林道斌，楊 華，程亞偉

(海南省中醫(yī)院脾胃肝病科 海口 570000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指排除酒精性因素及其他明確肝損害因素外，以甘油三酯為主的脂肪類物質(zhì)在肝細(xì)胞中異常堆積為主要病理特征的一種肝臟代謝疾病[1]。大量脂肪類物質(zhì)在肝臟的蓄積極易誘發(fā)肝細(xì)胞脂肪變性及炎癥反應(yīng)，致使肝纖維化形成，最終將導(dǎo)致肝臟惡性病變的發(fā)生[2]。流行病學(xué)調(diào)查表明，NAFLD在我國的發(fā)病率約為15%[3]，積極發(fā)掘治療NAFLD的藥物已刻不容緩。

山楂為常見的藥食兩用類藥物，有文獻(xiàn)表明對NAFLD有著良好治療效果[4]。山楂提取物山楂總黃酮能從抗氧化應(yīng)激[5]、促進(jìn)肝臟脂質(zhì)代謝[6]、抗血小板聚集[7]等多個方面對NAFLD產(chǎn)生治療作用。目前關(guān)于山楂的中藥藥理學(xué)研究多從單個成分展開，與中草藥多成分、多靶點發(fā)揮功效的實質(zhì)相悖。因此課題組運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[8]方法，研究山楂治療NAFLD的作用機制，并為進(jìn)一步試驗室研究提供先導(dǎo)信息。

1 材料與方法

1.1 山楂主要活性成分及作用靶點篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)是由西北農(nóng)林科技大學(xué)依托文獻(xiàn)挖掘和數(shù)據(jù)庫整合建立的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺。該數(shù)據(jù)庫收錄了500 味常用中藥以及30069 個中藥化合物的藥物化學(xué)和藥物-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)-疾病網(wǎng)絡(luò)、藥物代謝動力學(xué)的基本信息[9]，是目前研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)最常用的的數(shù)據(jù)庫。通過該數(shù)據(jù)庫檢索山楂的所有活性成分，再根據(jù)口服利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18進(jìn)一步篩選藥物的主要活性成分，OB和DL是評判藥物有效利用度的關(guān)鍵指標(biāo)。一般而言，OB≥30、DL≥0.18的活性成分可視為藥物的主要活性成分[10]。再通過TCMSP檢索各個活性成分的作用靶點蛋白，然后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫[11]將獲取的蛋白名稱轉(zhuǎn)換為基因名。

1.2 疾病靶點的獲取與交集靶點的篩選

運用gene cads數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)[12]、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM) (http://www.omim.org/)[13]和治療靶點數(shù)據(jù)庫(TTD) (http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)[14]尋找NAFLD的疾病靶點建立數(shù)據(jù)集，并與1.1篩選出的藥物靶點進(jìn)行vnne分析，獲取交集靶點。

1.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的建立

運用Cytoscape3.6.1軟件[15]建立活性成分-靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，再通過Network Analysis插件分析各個節(jié)點的度值(Dgree)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的Dgree大小做進(jìn)一步分析。

1.4 京都基因與基因組百科全書通路注釋分析

最后再將1.2獲取的交集靶點導(dǎo)入DAVID在線平臺(https://david.ncifcrf.gov/)[16]行GO、KEGG功能注釋和富集分析。在DAVID平臺，基因標(biāo)識符合選擇OFFICIFAL-GENE-SYMBOL，基因背景欄勾選HomoSapiens，然后選擇“Functional Annotation Tool”作為分析工具，所有檢取結(jié)果根據(jù)FDR(錯誤發(fā)現(xiàn)率)<0.01進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及藥物靶點篩選結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫并無山楂常用藥用部位果肉的條目，但有山楂葉相關(guān)條目。后通過檢索文獻(xiàn)[17]山楂葉活性成分與果肉相似，并常作為代用品使用。故以TCMSP數(shù)據(jù)庫中山楂葉活性成分作為研究對象，并根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18作為條件共檢索到6種主要活性成分，分別是槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、異鼠李素(isorhamnetin)、豆甾醇(Stigmasterol)、表兒茶素(ent-Epicatechin)、谷甾醇(sitosterol)等。藥物靶點共檢索到279個，去重保留唯一值后有194個，6種活性成分均有各自的作用靶點。

