鄔豐任,劉永佳,陸學民,朱邦尚

(1. 上海交通大學分析測試中心,2. 化學化工學院,上海 200240)

金納米花(AuNFs)是一類具有類似花狀分支結構的金納米顆粒,與金納米球和金納米棒相比,金納米花具有更大的比表面積及更高的反應活性[1～4],可作為基底放大拉曼散射信號(SERS)或者用于催化某些反應[5～7]. 此外,金納米花具有穩(wěn)定性高、生物相容性好且在近紅外區(qū)有良好吸收的特點[8],因此,可作為納米生物材料應用于載藥、成像及光熱治療等生物醫(yī)學領域.

目前,關于金納米花的合成方法以模板法為主,通過在合成過程中加入表面活性劑實現(xiàn)對顆粒形態(tài)的調控. 如Barbosa等[9]將聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為保護性聚合物模板制備了分支結構豐富的金納米花; Han等[10]以多氨基表面活性劑(C18N3)制得的囊泡為模板,合成了一種大顆粒的空心金納米花,其在可見光下表現(xiàn)出較好的生物安全性并在近紅外光的輻射下對HeLa細胞具有強大的光熱治療能力. 而無模板法制備金納米花則是直接對氯金酸進行還原. Kumari等[11]使用硼氫化鈉對氯金酸直接還原制得金納米花,經進一步修飾得到了可用于藥物輸送的金納米花支架; Zhao等[12]先用檸檬酸鈉還原氯金酸得到金種子,進一步生長得到分支長度可控的金納米花; Mao等[13]使用鹽酸羥胺對氯金酸進行還原,得到的金納米花能有效催化降解除草劑二甲戊樂靈. 與模板法相比,無模板法制備金納米花更加便捷,且不使用表面活性劑,得到的金納米花無需后處理即具有較低的體外細胞毒性和較好的生物相容性.

在堿性條件下,多巴胺可在各種材料表面迅速聚合形成聚多巴胺(PDA)膜,其中包含大量親水的羥基和氨基官能團,可以提高材料表面的親水性并促進細胞的黏附,具有良好的生物相容性,被廣泛應用于生物材料的表面改性; 同時,聚多巴胺的最大吸收波長可延伸至近紅外區(qū),可作為光熱試劑[14～17]. 利用聚多巴胺修飾金納米花不僅可以降低金納米花本身的細胞毒性,還能提高整個納米粒子的光熱效應.

本文通過改變無模板法合成金納米花過程中的反應溫度及還原劑用量,實現(xiàn)了對金納米花表面分支結構以及金納米花大小的調控; 進而通過對金納米花進行聚多巴胺修飾,利用聚多巴胺包裹層低毒、穩(wěn)定、生物相容性好,且對金納米粒子進行包裹后最大吸收波長紅移的特點,制備了聚多巴胺修飾金納米花(PDA-AuNFs),并通過調節(jié)多巴胺濃度控制聚多巴胺層厚度,實現(xiàn)了金納米花最大吸收波長的大幅度紅移,提高了其在近紅外區(qū)域的吸收范圍. 通過光熱實驗進一步證明聚多巴胺修飾的金納米花有較強的光熱效應; 通過細胞實驗進一步證明該納米材料的低毒性及對腫瘤細胞的光熱治療能力,展現(xiàn)了其作為光熱試劑在生物醫(yī)學領域的應用前景.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4·4H2O)、抗壞血酸(AA)、鹽酸羥胺(NH2OH·HCl)、碳酸鉀(K2CO3)、鹽酸多巴胺(DA·HCl)、濃鹽酸(HCl,質量分數(shù)為37%)、濃硝酸(HNO3,質量分數(shù)為65%～68%)、二甲基亞砜(DMSO)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)均購于國藥集團化學試劑公司; 噻唑藍(MTT)購于Sigma-Aldrich公司; 細胞培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和磷酸鹽緩沖液(PBS,6.7 mmol/L,pH=7.2～7.4)購于Life Technologies公司; HeLa細胞購于中國科學院上海細胞研究所; 實驗用水為超純水(電阻率>18 MΩ).

