宋曉宇，薛 凌

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，121000，錦州，遼寧)

0 引言

肥厚性心肌病(HCM)是一種常見的遺傳性心血管疾病[1]，為常染色體顯性遺傳。臨床上多發(fā)生于青壯年，常有家族史。肥厚性心臟病發(fā)病率很高，全球發(fā)病率約為1/500[2]。臨床表現(xiàn)包括勞力性呼吸困難、疲勞、暈厥、猝死、中風(fēng)及心衰。該病病程個(gè)體差異較大，雖然大多數(shù)患者壽命并未明顯縮短，但若本人有暈厥史、室性心動過速及心室壁厚度超過3.0 cm以上者或家屬有猝死者，則患者發(fā)生猝死的概率明顯增加[3]。目前研究表明HCM由11個(gè)或更多編碼心臟肌節(jié)蛋白基因中的1 400多個(gè)突變引起[4]，其中心臟β－肌球蛋白重鏈(MYH7)基因是HCM發(fā)病最主要的致病基因，目前已報(bào)道國內(nèi)HCM相關(guān)MYH7基因致病性突變有66個(gè)[5]。本研究通過等位基因特異性擴(kuò)增法研究遼寧地區(qū)HCM患者發(fā)病與MYH7基因多態(tài)性位點(diǎn)的臨床相關(guān)性，在基因?qū)用媪私獗镜貐^(qū)HCM發(fā)病可能易感基因位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

受試對象為2017年12月至2018年9月于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院住院及體檢人員。病例組為HCM患者共87例，男性40例，女性47例，平均年齡49.38±17.13歲，納入標(biāo)準(zhǔn):a)超聲心動圖提示左心室壁厚度≥15 mm;2)超聲心動圖提示室間隔厚度≥15 mm。排除標(biāo)準(zhǔn):1)其他引發(fā)心肌增厚的疾病如高血壓、風(fēng)濕性心臟病、先心病等;2)自身免疫性疾病、遺傳性疾病、代謝性疾病等。對照組為體檢健康人員共174例，其中男性82例，女性92例，平均年齡47.02±16.55歲。本研究已告知受試者并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA 采集5 mL外周靜脈血，使用血液標(biāo)本DNA提取試劑盒提取樣本DNA，血液樣品先通過紅細(xì)胞裂解液將血液中的紅細(xì)胞破壞，裂解后收集白細(xì)胞，加入裂解緩沖液裂解白細(xì)胞，使白細(xì)胞中的DNA釋放到溶液中，之后將蛋白質(zhì)沉淀，分離到上清液，加入異丙醇、酒精，將DNA沉淀，最后加雙蒸水得到DNA溶液。

1.2.2 等位基因特異性擴(kuò)增 位點(diǎn)rs397516252和rs187073962的序列通過UCSU數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索(http://genome.ucsc.edu/)，由里來生物公司設(shè)計(jì)引物并合成。PCR反應(yīng)條件為37℃10 min;95℃5 min;95℃15 s;60℃60 s，后2個(gè)步驟進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。通過熒光對照驗(yàn)證PCR的有效性。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS13.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述及分析使用，采用頻數(shù)及均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述，采用Pearsonχ2檢驗(yàn)對組間SNP位點(diǎn)的分布差異進(jìn)行分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組臨床資料比較

HCM組平均年齡49.38±17.13，男女比例40∶47，對照組平均年齡47.02±16.55，男女比例82∶92，統(tǒng)計(jì)分析顯示2組間年齡及性別無顯著差異(P＞0.05)，提示本研究納入的2組實(shí)驗(yàn)對象差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以進(jìn)行對比分析，如表1所示。

表1 2組臨床資料比較

2.2 SNP位點(diǎn)rs397516252的組間比較

SNP位點(diǎn)rs397516252已通過哈迪－溫伯格遺傳平衡檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析表明HCM組中CC基因型、CG基因型及GG基因型的頻數(shù)分別為82例、3例、2例;對照組中CC基因型、CG基因型及GG基因型的頻數(shù)分別為173例、1例、0例。2組間基因型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)，2組間等位基因分布也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)，如表2所示。