2.2 交集靶點篩選結(jié)果與活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的建立

以NAFLD的英文全稱non alcohol fatty liver disease為關(guān)鍵詞，在genecads數(shù)據(jù)庫共找到3538個相關(guān)靶點基因，OMIM數(shù)據(jù)庫找到202個，TTD數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)相關(guān)靶點。上述靶點去重保留唯一值后共獲得NAFLD靶點基因3645個，與2.1經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫校正過基因名的靶點進(jìn)行vnne分析后，確定了148個山楂治療NAFLD發(fā)揮作用靶點(見圖1)。而后將這148個靶點與其對應(yīng)的活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件后，建立一個各個節(jié)點聯(lián)系密切的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(見圖2)。在該圖中共有154個節(jié)點，綠色三角形的活性成分節(jié)點有6個，紅色圓形的靶點節(jié)點有148個。本研究還運用Cytoscape 中的Network Analysis-Analyze Network插件對該網(wǎng)絡(luò)圖中的每個節(jié)點進(jìn)行分析，得到網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點的度值(Degree)，槲皮素、山柰酚、異鼠李素、豆甾醇等4個活性成分節(jié)點Degree明顯高于表兒茶素和谷甾醇(見表1)，這也意味著這4種活性成分在山楂治療NAFLD過程中占有重要地位。靶點方面，Degree均值約等于1，有48個靶點節(jié)點Degree高于均值(見表2)，這些靶點可能是山楂治療NAFLD的關(guān)鍵調(diào)控靶點，Degree均值最高的10個靶點分別是前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)、雄激素受體(AR)、一氧化氮合酶(NOS3)、二肽基肽IV(DPP4)、絲氨酸蛋白酶1(PRSS1)、凝血因子VII(F 7)、單胺氧化酶B(MAOB)、轉(zhuǎn)錄因子P65(RELA)。

表1 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中活性成分關(guān)鍵節(jié)點拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

表2 在活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中高于靶點均值的基因比較

圖1 藥物靶點與HAG疾病靶點vnne分析圖

圖2 活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(節(jié)點大小與Degree成正比)

2.3 GO功能注釋及KEGG通路富集分析結(jié)果

利用DAVID平臺的GO和PATHWAY富集分析功能對148個靶點進(jìn)行研究，GO富集分析中根據(jù)FDR<0.01確定350條GO條目，涉及生物過程的有260條，如對藥物反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)等。涉及分子功能的有60條，如酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性等。涉及細(xì)胞組成的有30條，如細(xì)胞外空間、細(xì)胞質(zhì)、膜筏等。同時根據(jù)FDR<0.01共找到97條作用通路，如癌癥通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路等(表3表4分別列舉了FDR最小的前20條GO和KEGG通路分析結(jié)果)。

表3 潛在靶點的GO分析結(jié)果比較(FDR<0.01)

表4 潛在靶點的KEGG分析結(jié)果比較(FDR<0.01)

3 討論

本研究共發(fā)現(xiàn)6種主要活性成分及148個作用靶點，其中Degree值最高的4種主要成分里，槲皮素能通過抑制炎癥因子表達(dá)[18]、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]、改善胰島素抵抗[20]及脂代謝紊亂[21]等諸多途徑對NAFLD產(chǎn)生治療作用。另一化合物山柰酚也有類似抗炎[22]和抗氧化[23]作用，異鼠李素可以抑制膠原蛋白的形成[24]、抗肝纖維化，并且可以抑制PPARγ的表達(dá)，防治肝脂肪變性[25]。豆甾醇可以提高過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽的表達(dá)[26]以及降低過氧根離子的生成速率，清除肝內(nèi)氧自由基，降低肝脂肪過氧化[27]

