梁 敏 許 興 丁向真 李志英 鄭 蕊 楊淑娟 毛桂蓮

(1寧夏大學生命科學學院,寧夏 銀川 750021;2寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室,寧夏 銀川 750021;3寧夏大學西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復與重建教育部重點實驗室,寧夏 銀川 750021)

鹽脅迫對植物的傷害主要是大量Na+進入細胞后會破壞K+和其他金屬元素的吸收,引起滲透脅迫、離子毒害和氧化脅迫[1]。植物在長期進化過程中逐漸形成相應的機制適應多樣化的環(huán)境變化,鹽生植物主要通過限制根系Na+的內(nèi)流、控制根系木質(zhì)部Na+的加載、Na+通過木質(zhì)部的回收及韌皮部的再循環(huán)和促進植物體內(nèi)Na+的外排等適應鹽漬環(huán)境[2-4]。也有研究表明,鹽生植物自身抵御植物鹽害的有效策略之一是通過質(zhì)膜和液泡膜上的Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白與H+-ATPase 互作調(diào)節(jié)植物在鹽脅迫下Na+的吸收及轉(zhuǎn)運[5-7]。

枸杞(Lycium barbarumL.)作為茄科枸杞屬落葉灌木中唯一屬鹽生植物,在寧夏鹽堿地有大面積的種植,是改良鹽堿地的先鋒植物[8]。目前,對枸杞抗鹽機理的研究,如NaCl 脅迫下的滲透調(diào)節(jié)、光合作用、抗氧化保護等方面都取得了一定的成果[9-11],但有關枸杞在分子水平的耐鹽機理鮮有報道,尤其是寧夏枸杞離子平衡調(diào)控方面。為此,本研究以寧夏枸杞為材料,開展鹽脅迫寧夏枸杞Na+、K+含量,質(zhì)膜和液泡膜Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白和H+-ATPase基因表達變化以及與Na+濃度的相關性分析,探索鹽脅迫下寧夏枸杞根Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白和H+-ATPase 與離子變化的關系,旨在為寧夏枸杞耐鹽機理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理試驗

選取枸杞寧杞1號種子(由寧夏農(nóng)林科學院提供),用0.1%高錳酸鉀溶液消毒10 min后種到基質(zhì)中,于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)。待兩片子葉展開后移苗進行水培,水培的營養(yǎng)液配方為霍蘭格式配方。每3 d更換一次營養(yǎng)液。待枸杞苗生長2個月,長出10片左右葉片后,選取長勢一致的枸杞苗進行不同濃度NaCl處理。試驗共設置4 組處理:0(CK)、50、100和200 mmol·L-1NaCl,分別于處理24 h、7 d和15 d時取根,一部分于液氮速凍后放-80℃冰箱保存?zhèn)溆?用于基因表達的研究;另一部分材料烘干后用于Na+、K+含量的測定。

1.2 離子相關基因的RT-qPCR檢測

取寧夏枸杞根于液氮中研磨,根據(jù)多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(Tiangen,北京)提取總RNA。用Hiscript? Qselect RT SuperMix for qPCR TIQU 試劑盒(Vazyme,南京)進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)枸杞基因組序列(未發(fā)表)設計引物(表1)。根據(jù)ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix 試劑盒(Tiangen,北京)進行qPCR 反應。RT-qPCR 反應體系(20 μL):2×ChamQTMSYBR qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 7.0 μL。PCR 反應程序:95℃預變性孵育3 min;95℃變性10 s,58℃退火30 s(退火溫度根據(jù)引物不同而異),共循環(huán)40次。每個樣品重復3次。使用Q5 熒光定量PCR 儀(America,ABI)進行RTqPCR 反應,采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 寧夏枸杞4個基因RT-qPCR 引物Table1 Primers for RT-qPCR of four genes in Lycium barbarum L.

1.3 根中Na+、K+含量的測定

將樣品烘干粉碎后取0.1 g,采用TAS-990 分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)測定Na+、K+含量[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Origin 8.0和SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并作圖,用Ducan 新復極差法進行方差分析(P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 寧夏枸杞根RNA的樣品質(zhì)量檢測

提取枸杞根樣品的總RNA,1%瓊脂糖電泳后,得到比較清晰的兩條帶28S和18S,無明顯的降解和拖尾現(xiàn)象,完整性好(圖1)。此外,測得的A260/A280值均約為2.0,表明提取的枸杞根RNA 純度高,且無明顯降解現(xiàn)象,可滿足后續(xù)試驗。

圖1 鹽脅迫下枸杞根總RNA的凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis total of RNA in Lycium barbarum L.roots under salt stress