2.3 SNP位點(diǎn)rs187073962的組間比較

統(tǒng)計(jì)分析表明HCM組中GG基因型、GA基因型及AA基因型的頻數(shù)分別為71例、11例、5例;對照組中GG基因型、GA基因型及AA基因型的頻數(shù)分別為151例、17例、6例。HCM組中G等位基因及A等位基因發(fā)現(xiàn)頻數(shù)分別為153例、21例;對照組中G等位基因及A等位基因發(fā)現(xiàn)頻數(shù)分別為319例及29例。2組間基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，如表3所示。

表2 2組間rs397516252比較

表3 2組間rs187073962比較

3 討論

肥厚性心肌病(HCM)是以室間隔不對稱肥厚為特征的遺傳性心臟病，以常染色體顯性遺傳為主要遺傳學(xué)方式[6]。臨床表現(xiàn)有時(shí)可無癥狀，有時(shí)表現(xiàn)為心悸、胸悶、室性心律失常、暈厥及猝死等[7]。其病理特征主要為心肌細(xì)胞肥大、心腔縮小及心肌纖維化等表現(xiàn)[8]。目前研究發(fā)現(xiàn)眾多基因與HCM發(fā)病有關(guān)，尤其是心臟β－肌球蛋白重鏈(MYH7)基因。因此，從基因?qū)用嫜芯縃CM的病因及發(fā)病機(jī)制，可為未來臨床治療提供更多的可能。

心臟β－肌球蛋白重鏈(MYH7)基因，位于14號染色體q11.2位置，共包含40個(gè)外顯子，編碼心臟肌球蛋白的β(或慢)重鏈亞基。肌球蛋白是一種六聚體蛋白，包含2個(gè)重鏈亞基，2個(gè)堿輕鏈亞基和2個(gè)調(diào)節(jié)性輕鏈亞基，主要在正常人的心室中表達(dá)，同時(shí)也可在骨骼肌中表達(dá)。目前眾多研究表明MYH7基因的突變與肥厚型心肌病，肌球蛋白儲存型肌病，擴(kuò)張型心肌病有關(guān)[9－12]。Marsiqlia等人共篩選了78個(gè)MYH7基因突變與HCM的發(fā)病有關(guān)[13]。劉長清等人表明攜帶有MYH7基因的HCM患者可表現(xiàn)高動力收縮和舒張功能受限[14]。Liu等人對中國漢族10個(gè)HCM患者家系進(jìn)行調(diào)查研究，在其中的3個(gè)家系發(fā)現(xiàn)了MYH7突變(分別為Arg663His，Glu924Lys和Ile736Thr)，并且其中有3個(gè)患者在20－48歲時(shí)猝死，提示這3個(gè)MYH7基因突變?yōu)镠CM的致病性突變，尤其與猝死高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[15]。此外，MATTOS等人對巴西南部HCM患者進(jìn)行的首次遺傳分析發(fā)現(xiàn)有58%的個(gè)體存在MYH7基因突變，且在大多數(shù)存在突變的個(gè)體中發(fā)生了MYH7相關(guān)疾病[16]。眾多研究均發(fā)現(xiàn)MYH7基因突變與HCM發(fā)病相關(guān)，但不同地域發(fā)現(xiàn)的MYH7基因變異不盡相同，本研究選取了2個(gè)MYH7基因多態(tài)性位點(diǎn)(rs397516252和rs187073962)，探討本地區(qū)HCM易感基因位點(diǎn)。NCBI數(shù)據(jù)庫中rs397516252提示可能致病性，而rs187073962位點(diǎn)性質(zhì)不確定。本研究與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄結(jié)果有所差異，rs397516252位點(diǎn)組間基因型及等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，rs187073962位點(diǎn)組間基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示本地區(qū)MYH7基因多態(tài)性位點(diǎn)rs397516252可能與HCM發(fā)病有關(guān)，而位點(diǎn)rs187073962變異對本地區(qū)HCM發(fā)病無影響。

綜上，SNP位點(diǎn)rs397516252可能為遼寧地區(qū)漢族人群HCM的易感基因位點(diǎn)，而位點(diǎn)rs187073962可能與本地區(qū)HCM發(fā)病無關(guān)。本研究中主要分析SNP位點(diǎn)變異散在分布，后續(xù)應(yīng)對本研究中基因改變陽性病例的家系進(jìn)行研究，以分析易感基因位點(diǎn)的遺傳學(xué)特征。此外增加研究對象，擴(kuò)大樣本量可使研究結(jié)果進(jìn)一步得到驗(yàn)證，從基因?qū)用娓玫难芯縃CM疾病病因及發(fā)病機(jī)制。