靶點方面，前10個靶點分別為PTGS1、PTGS2、PPARG、AR、NOS3、DPP4、PRSS1、F7、MAOB、RELA等。其中前列腺素G/H合酶1(PTGS1)和前列腺素G/H合酶2(PTGS2)又稱環(huán)氧化酶(COX1/2)[28]是將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵性限速酶[29]，COX1為結(jié)構(gòu)型同工酶，COX2為誘導(dǎo)型同工酶[30]。COX1廣泛分布于人體的組織臟器如胃、腎、血管等，對調(diào)節(jié)胃、腎的血流量、血管舒張、胃黏液分泌起重要作用，維持著機體的正常生理過程[31]。但COX1在NAFLD的疾病過程中扮演的角色目前鮮有報道，研究主要集中在另一種亞型COX2上。

圖3 潛在靶點的GO分析結(jié)果條形圖(FDR<0.01)

圖4 97條KEGG分析結(jié)果氣泡圖(FDR<0.01)

COX2在正常細(xì)胞中的表達(dá)水平很低，但在刺激因子如炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素等作用下會急劇上調(diào)，通過調(diào)高前列腺素的合成參與機體的炎癥反應(yīng)[32]。有報道稱[33]，COX2的表達(dá)水平與肝功能損傷程度成比。在NAFLD早期由于肝細(xì)胞脂肪變性可誘導(dǎo)COX2的高表達(dá)[34]，而COX2及其介導(dǎo)產(chǎn)生的白介素-6、腫瘤壞死因子-α、前列腺素等又會干擾正常的肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝過程[35]，從而形成惡性循環(huán)。結(jié)合目前研究，山楂可能通過作用于環(huán)氧化酶靶點控制炎癥反應(yīng)，恢復(fù)肝臟正常脂質(zhì)代謝。

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG) 是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，目前已發(fā)現(xiàn)有3種亞型PPARα、PPARβ、PPARγ等[36]。其中由PPARG編碼的PPARγ如果過度表達(dá)，可抑制環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件與蛋白的結(jié)合，誘導(dǎo)肝脂肪細(xì)胞變性[37]，進(jìn)而演變?yōu)榉蔷凭灾拘愿窝?non-alcoholic steatohepatitis，NASH)。但值得注意的是，如果敲除小鼠PPARγ基因反而會促進(jìn)NASH的形成[38]。更有研究顯示[39]，PPARγ可以調(diào)高脂聯(lián)素的表達(dá)，控制炎癥因子的分泌，延緩肝纖維化進(jìn)程。并且PPARγ還可以增加肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶以及乙酰輔酶A的表達(dá)減少肝脂肪沉積[40]?？偟膩碚f，PPARγ既可以加速NAFLD疾病演變，又可以緩解脂肪變性及肝纖維化，其機理暫不明晰，可能與PPARγ的其他亞型有關(guān)。

雄激素受體(AR)屬于核受體超家族成員，分布于體內(nèi)多個組織臟器。由其介導(dǎo)的雄激素在糖脂代謝過程中發(fā)揮著重要作用。AR可以提高雄激素的釋放,從而加強對肝內(nèi)硬脂酰輔酶A去飽和酶1、脂蛋白酯酶、脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶等多個脂代謝關(guān)鍵酶的調(diào)控，維持脂肪合成與分解的穩(wěn)態(tài)[41]。另外，雄激素可以降低腫瘤壞死因子α、白介素6、白介素1β的表達(dá)水平[42]，減輕炎癥因子對肝細(xì)胞的損害。山楂作用于AR靶點，可從調(diào)控脂代謝及炎癥反應(yīng)途徑產(chǎn)生治療作用。

NOS3又稱內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，是人體內(nèi)合成一氧化氮(NO)的關(guān)鍵性合成酶之一[43]，尤其合成的NO在肝臟損傷時脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激反應(yīng)中占有重要地位，過量合成的NO會破壞NO與O2-的平衡，生成過氧化亞硝酸陰離子，繼而造成不飽和脂肪酸、膽固醇、超氧化物歧化酶的氧化[44]，加劇氧化應(yīng)激程度，造成嚴(yán)重后果。故而山楂作用于eNOS靶點，可減輕NAFLD時的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