Evolution 300型紫外-可見分光光度計(UV-Vis),美國Thermo Scientific公司; Omni型納米粒度/Zeta電位儀,美國Brookhaven公司; Tecnai G2 spirit Biotwin型生物型透射電子顯微鏡(TEM),美國FEI公司; Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR),KBr壓片,掃描范圍4000～400 cm-1,美國Thermo Fisher公司; 3kW/*D8 ADVANCE Da Vinci型多功能X射線衍射儀,CuKα輻射源,λ=0.1541 nm,掃描速率0.02°/s,掃描范圍2θ=10°～90°,德國Bruker公司; Elx800型酶標儀,美國Bio Tek公司; Ti125型紅外熱像儀,美國Fluke公司; FC-808-5000-MM型808 nm激光器,上海濱崎科技有限公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 金納米花的制備 將實驗用燒瓶及磁子用王水(濃鹽酸/濃硝酸體積比3∶1)浸泡后,用超純水沖洗干凈并烘干. 在0 ℃下將1 mL 1%氯金酸加入100 mL超純水中,攪拌下加入4 mL 200 mmol/L K2CO3與40 μL 5 mmol/L AA溶液,5 min后快速加入4 mL 10 mmol/L NH2OH·HCl,攪拌10 min后反應結束. 在6000 r/min轉速下離心6 min,除去上層清液,沉淀用超純水重復離心洗滌3次后得到金納米花,將其均勻分散在超純水中,置于4 ℃冰箱中備用.

將反應溫度分別調整為10,20,30或40 ℃,反應試劑用量及過程不變,考察溫度對所合成樣品的影響.

在0 ℃條件下,將還原劑AA的用量分別調整為20,60和80 μL,其余試劑用量及后處理條件不變,考察還原劑AA用量對所合成樣品的影響.

1.2.2 聚多巴胺修飾金納米花的制備 將20 μL AA制得的金納米花分散于10 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH=8.5)中,加入1 mL多巴胺水溶液(1 mg/mL),反應3 h后,在6000 r/min轉速下離心6 min,除去上層清液,沉淀用超純水重復洗滌、離心3次后,將獲得的產物分散在超純水中進行后續(xù)表征.

將多巴胺溶液濃度調整為2及5 mg/mL,其余試劑用量及反應過程不變,考察多巴胺用量對所合成樣品的影響.

1.2.3 聚多巴胺修飾金納米花的光熱性能實驗 配制濃度為200 μg/mL由20 μL AA制得的金納米花與5 mg/mL多巴胺溶液反應制得的聚多巴胺修飾的金納米花水溶液,取2 mL該溶液和2 mL超純水作為參照,分別置于1 cm石英比色皿中,使用808 nm激光器(1 W/cm2)分別照射10 min,通過紅外熱像儀每1 min記錄1次溶液溫度,重復實驗3次.

1.2.4 體外細胞毒性評價 將HeLa細胞以每孔1.0×104個細胞+200 μL DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)接種于96孔板中,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細胞完全貼壁后吸出培養(yǎng)基,新加入200 μL DMEM培養(yǎng)液. 將由20 μL AA制備的金納米花或由5 mg/mL多巴胺溶液制得的聚多巴胺修飾金納米花分別配制成10,50,100,250,500和1000 μg/mL(金納米花濃度)溶液,再以每個樣品每個濃度設置6個孔,每孔50 μL的量加入孔板中,使樣品的最終濃度分別為2,10,20,50,100和200 μg/mL. 在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,吸出每個孔板中的培養(yǎng)液,用PBS緩沖液清洗2次,在每個孔中分別加入200 μL培養(yǎng)液與20 μL 5 mg/mL MTT后繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h; 然后,吸出培養(yǎng)液及MTT溶液,每孔加入200 μL DMSO,振蕩10 min后使用酶標儀在490 nm波長下檢測光密度(OD)值.

光熱實驗組體外毒性評價實驗與上述過程基本一致,但在加入含金納米花或聚多巴胺修飾金納米花溶液培養(yǎng)12 h后,用808 nm激光器(1 W/cm2)對每個孔持續(xù)照射10 min,然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h; 同樣使用MTT法測定細胞光密度(OD)值.

