羅若詩，楊錫智，程 杰，徐彥芹，周 楨，王 丹，王欽宏

(1.重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化工過程強(qiáng)化與反應(yīng)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，重慶400044；2.重慶大學(xué)藥學(xué)院，重慶400044；3.中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所國家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心，天津300308)

尼龍5和尼龍5,6是重要的工程塑料，可應(yīng)用于機(jī)械、化工、儀表、汽車等工業(yè)。5-氨基戊酸(5AVA)是生產(chǎn)尼龍 5[1]和尼龍5,6[2]的潛在原料，也能用于戊二酸[1,3]、δ-戊內(nèi)酰胺[2,4]、1,5-戊二醇[5]和 5-羥基戊酸[5]等C5平臺(tái)化學(xué)品的生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成5AVA過程復(fù)雜，反應(yīng)過程需多步完成，增加了轉(zhuǎn)換過程成本，產(chǎn)率較低。同時(shí)，在反應(yīng)過程中會(huì)產(chǎn)生大量廢液，造成環(huán)境污染。生物法合成5AVA綠色環(huán)保,引起了廣大研究者的廣泛關(guān)注。

目前主要有3種5AVA 生物合成途徑。5AVA 的天然合成途徑是在惡臭假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的[6-9]。第一步，L-賴氨酸 2-單加氧酶(DavB)將 L-賴氨酸轉(zhuǎn)化為5-氨基戊酰胺。第二步，δ-氨基戊酰胺酶(DavA)將 5-氨基戊酰胺水解為5AVA。Park 等[3]發(fā)現(xiàn)當(dāng)DavB和DavA 過表達(dá)時(shí)，設(shè)計(jì)的重組大腸桿菌WL3110以 L-賴氨酸為底物可生產(chǎn)3.6 g/L 5AVA。Liu 等[5]將DavB和DavA 進(jìn)行過表達(dá)及純化，利用酶催化的方法耦聯(lián)生產(chǎn)20.8 g/L 5AVA，得率為 0.69 g/g L-賴氨酸。Park 等[2]、Wang等[10]構(gòu)建了重組大腸桿菌 W3110/DAVAB，以120 g/L L-賴氨酸為底物進(jìn)行高密度發(fā)酵和全細(xì)胞催化技術(shù)可生產(chǎn) 90.59 g/L 5AVA。Shin 等[11]設(shè)計(jì)了不同復(fù)制子和啟動(dòng)子的谷氨酸棒狀桿菌菌株，最終能以 250 g/L 葡萄糖為底物，生產(chǎn)了 33.1 g/L 5AVA。Jorge 等[12]建立了一種以戊二胺為中間體生產(chǎn)5AVA的新途徑，該途徑包括 L-賴氨酸脫羧酶 (LDC)、戊二胺轉(zhuǎn)氨酶 (PatA) 和γ-氨基丁醛脫氫酶 (PatD)，最終可以生產(chǎn) 5.1 g/L 5AVA，得率為 0.13 g/g。此外，Rohles等[13]還建立了同時(shí)生產(chǎn)C5平臺(tái)化學(xué)品5AVA與DAP(戊二胺)的耦合生產(chǎn)工藝，最優(yōu)菌株能生產(chǎn)28 g/L 5AVA，最大生產(chǎn)率為0.9 g/(L·h)。Kusakabe 等[14]首先提出了另一種 5AVA合成途徑，利用來源于綠色木霉的L-賴氨酸α-氧化酶(LysOx)將 L-賴氨酸的α-氨基氧化成羰基，同時(shí)生產(chǎn)NH3和H2O2，生成的中間體2-酮基-6氨基己酸在不添加過氧化氫酶的情況下自動(dòng)氧化脫羧形成5AVA[15]。Pukin 等[16]利用固定化酶LysOx和37 ℃條件下反應(yīng)5 d后成功制備了13.4 g/L 5AVA。