二肽基肽IV(DPP4)既往研究多集中于治療2型糖尿病的作用。但近年來研究發(fā)現(xiàn)[45]，DPP4還參與多種慢性肝病的發(fā)生發(fā)展，其中就包括NAFLD。DPP4參與NAFLD的機制與其促進(jìn)胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)降解有關(guān)[46]，GLP-1可以提高機體對胰島素的敏感性，減少肝臟脂肪沉積以及調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸代謝[47]。而DPP4的高表達(dá)會導(dǎo)致GLP-1的大量失活，導(dǎo)致上述生物過程的失控，所以抑制DPP-4可以改善肝細(xì)胞脂肪變性，山楂作用于該靶點，可能也扮演著DPP-4抑制劑的角色。

PRSS1在受到炎癥因子的刺激時會繼發(fā)磷酸化[48]，而磷酸化過程會阻礙胰島素受體底物正常的酪氨酸磷酸化[49]，繼而使胰島素受體底物與SH2結(jié)構(gòu)域信號分子結(jié)合受阻[50]，干擾胰島素信號傳導(dǎo)而誘發(fā)胰島素抵抗。凝血因子VII(F7)在NAFLD導(dǎo)致的肝臟損傷時，肝星狀細(xì)胞會在損傷部位募集，這一過程會誘導(dǎo)凝血因子的激活，將循環(huán)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，并促進(jìn)血小板聚集[51]，參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建。這也是抗凝血藥或抗血小板藥能夠治療肝纖維化的機制之一[52]。

MAOB屬于黃素結(jié)合蛋白(MAO)的一種亞型[53]。MAO廣泛分布于人體心、肺、肝、腎等器官，能夠通過與氧離子結(jié)合催化細(xì)胞中的單胺氧化反應(yīng)[54]在肝臟發(fā)生病變時，如NAFLD疾病過程中，在刺激因子的作用下MAO能夠提高膠原與彈性蛋白結(jié)合率，形成大量膠原纖維，繼而引發(fā)肝纖維化的發(fā)生。RELA又稱轉(zhuǎn)錄因子P65，是NF-κB發(fā)揮作用的重要異源二聚體之一[55]。NF-κB通路在機體內(nèi)會促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖，并釋放炎癥因子，從而加速肝纖維化的發(fā)展[56]。并且有研究表明，抑制NF-κB通路的信號傳導(dǎo)，可以減輕肝臟的炎癥反應(yīng)，緩解肝臟損傷[57]。因此推測，山楂可以從調(diào)節(jié)胰島素抵抗、抗炎、抗纖維化等多個層面對NAFLD形成治療作用。

本研究還通過DAVID平臺，根據(jù)FDR<0.01確定了97條相關(guān)通路，如HIF-1[58]和TNF[59]信號通路均可引起肝星狀細(xì)胞的增殖，誘發(fā)肝纖維化。Toll樣受體信號通路對病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式的識別，會激活一系列炎癥級聯(lián)反應(yīng)，所產(chǎn)生的炎癥因子對肝細(xì)胞持續(xù)刺激，會導(dǎo)致膠原蛋白和基質(zhì)蛋白在肝內(nèi)的沉著，引起肝纖維化[60]。胰島素信號通路與NAFLD關(guān)系密切，因脂質(zhì)異常[61]、炎癥反應(yīng)[62]、轉(zhuǎn)錄因子X-Box結(jié)合蛋白1表達(dá)增加[63]等，導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)障礙，繼而引發(fā)的胰島素抵抗，不僅是“二次打擊”假說的核心[64]，而且也被“多重打擊”學(xué)說認(rèn)為是關(guān)鍵因素之一[65]，所以對相關(guān)通路的調(diào)控也是山楂治療NAFLD的關(guān)鍵步驟。

綜上，本研究共發(fā)現(xiàn)6種主要活性成分和治療過程中的148個關(guān)鍵靶點以及97條關(guān)鍵通路，結(jié)果與已有文獻(xiàn)結(jié)論基本吻合，具有一定科學(xué)性，可為下一步的實驗提供參考與借鑒。