2 結果與討論

2.1 溫度對金納米花形貌的影響

Fig.1 TEM images(A)—(E) and UV-Vis spectra(F) of AuNFs synthesized at different temperatures Temperature/℃: (A) 0; (B) 10; (C) 20; (D) 30; (E) 40.

反應溫度是影響金納米花形貌和粒徑大小的重要因素之一. 在圖1(A)～(E)所示TEM照片中,反應溫度由0 ℃逐漸上升至40 ℃,金納米花的形貌從表面粗糙、分支結構豐富逐漸轉變?yōu)楸砻婀饣?、分支短小甚至消?當反應溫度為30和40 ℃時,金納米花表面的分支結構基本消失,粒徑卻顯著增大. 這可能是由于溫度不同導致Au3+和還原劑的擴散速度存在差異,使得Au0在金種子表面生長速度不同所致[18]. 金納米花的合成通過2步反應實現(xiàn): 第一步是金種子形成,由AA對Au3+還原制備金種子; 第二步則是金納米花顆粒形成,由NH2OH·HCl還原Au3+成金原子在金種子上進一步生長形成特定形貌納米顆粒. 溫度較低時,Au3+還原生成的金原子活性種在溶液中的擴散速度較慢,易形成具有豐富分支結構的金納米花; 而當溫度升高時,金離子在溶液中的擴散速度加快,與還原劑反應機率增加,從而加速了金種子表面金的還原生長,形成粒徑較大、表面更加光滑的金納米顆粒. 通過比較反應溫度可知,低溫即在0 ℃條件下,金納米花的分支結構最豐富,其對應的納米金花粒徑約為80 nm,對應的最大可見吸收波長為616 nm[圖1(F)]. 進一步比較圖1(A)～(C)發(fā)現(xiàn),0,10和20 ℃時合成的金納米花雖然粒徑基本相同,但是由于形態(tài)變化較大,最大吸收波長也存在差異,其中0 ℃合成的金納米花表面分支最多. 分支結構的生長導致其最大吸收波長向近紅外區(qū)紅移[19],從而導致相應的最大吸收波長最大.

另外,溫度也會影響金納米顆粒的大小和對應的最大吸收波長. 對于30和40 ℃下合成的金納米粒子[圖1(D)和(E)],除了隨著溫度升高表面分支結構消失外,粒徑也顯著增大,最大吸收波長與0 ℃下合成的金納米花相比發(fā)生了紅移,這是因為較高溫度下生成了粒徑更大的金納米粒子,對應的最大吸收波長也更大[20].

2.2 還原劑AA用量對金納米花粒徑的影響

基于0 ℃制備金納米花具有最豐富的分支結構這一特點,進一步地考察了AA用量對金納米花粒徑的影響. 在金納米花的合成過程中,AA濃度影響金種子生成的單位濃度,最終影響合成的金納米花的粒徑大小. 4種AA濃度條件下制備的金納米花粒徑在60～100 nm范圍內,其形態(tài)及分散在溶液中用動態(tài)光散射儀測得的水合粒徑大小如圖2及圖3(A)所示. 通過比較發(fā)現(xiàn)， AA的濃度越大,金納米花的粒徑越小. 這是由于在反應過程中AA的濃度越高,生成的金種子越多,在氯金酸用量即反應濃度不變的條件下,參與金種子生長反應的氯金酸量越小,得到的金納米花粒徑也越小. 由圖3(B)可知,4種金納米花表面的zeta電位在(-23.94±1.69)～(-25.01±2.11) mV范圍內. 反應過程中,金納米花表面吸附了NH2OH·HCl中的Cl-從而帶負電[21]. 另外,圖3(C)是4種金納米花的紫外-可見吸收光譜,以 40 μL AA 制得金納米花為參比,當反應體系中AA用量高于40 μL時,金納米花的最大吸收波長小于616 nm,發(fā)生藍移; 反之,AA用量低于40 μL時,最大吸收波長大于616 nm,發(fā)生紅移.

Fig.2 TEM images of AuNFs synthesized with different amounts of AAV(AA)/μL: (A) 20; (B) 40; (C) 60; (D) 80.