本研究中，筆者將來自日本鯖的 L-賴氨酸α-氧化酶(RaiP)在大腸桿菌BL21(DE3)中過表達(dá)，敲除賴氨酸降解基因cadA以加強(qiáng)微生物中的這一轉(zhuǎn)化過程，建L-賴氨酸α-氧化酶單表達(dá)的代謝工程菌株。同時(shí)考察乙醇和H2O2的加入對提高5-氨基戊酸生產(chǎn)的作用，實(shí)驗(yàn)室搖瓶小試結(jié)果在5-L發(fā)酵罐中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，以期為規(guī)模生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所用菌株或質(zhì)粒見表1，所用引物見表2。質(zhì)粒pCJ01為攜帶有賴氨酸氧化酶raiP基因的pET21a質(zhì)粒。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得T7啟動(dòng)子下RaiP過表達(dá)的工程菌株CJ01。將大腸桿菌BL21(DE3)的賴氨酸脫羧酶CadA敲除，得到工程菌株ML03，以減少底物賴氨酸的降解。將質(zhì)粒pCJ01轉(zhuǎn)入大腸桿菌ML03，得到工程菌株CJ02。將空質(zhì)粒pET21a轉(zhuǎn)入ML03，得到對照菌株CJ00。

表1 所用菌株和質(zhì)粒

表2 所用引物

1.2 培養(yǎng)條件

將甘油管中的細(xì)胞在100 mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)，并在37 ℃下生長12 h。單個(gè)菌落接種到補(bǔ)充有100 mg/L氨芐青霉素的2 mL LB肉湯中，在37 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)12 h。以該培養(yǎng)物為種子發(fā)酵[16]。

培養(yǎng)基為M9基本培養(yǎng)基:5 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖和100 mg/L氨芐青霉素。所有培養(yǎng)基均在115 ℃下滅菌20 min。

將300 μL的種子接種到含有30 mL相應(yīng)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)， OD600達(dá)到0.6后，加入IPTG(0.5 mmol/L)，30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)，并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 重組RaiP蛋白表達(dá)的優(yōu)化

在氨芐青霉素抗性LB瓊脂平板上篩選陽性克隆BL21(DE3)/pCJ01，在2 mL含100 mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)12 h。以2%(體積分?jǐn)?shù))接種量加入氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)基，IPTG濃度為0.5 mmol/L，20 ℃培養(yǎng)16 h。通過SDS-PAGE分析添加不同體積分?jǐn)?shù)(1%、2%、3%、4%、5%和6%)的乙醇對RaiP蛋白過表達(dá)的影響。培養(yǎng)結(jié)束后10 000 r/min離心5 min，從每個(gè)培養(yǎng)瓶中收獲細(xì)胞，棄去上清液。將細(xì)胞懸浮于1 mL磷酸鉀緩沖液(PKB，50 mmol/L，pH 8.0)中，10 000 r/min離心5 min后棄去上清液。將細(xì)胞懸浮在20 μL PKB(pH 8.0)和5 μL 5倍體積的十二烷基磺酸(SDS)加載染料中，混合裂解。最后，將樣品在100 ℃下煮沸5 min，取10 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.4 重組RaiP的純化

將細(xì)胞懸浮在50 mmol/L PKB(pH 8.0)和2 mmol/L三(2-羧乙基)膦(TCEP)中超聲裂解。含有重組蛋白的上清液10 000 r/min離心20 min，0.22 μm膜過濾，然后通過Ni-NTA色譜柱 (GE Healthcare Life) 純化。通過超濾除去純化蛋白中的咪唑。通過使用SpectraMax M2e(Molecular Devices公司)在280 nm處測量A280來確定蛋白質(zhì)濃度，測定酶活性。

1.5 酶活測定

RaiP活性是通過測量H2O2的生成速率來確定的。反應(yīng)緩沖液(2 mL)包含50 mmol/L KPB(pH 8.0)、30 mmol/L L-賴氨酸、26.5 mmol/L苯酚、0.5 mmol/L 4-氨基安替比林(4AAP)和10 U/mL過氧化氫酶。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物(205 μL)包含180 μL反應(yīng)緩沖液和25 μL酶。該反應(yīng)在30 ℃下進(jìn)行10 min，并通過添加10 μL 10 mmol/L HCl終止反應(yīng)。 用10 μL的10 mmol/L NaOH中和后，使用SpectraMax M2e在505 nm下測量形成的醌亞胺染料。 酶活單位定義為每分鐘可催化形成1 μmol/L H2O2的酶量。

