、0.38%、0.54%、0.83%、0.97%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S1）適量，分別于室溫放置0、2、4、8、12 h時(shí)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD分別為0.63%、0.76%、0.53%、0.66%、0.71%、0.65%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取赤芍藥材粉末（編號(hào)：S1）1 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中6種成分的含量。結(jié)果，沒(méi)食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷含量的RSD分別為1.13%、1.11%、1.22%、1.34%、1.28%、1.34%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的赤芍藥材粉末（編號(hào)：S1）1 g，共6份，分別按各已知含量的50%、100%、150%比例加入各單一對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確度良好，詳見(jiàn)表3。

2.10 赤芍藥材樣品含量測(cè)定

取11批赤芍藥材粉末各1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中6種成分的含量。每樣品平行測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.11 不同采收期赤芍藥材折干率的動(dòng)態(tài)變化

計(jì)算不同采收期赤芍藥材的折干率：折干率=（干質(zhì)量/鮮質(zhì)量）×100%。折干率越高表示藥材所含水份越少[12]。以采收期（x）為橫坐標(biāo)、折干率（y，%）為縱坐標(biāo)繪制折干率動(dòng)態(tài)變化柱狀圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，不同采收期赤芍藥材的折干率存在差異，其中5-10月采收的赤芍藥材折干率總體呈上升趨勢(shì);8月30日-10月15日折干率均大于48%，并在9月15日達(dá)到最高值，約為49%;5-6月折干率較低，在5月30日達(dá)最低，約為33%。

2.12 不同采收期赤芍藥材中有效成分的動(dòng)態(tài)變化

以采收期（x）為橫坐標(biāo)、有效成分含量（y，%）為縱坐標(biāo)，繪制有效成分含量動(dòng)態(tài)變化折線圖，結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4（因芍藥苷含量過(guò)大，約為其他成分的10倍，在圖中會(huì)影響整體視圖效果，故將芍藥苷含量縮小10倍，縮小后不影響含量變化趨勢(shì)。由于芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的含量變化趨勢(shì)相似，且兒茶素、沒(méi)食子酸含量較低，所以6種成分無(wú)法在同一圖中展示，故分別作圖分析）。

從圖3可知，5-10月采收的赤芍中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷含量波動(dòng)幅度較大，總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。5月15日采收的赤芍藥材中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷含量均為最高，分別為0.640%、5.887%、0.381%;10月30日采收的赤芍藥材中芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷含量最低，分別為0.207%、0.054%;芍藥苷在9月15日時(shí)為最低值，為2.350%。8-10月含量波動(dòng)幅度較5-7月平緩;10月30日采收的赤芍藥材中的3 種成分均又出現(xiàn)下降趨勢(shì)，苯甲酰芍藥苷含量下降明顯。

從圖4可知，5-10月采收的赤芍藥材中沒(méi)食子酸含量波動(dòng)幅度較小，兒茶素、苯甲酸含量波動(dòng)幅度相對(duì)較大。5月15日采收的赤芍藥材中沒(méi)食子酸、兒茶素含量均為最高，分別為0.057%、0.067%;但7月15日-8月30日采收的赤芍藥材中未檢測(cè)到兒茶素;7月30日采收的赤芍藥材中苯甲酸含量最高，為0.245%。