Fig.3 Hydrodynamic diameter(A),zeta potential(B) and UV-Vis spectra(C) of AuNFs synthesized with 20,40,60 and 80 μL AA

2.3 聚多巴胺修飾金納米花的表征

多巴胺能在堿性溶液中發(fā)生聚合反應形成聚多巴胺,且易吸附修飾在金納米花表面. 為進一步探究聚多巴胺修飾層厚度對金納米花性能的影響,根據(jù)最大吸收波長和分支結構的豐富程度,選定0 ℃下用20 μL AA制得的金納米花為代表,以不同濃度多巴胺進行聚多巴胺修飾. 將20 μL AA制得的金納米花以AuNFs20表示,與1,2和5 mg/mL多巴胺溶液反應制得的聚多巴胺修飾金納米花分別以PDA-Au1,PDA-Au2及PDA-Au5表示.

在對金納米花進行聚多巴胺修飾后,采用紅外光譜進行了表征. 圖4(A)為AuNFs20,PDA-Au5及多巴胺的紅外光譜圖. 通過比較發(fā)現(xiàn),聚多巴胺修飾的金納米花的紅外譜線上1285與1500 cm-1處出現(xiàn)了吸收峰,前者可歸屬為聚多巴胺上芳環(huán)的吸收,后者可歸屬為聚多巴胺上N—H鍵的彎曲振動[22]. 由XRD譜圖[圖4(B)]可看出聚多巴胺修飾前后對金納米花結構的影響: AuNFs20和PDA-Au5均有5個衍射峰,分別位于38.28°,44.56°,64.77°,77.84°和81.93°處,可歸屬于金的(111),(200),(220),(311)和(222)晶面,表明其為面心立方晶體結構[19],顯示經聚多巴胺修飾后該晶體結構未發(fā)生顯著變化. AuNFs20的粒徑可根據(jù)Scherrer公式:D=Kλ/βcosθ計算[式中,D(nm)為樣品粒徑;K為Scherrer常數(shù),取0.89;λ為X射線波長,取0.1541 nm;β為樣品XRD譜圖衍射峰的半峰寬(弧度);θ為布拉格衍射角(角度)]. 經Scherrer公式計算得出AuNFs20的粒徑為78.76 nm,這與圖5(A)所示TEM照片中AuNFs20約100 nm的粒徑尺寸相比存在一定誤差,這主要是由于金納米花并不是均勻的球形所致.

Fig.4 FTIR spectra of AuNFs prepared with 20 μL AA(AuNFs20),AuNFs modified with 5 mg/mL DA·HCl(PDA-Au5) and DA·HCl(A) and XRD patterns of standard Au(JCPDS No. 89-3697),AuNFs20 and PDA-Au5(B)

進一步利用TEM表征了金納米花表面修飾聚多巴胺層的厚度. 圖5(A)～(D)分別為AuNFs20,PDA-Au1,PDA-Au2與PDA-Au5的TEM照片,可見,聚多巴胺修飾后,金納米花本身的形貌基本無變化,制備PDA-Au1,PDA-Au2和PDA-Au5時聚多巴胺溶液的濃度比為1∶2∶5,對應的聚多巴胺層厚度依次為8.7,9.3及14.2 nm. 可見,隨著多巴胺溶液濃度的增大,形成的聚多巴胺層厚度也逐漸增大,結合圖6(A)結果可知,AuNFs20被聚多巴胺修飾后,聚多巴胺層的存在使整個材料的親水性增強,可在水溶液中形成水合層,水合粒徑也相應增大[23]. 聚多巴胺層的存在導致制得的納米粒子粒徑變大. 由圖6(B)可見,PDA-Au1,PDA-Au2與PDA-Au5的zeta電位依然是負值,這是由于聚多巴胺包裹層上的酚羥基發(fā)生去質子化所致[24].