1.6 5AVA的發(fā)酵

所有小規(guī)模發(fā)酵均在裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形燒瓶中進(jìn)行。發(fā)酵培養(yǎng)基為M9基本培養(yǎng)基。首先將在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的300 μL過夜培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)基中，加入0.5 mmol/L IPTG、5 g/L L-賴氨酸、各種濃度的乙醇和H2O2后，將三角瓶置于250 r/min、30 ℃的振蕩器中，發(fā)酵48 h。每隔12小時(shí)測量pH，并通過添加2 mmol/L過濾后的NaOH溶液將其pH保持在6.0～7.5。發(fā)酵過程中的pH設(shè)置為6.8，并通過自動(dòng)添加氨水保持pH在6.7～6.9，其中L-賴氨酸氧化酶可得到94%的最大活性。高效液相色譜(HPLC)分析發(fā)酵產(chǎn)物。

1.7 分析方法

使用Ultrospec TM 2100 pro型紫外/可見分光光度計(jì)測量600 nm處的光密度(OD600)以確定細(xì)胞濃度。HPLC系統(tǒng)用于分析L-賴氨酸和5AVA。取1 mL培養(yǎng)樣品，以10 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞，進(jìn)一步進(jìn)行代謝物分析。為了檢測L-賴氨酸和5AVA，按所述方法用異硫氰酸苯酯(PITC)提取樣品。

氨基酸衍生物的色譜分析在40 ℃的Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)進(jìn)行。流速保持在1 mL/min，波長為254 nm，分析時(shí)間55 min。

PITC衍生物的HPLC條件如下：流動(dòng)相A，體積比為80∶ 20的乙腈-水溶液；流動(dòng)相B，100 mmol/L乙酸銨的水溶液(pH 6.5)和乙腈(兩者體積比為93∶ 7)。使用前，將流動(dòng)相通過0.22 μm的尼龍66膜過濾器過濾，進(jìn)樣10 μL。

線性梯度洗脫譜為0 min時(shí)3%A，20 min時(shí)30%A，30 min時(shí)35%A，40 min時(shí)90%A，41 min時(shí)100%A，45 min時(shí)100%A， 46 min時(shí)為3%A，55 min時(shí)為3%A。使用Aminex HPX-87H離子交換柱(Bio-Rad公司)分析葡萄糖和其他代謝物。將樣品以10 000 r/min離心10 min。將每種上清液用10倍體積的5 mmol/L H2SO4稀釋，并注入10 μL稀釋的樣品。用5 mmol/L H2SO4以0.6 mL/min的流速等度洗脫色譜柱。 RID檢測器溫度和色譜柱溫度分別為55和35 ℃。SDS-PAGE用12%丙烯酰胺凝膠。蛋白用考馬斯亮藍(lán)(CBB)R-250染色。 SDS-PAGE分析以Nacalai Tesque公司的標(biāo)準(zhǔn)蛋白用作標(biāo)準(zhǔn)分子量對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物賴氨酸鹽酸鹽對生產(chǎn)5-氨基戊酸的影響

首先研究工程菌株發(fā)酵不同底物生產(chǎn)5-氨基戊酸的情況，結(jié)果見表3。由表3可知：cadA的敲除，使得工程菌株CJ02搖瓶生產(chǎn)中 5-氨基戊酸的質(zhì)量濃度從菌株CJ01 中的 0.19 g/L至0.25 g/L，約增加了 0.32倍，5-氨基戊酸的得率也從0.038 g/g 增加到了0.050 g/g。此外，野生型菌株不能檢測到內(nèi)源性的 L-賴氨酸的產(chǎn)生[16]。敲除了cadA的工程大腸桿菌可以產(chǎn)0.32 g/L 的 L-賴氨酸。當(dāng)L-賴氨酸鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為 6.5 g/L (即是 5 g/L L-賴氨酸)，5-氨基戊酸的最終產(chǎn)量為0.23 g/L。5-氨基戊酸的最高產(chǎn)量0.31 g/L是由菌株CJ02 獲得的，是以L-賴氨酸為底物的0.24倍。

由此可見，cadA的敲除和L-賴氨酸鹽酸鹽對提高賴氨酸利用率都有一定的促進(jìn)作用。這兩種策略均可以提高底物 L-賴氨酸的利用率。第一種策略是，賴氨酸降解途徑中的關(guān)鍵酶賴氨酸脫羧酶(CadA)被敲除，以減少賴氨酸降解，從而進(jìn)一步增加5-氨基戊酸的代謝通量。第二種策略是，選擇賴氨酸鹽酸鹽作為一種比 L-賴氨酸更好的底物[17]。它具有加速 L-賴氨酸從發(fā)酵液轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中的潛力，且能夠消除底物抑制。