2.2 鹽脅迫下寧夏枸杞LbSOS1和LbNHX1基因的表達分析

同一脅迫時間(24 h、7 d)下,隨著NaCl處理濃度(50～200 mmol·L-1)的增加,質(zhì)膜Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白基因LbSOS1和液泡膜Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白基因LbNHX1表達量總體呈升高趨勢(圖2-A、-C);當NaCl處理濃度為200 mmol·L-1時(24 h),LbSOS1和LbNHX1基因的相對表達量均達到最高,LbSOS1 相對表達量與CK相比分別增加了2.49倍和2.99倍,LbNHX1 相對表達量分別較CK 增加了11.68倍和3.62倍。鹽脅迫處理15 d時,100 mmol·L-1NaCl處理時LbSOS1和LbNHX1基因相對表達量均最高。同一NaCl處理濃度下,隨著脅迫時間的延長,LbSOS1表達量總體呈先升高后降低的趨勢(200 mmol·L-1除外)。除脅迫24 h 外,各NaCl處理下的LbNHX1表達量也呈先升高后降低的趨勢,且各處理間差異顯著(P＜0.05)。

2.3 鹽脅迫下寧夏枸杞LbHA1和LbVHA-C1基因的表達分析

由圖2-B可知,同一脅迫時間下,質(zhì)膜H+-ATPase基因LbHA1除100 mmol·L-1NaCl 脅迫24 h時相對表達量較低外,隨著NaCl處理濃度(50～200 mmol·L-1)的增加,LbHA1基因的相對表達量呈先升高后降低的趨勢,即NaCl處理濃度為100 mmol·L-1時其相對表達量最高,分別是CK的1.54倍、3.94倍和1.39倍。由圖2-D可知,液泡膜H+-ATPase基因LbVHA-C1 相對表達量變化趨勢與LbNHX1 一致(7 d除外)。同一脅迫時間下(24 h、7 d),隨NaCl處理鹽濃度的增加,LbVHA-C1 相對表達量呈升高趨勢。同一NaCl處理濃度下,隨著脅迫時間的延長,LbHA1基因的相對表達量總體呈降低趨勢(100 mmol·L-1除外),LbVHA-C1基因的相對表達量也呈下降趨勢,各個處理之間差異顯著(P＜0.05)。

圖2 鹽脅迫下寧夏枸杞根中離子相關基因的表達情況Fig.2 Expression of ion relative genes in Lycium barbarum L.under salt stress

2.4 鹽脅迫下寧夏枸杞根Na+、K+含量及Na+/K+比值的變化

由圖3-A可知,當脅迫處理24 h,NaCl處理濃度低于200 mmol·L-1時,寧夏枸杞根中Na+含量變化平緩,各NaCl處理間Na+含量差異不顯著(P＞0.05);NaCl處理濃度為200 mmol·L-1時,寧夏枸杞根的Na+含量達到最大,脅迫處理24 h、7 d和15 d時Na+含量較CK分別顯著增加了1.22倍、1.46倍和3.21倍。同一NaCl處理濃度下,隨著脅迫時間的延長,枸杞根系中Na+含量總體呈升高趨勢,200 mmol·L-1NaCl 脅迫15 d時枸杞根中Na+含量較脅迫24 h時顯著增加了0.98倍(P＜0.05)。由圖3-B可知,同一脅迫時間下(24 h和7 d),隨著NaCl處理濃度的增加,K+含量總體呈先升高后降低的趨勢,其中,50 mmol·L-1NaCl處理與CK相比分別增加了69.2%、14.7%。在低NaCl處理濃度下,隨著脅迫時間的延長,枸杞根中K+含量總體呈先升高后降低的趨勢,即脅迫7 d時各NaCl處理處理下枸杞的K+含量最高。由圖3-C可知,同一脅迫時間(24 h和7 d)下,隨著NaCl處理濃度的增加,枸杞根中Na+/K+比值呈先降低后升高的趨勢。同一NaCl處理濃度下,隨著脅迫時間的延長,寧夏枸杞根系中Na+/K+比值總體呈升高趨勢,200 mmol·L-1NaCl處理下Na+/K+比值達到最大,各個處理之間差異顯著(P＜0.05)。

圖3 鹽脅迫下寧夏枸杞根中Na+、K+含量及Na+/K+比值的變化Fig.3 Changes of Na+ content,K+ content and Na+/K+ ratio in Lycium barbarum L.roots under salt stress

2.5 枸杞根中Na+含量與離子相關基因表達量的相關性分析

不同脅迫時間下,枸杞根中Na+含量與離子相關基因LbSOS1、LbHA1、LbVHA-C1、LbNHX1表達量均存在一定的相關性。其中,枸杞根中Na+含量與基因LbSOS1表達量呈正相關關系,在脅迫24 h和7 d時,二者呈極顯著正相關關系(圖4-A)。在脅迫7 d時,枸杞根中Na+含量與基因LbNHX1表達量呈正相關關系;脅迫24 h時,Na+含量與基因LbNHX1表達量達到極顯著正相關;脅迫15 d時,Na+含量與基因LbNHX1表達量呈負相關(圖4-C)。在脅迫24 h和7 d時,Na+含量與基因LbHA1表達量均呈正相關關系,其中,脅迫24 h時,兩者呈顯著正相關;脅迫15 d時,枸杞根中Na+含量與基因LbHA1表達量呈負相關關系(圖4-B)。脅迫24 h時,枸杞根中Na+含量與基因LbVHA-C1表達量呈極顯著正相關關系;脅迫7 d時,Na+含量與基因LbVHA-C1表達量呈弱的正相關關系;脅迫15 d時,Na+含量與基因LbVHA-C1表達量呈負相關關系(圖4-D)。