Fig.5 TEM images of AuNFs20(A),PDA-Au1(B),PDA-Au2(C) and PDA-Au5(D)

經聚多巴胺修飾后金納米花的一個最顯著特征是其最大吸收波長發(fā)生了顯著紅移,且聚多巴胺層越厚,紅移程度越大. 圖6(C)為AuNFs20,PDA-Au1,PDA-Au2及PDA-Au5的紫外-可見光譜圖,對應的最大吸收波長分別為652,692,704和737 nm. 顯然,聚多巴胺層越厚,最大吸收波長的紅移程度越明顯,以AuNFs20 作為基準,PDA-Au1,PDA-Au2和PDA-Au5的最大吸收波長分別紅移了約40,50及80 nm. 這種紅移現(xiàn)象是由于聚多巴胺層的存在增大了金納米花的消光與散射截面,進一步提高了折光率,從而使金納米花的最大吸收波長發(fā)生紅移[17]. 因此,聚多巴胺的修飾能促進金納米花的吸收波長從可見吸收區(qū)向近紅外區(qū)移動,在一定程度上提高了其光熱效應[23].

Fig.6 Hydrodynamic diameters(A),zeta potentials(B) and UV-Vis spectra(C) of AuNFs 20(a),PDA-Au1(b),PDA-Au2(c) and PDA-Au5(d)

2.4 修飾前后的光熱性能變化

金納米花經聚多巴胺修飾后其光熱性能顯著增強. 圖7(A)示出了使用808 nm激光器在1 W/cm2條件下照射10 min后3個樣品的升溫變化. 由圖7(B)所示溫度-時間曲線發(fā)現(xiàn),對照組超純水的溫度幾乎無變化,而AuNFs組的溫度則上升了13.3 ℃,PDA-Au5組溫度上升了29.4 ℃,達到近57 ℃,該結果表明,聚多巴胺層的修飾能有效增強金納米花的光熱轉換效應.

Fig.7 Thermal images(A) and temperature-time profiles(B) of H2O(a),AuNFs20(b) and PDA-Au5(c) under irradiation of 808 nm laser(1 W/cm2) for 10 min

2.5 修飾前后的體外細胞毒性評價

為進一步考察金納米花經聚多巴胺修飾前后的生物相容性,采用MTT法評價了用AuNFs20及PDA-Au5 體系體外培養(yǎng)48 h后的細胞毒性. 結果如圖8(A)所示,對于AuNFs20組,隨著其濃度由5 μg/mL逐漸上升至200 μg/mL,細胞存活率逐漸下降,當濃度達到200 μg/mL時細胞存活率約為75%. 而對于PDA-Au5組,其濃度升高至200 μg/mL時細胞存活率卻達到近90%. 顯然,聚多巴胺的修飾顯著降低了金納米花的細胞毒性,提高了其生物相容性. 在圖8(B)所示光熱治療組中,二者的細胞毒性顯著提高,當AuNFs20濃度為200 μg/mL時,細胞存活率下降至約30%,相比之下,同樣濃度的PDA-Au5組的細胞存活率稍高于10%,此結果表明聚多巴胺修飾的金納米花光熱轉換效應得到提高,增強了對腫瘤細胞的殺傷能力. 因此,聚多巴胺修飾的金納米花是一種可用于腫瘤光熱治療的潛在光熱轉換劑.

Fig.8 Cytotoxicity of HeLa cells cultivated with AuNFs and PDA-Au5 without(A) or with(B) a 10 min laser(1 W/cm2)

3 結 論

采用無模板法制備了具有豐富分支結構的金納米花. 通過改變反應溫度與還原劑AA(抗壞血酸)用量可有效調控金納米花的形貌與粒徑: 反應溫度越低,金納米花分支結構越豐富,其中0 ℃為最佳反應溫度; AA用量越高,金納米花粒徑越小,金納米花粒徑可控制在60～100 nm; 相應地,最大吸收波長在575～650 nm范圍內. 聚多巴胺層對金納米花的修飾提高了金納米花的最大吸收波長,使其位于近紅外區(qū)的吸收范圍(650～740 nm); 同時,聚多巴胺層的厚度隨溶液中多巴胺濃度的增加而增大,最大厚度可達約14 nm,對應的最大吸收波長則紅移約80 nm; 經激光器照射后,聚多巴胺修飾的金納米花溶液在10 min內溫度即可升高至57 ℃. 體外細胞毒性實驗證明,金納米花經修飾后細胞毒性較低,生物相容性良好,且在激光器照射下對腫瘤細胞有較強殺傷能力,這表明經聚多巴胺修飾的金納米花在光熱治療生物醫(yī)學領域具有潛在的應用前景.