表3 基因cadA 敲除和 L-賴氨酸鹽酸鹽對 5-氨基戊酸產(chǎn)量和得率的影響

2.2 乙醇添加對5-氨基戊酸生產(chǎn)的影響

考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對生產(chǎn)5-氨基戊酸的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，重組大腸桿菌CJ02 在發(fā)酵48 h 后生產(chǎn)了0.49 g/L 5-氨基戊酸，5-氨基戊酸的得率為 0.098 g/g，與對照組相比增加了58.06%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，5-氨基戊酸的產(chǎn)量進(jìn)一步增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為 2%、3%和 4% 時(shí),5-氨基戊酸的質(zhì)量濃度分別增加到0.72、1.05和 1.26 g/L，與未添加乙醇的對照組相比，5-氨基戊酸的產(chǎn)量分別增加132.26%、238.71%和 306.45%；繼續(xù)增加乙醇的添加量，但是細(xì)胞的生長受到顯著抑制，導(dǎo)致5-氨基戊酸的產(chǎn)量急劇下降。因此，本研究的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%。

圖1 乙醇添加量對工程大腸桿菌CJ00和CJ02 5- 氨基戊酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of ethanol addition on production of 5AVA in engineered strain CJ00 and CJ02

由此可見，通過添加乙醇提高了5-氨基戊酸的產(chǎn)量，可能原因是提高了大腸桿菌工程菌中外源蛋白的表達(dá)水平[18]。乙醇是大腸桿菌熱休克反應(yīng)的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，對包涵體的形成有復(fù)雜的影響，能夠提高蛋白的可溶性[19-21]。該策略不僅經(jīng)濟(jì)、實(shí)用，易于管理，操作方便，還能夠應(yīng)用在5-氨基戊酸和其他有價(jià)值的化學(xué)品的工業(yè)生產(chǎn)之中。

圖2 酶RaiP蛋白表達(dá)分析Fig.2 Expression analysis of enzyme RaiP by SDS-RAGE analysis

2.3 RaiP酶蛋白表達(dá)分析及可溶性分析

用SDS-PAGE 研究和分析不同體積分?jǐn)?shù)(1%、2%、3%、4%、5%和 6%)的乙醇添加對增強(qiáng)重組大腸桿菌CJ01中RaiP 過表達(dá)和氨基戊酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖2。本研究中IPTG的濃度、表達(dá)時(shí)間和溫度分別為0.5 mmol/L、16 h和20 ℃。由圖2可知，表達(dá)產(chǎn)物的分子量為5.5×104，與RaiP 蛋白預(yù)測的大小相一致。在培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)為4%的乙醇可獲得最高表達(dá)量。

與不添加乙醇的對照組相比，在添加體積分?jǐn)?shù) 4%乙醇的條件下，RaiP(5.5×104)蛋白展示了最高的表達(dá)倍數(shù)(圖2(b))，與細(xì)胞碎片相比，RaiP 蛋白主要存在于可溶部分中。大約90%的RaiP蛋白是可溶性蛋白(圖2(c))，與不添加乙醇相比，可溶性表達(dá)增加了約 40%[22-24]。

在最佳生長條件下，對酶RaiP進(jìn)行了純化。粗提物中酶RaiP的比酶活為5.14 U/mg。純化過程使得酶蛋白純度提高141倍，酶收率達(dá)到58.62%，比酶活為724.88 U/mg。

2.4 H2O2作為氧化劑對5-氨基戊酸生產(chǎn)的影響

考察菌株CJ02在添加體積分?jǐn)?shù)4%的乙醇和不同濃度的H2O2條件下細(xì)胞的生長和氨基戊酸生產(chǎn)情況，結(jié)果見圖3。將攜帶有質(zhì)粒pCJ01的重組大腸桿菌ML03用于5-氨基戊酸的生產(chǎn)，培養(yǎng)基為M9培養(yǎng)基，含有5 g/L L-賴氨酸、20 g/L葡萄糖、5 g/L酵母提取物，4%乙醇和不同濃度的 H2O2。

由圖3可知：當(dāng) H2O2添加量為5 mmol/L 時(shí)，重組大腸桿菌CJ02在48 h后可生產(chǎn)2.03 g/L 5-氨基戊酸，其得率為0.406 g/g，與對照組相比，增加了約61.11%。隨著H2O2濃度的增加，5-氨基戊酸的產(chǎn)量進(jìn)一步增加。在添加10 mmol/L H2O2時(shí)，5-氨基戊酸的質(zhì)量濃度增加到2.45 g/L，與未添加H2O2的對照相比，5-氨基戊酸的產(chǎn)量增加了94.44%。進(jìn)一步增加H2O2的濃度，細(xì)胞生長受到明顯抑制，導(dǎo)致5-氨基戊酸的產(chǎn)量急劇下降。由此可見，H2O2最適宜添加量為10 mmol/L。