3 討論

圖4 鹽脅迫下枸杞根中Na+含量與離子相關基因表達量的相關性分析Fig.4 Correlation analysis between Na+ content and expression abundance of ion relative genes in Lycium barbarum L.roots under salt stress

研究表明,植物耐鹽的主要途徑有滲透調(diào)節(jié)、Na+的吸收和外排、Na+和K+的選擇性吸收、離子的區(qū)隔化等[13-14]。植物遭遇鹽脅迫后體內(nèi)Na+含量增加,K+含量降低[15-17]。耐鹽植物在鹽脅迫下會吸收大量K+作為主要的滲透調(diào)節(jié)劑,從而減少對Na+的吸收,降低Na+/K+比值[18]。本試驗結(jié)果表明,在低濃度(＜200 mmol·L-1)NaCl 短期脅迫時,寧夏枸杞根中Na+含量變化平緩,K+含量總體呈升高后降低趨勢,Na+/K+比值呈降低趨勢,說明在低濃度鹽脅迫環(huán)境下通過吸收更多的K+,可維持細胞內(nèi)較低的Na+/K+比值,提高植物對Na+脅迫的耐受性;隨著NaCl處理濃度的增加,Na+含量升高,而K+吸收減少,是由于Na+、K+競爭K+的結(jié)合位點造成了Na+的毒害作用[19-20]。

質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白由SOS1基因調(diào)控表達,能夠依賴質(zhì)膜上H+-ATPase所形成的H+電化學梯度將細胞質(zhì)Na+排出體外內(nèi)使植物適應外界環(huán)境[21-22]。H+-ATPase和Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白的活性是反映植物鹽脅迫環(huán)境的關鍵指標之一[23-24]。研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫能夠增加擬南芥質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白和H+-ATPase活性[25]。前期試驗也證實,一定濃度范圍內(nèi)的鹽可以提高質(zhì)膜H+-ATPase活性[26]。本試驗RT-qPCR 結(jié)果顯示,在短期脅迫內(nèi),隨著NaCl處理濃度的增加,LbSOS1和LbHA1 相對表達量呈升高趨勢,說明適宜的鹽濃度(100 mmol·L-1)下,寧夏枸杞在短期脅迫內(nèi),細胞質(zhì)膜和液泡膜上的Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白將Na+運出細胞,從而維持細胞質(zhì)中Na+的穩(wěn)態(tài)和Na+/K+比值的相對穩(wěn)定。高鹽處理濃度(200 mmol·L-1NaCl)下,短期內(nèi)枸杞根中LbSOS1和LbHA1表達量較高,但不能將Na+及時排出,導致根系中Na+含量的積累,造成了對枸杞的傷害。液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白(NHX)普遍具有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH值,能夠?qū)褐械腘a+或K+區(qū)隔化到液泡中,以及維持細胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)等功能,在植物抗逆脅迫中有重要作用[27]。H+-ATPase活性的提高為液泡膜對Na+的區(qū)隔化及植物對K+選擇性吸收運輸提供了原初動力[28]。本研究結(jié)果表明,脅迫處理24 h時,液泡膜Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白基因LbNHX1、H+-ATPase基因LbVHA-C1的表達量與LbSOS1表達量的變化趨勢一致,均隨著NaCl處理濃度的增加而升高。相關性分析顯示,短期(24 h、7 d)脅迫內(nèi),枸杞根中Na+含量與LbNHX1、LbVHAC1、LbSOS1、LbHA1表達量均存在一定的相關性,說明液泡膜的NHX 在依賴于液泡膜H+-ATPase 水解細胞質(zhì)中的焦磷酸(pyrophosphoric acid,PPi)和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosire triphosphate,ATP)的同時,將H+泵入液泡,建立了跨膜的質(zhì)子梯度,為NHX 轉(zhuǎn)運Na+提供了動力,可將細胞質(zhì)中過多的Na+區(qū)隔到液泡中[29-30]。本研究中,隨著脅迫時間的延長和NaCl處理濃度的增加,枸杞根中基因LbNHX1、LbVHA-C1、LbSOS1、LbHA1 相對表達量降低,而根系積累了大量的Na+,導致寧夏枸杞的對鹽的耐受性降低。

4 結(jié)論

寧夏枸杞低濃度鹽脅迫環(huán)境下通過吸收更多的K+,維持細胞內(nèi)較低的Na+/K+比值,提高對Na+脅迫的耐受性。在短期脅迫內(nèi),適宜的鹽濃度(100 mmol·L-1NaCl)下,枸杞細胞質(zhì)膜和液泡膜上的Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白依賴H+-ATPase 提供的驅(qū)動力,將Na+運出細胞或區(qū)隔化液泡,從而維持細胞質(zhì)中Na+的穩(wěn)態(tài),這也是寧夏枸杞耐鹽的主要原因之一。本研究結(jié)果為寧夏枸杞耐鹽機理的揭示和利用提供了一定的理論參考。