圖3 H2O2對工程大腸桿菌 CJ00和CJ02 5- 氨基戊酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of H2O2 addition on production of 5AVA in engineered strain CJ00 and CJ02

同時(shí)，還研究不同H2O2的添加時(shí)間對生產(chǎn)5-氨基戊酸的影響。結(jié)果表明，H2O2添加時(shí)間對5-氨基戊酸產(chǎn)量有明顯影響。在8 h 后添加H2O2，5-氨基戊酸的產(chǎn)量達(dá)到5.61 g/L，此時(shí)底物L(fēng)-賴氨酸初始質(zhì)量濃度為10 g/L。與對照組相比，5-氨基戊酸產(chǎn)量增加了17.36%。因此，在搖瓶生產(chǎn)中添加H2O2的最佳時(shí)間設(shè)定為 8 h。

2.5 反應(yīng)器水平5-氨基戊酸的生產(chǎn)

最后對菌株CJ02進(jìn)行了5 L發(fā)酵罐的分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知：隨著葡萄糖的濃度在逐漸下降，OD600由2.45 增加到31。在加入體積分?jǐn)?shù)4%的乙醇和賴氨酸后，反應(yīng)24～48 h，5-氨基戊酸的積累量達(dá)到了21.38 g/L；之后延長反應(yīng)時(shí)間，生產(chǎn)速率開始下降。當(dāng)反應(yīng)達(dá)到48 h時(shí)，向反應(yīng)液中添加10 mmol/L H2O2，5-氨基戊酸的質(zhì)量濃度達(dá)到了29.12 g/L，此時(shí)的產(chǎn)率為0.44 g/g L-賴氨酸。

圖4 工程大腸桿菌CJ02在5-L發(fā)酵罐中 5-氨基戊酸的生產(chǎn)Fig.4 Production of 5AVA in engineered strain CJ02 in a 5-L bioreactor

當(dāng)前，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)5-氨基戊酸的菌株主要有兩種：谷氨酸棒狀桿菌[11]和大腸桿菌[3]。雖然谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌作為5-氨基戊酸的生產(chǎn)菌株具有各自的優(yōu)勢特性，但是谷氨酸棒狀桿菌及其亞種是L-賴氨酸的主要工業(yè)生產(chǎn)菌株[25-26]。因此谷氨酸棒狀桿菌可能是從頭生產(chǎn)5-氨基戊酸的潛在工業(yè)菌株。本研究策略也可以應(yīng)用于谷氨酸棒狀桿菌工程菌的構(gòu)建，并從頭生物合成 5-氨基戊酸。

3 結(jié)論與展望

利用體積分?jǐn)?shù)4%的乙醇處理的全細(xì)胞生物催化劑CJ02，催化L-賴氨酸鹽酸鹽反應(yīng)12 h后，5-氨基戊酸的產(chǎn)量達(dá)到了1.26 g/L，對照組相比，5-氨基戊酸產(chǎn)量提高了189.29%。在全細(xì)胞反應(yīng)液中加入10 mmol/L的H2O2，反應(yīng)12 h后，5-氨基戊酸的產(chǎn)量達(dá)到了1.52 g/L，與對照組相比，產(chǎn)率提高了87.65%。將體積分?jǐn)?shù)4%的乙醇和10 mmol/L的H2O2加入到全細(xì)胞催化體系之中，經(jīng)過48 h反應(yīng)后，5-氨基戊酸產(chǎn)量達(dá)到了29.12 g/L。此策略以大宗化學(xué)品賴氨酸為底物，采用經(jīng)乙醇預(yù)處理的全細(xì)胞催化體系，具有工藝簡單、綠色無污染的優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)楣I(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)5-氨基戊酸提供綠色、經(jīng)濟(jì)、可持續(xù)的發(fā)展道路。更重要的是，這種添加乙醇增加蛋白表達(dá)水平的策略不僅可用于5-氨基戊酸的有效生產(chǎn)，而且還能用于其他高附加值化學(xué)品的生產(chǎn)。