陳海欣，張賽男，趙力民，陳 瑤,4

(1.廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東廣州510000；2.廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510000；3.南開(kāi)大學(xué)藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071；4.南開(kāi)大學(xué)藥學(xué)院，天津300071)

酶作為一種生物催化劑，與化學(xué)催化劑相比具有高效、專(zhuān)一、催化條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，在食品、化工、醫(yī)療、能源和環(huán)境等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。然而，在實(shí)際操作環(huán)境或極端條件(如高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿或有機(jī)溶劑等)下，酶分子容易失活，且不易回收和重復(fù)利用，使得酶的工業(yè)化應(yīng)用受到了很大限制[1-2]。為了解決酶的工業(yè)化應(yīng)用問(wèn)題，固定化酶技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。酶的固定化是指利用固體載體將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，仍能保持酶特有的催化活性，并使其可回收及重復(fù)使用的一類(lèi)技術(shù)[3]。固定化酶具有以下優(yōu)點(diǎn)：①提高酶的穩(wěn)定性。通過(guò)載體的保護(hù)作用，使其在較寬泛的pH、高溫或有機(jī)溶劑中仍保持活性。②提高酶的分離、回收效率和再利用性?？衫眠^(guò)濾等方法，簡(jiǎn)單地將酶與產(chǎn)物分離，并回收利用。③提高酶的催化活性。通過(guò)載體固有的親疏水性等性質(zhì)，調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境及其與底物的反應(yīng)環(huán)境，從而促進(jìn)酶催化反應(yīng)。④提高酶的選擇性。通過(guò)載體的空間位阻或孔道大小所提供的尺寸篩分等效應(yīng)，可以選擇一定尺寸的底物進(jìn)行催化[4]。

固定化酶技術(shù)早在1916年首次被發(fā)現(xiàn)[5]，自20世紀(jì)60年代以來(lái)得到迅猛發(fā)展。隨著固定化材料和酶工程領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展，固定化酶的研究日益得到科研工作者的廣泛關(guān)注。由于固定化酶的化學(xué)和物理性質(zhì)很大程度上受到固定載體和固定方法的影響，開(kāi)發(fā)對(duì)酶活影響最小(甚至增強(qiáng)酶活)且不容易發(fā)生泄漏的載體材料和固定技術(shù)一直是固定化酶的研究目標(biāo)。

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)、化學(xué)合成以及材料科學(xué)的學(xué)科交叉和發(fā)展，固定化酶在載體的開(kāi)發(fā)和固定化技術(shù)的提高方面取得長(zhǎng)足的進(jìn)展。其中，新型多孔框架材料，如金屬-有機(jī)框架材料(MOFs)[6]和共價(jià)有機(jī)框架材料(COFs)[7]，作為酶的新型固相載體的研究逐步展開(kāi)。此外，可實(shí)現(xiàn)大尺寸生物分子固定化的新方法，如原位包覆策略也逐漸成熟，使得越來(lái)越多種類(lèi)的生物大分子實(shí)現(xiàn)高效固定化[8-11]。

本文中，筆者主要總結(jié)了以酶為代表的生物大分子的固定化方法、固定載體材料的種類(lèi)及其選擇方法，并總結(jié)了近年來(lái)固定化酶在生物催化、生物傳感以及生物分離這三大主要應(yīng)用領(lǐng)域的研究進(jìn)展，重點(diǎn)介紹了金屬-有機(jī)框架材料(MOFs)和共價(jià)有機(jī)框架材料(COFs)作為新型結(jié)晶性多孔載體材料在酶的固定化方面的最新進(jìn)展。

1 固定化酶的方法

固定化酶是通過(guò)物理或化學(xué)方法將游離酶與特定的載體材料結(jié)合。按照酶與載體的結(jié)合方式，主要分為吸附法[5]、共價(jià)結(jié)合法[12]、包埋法[13]、交聯(lián)法[14]以及近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的原位合成覆法[8]五大類(lèi)(圖1)。

圖1 酶固定化方法示意Fig.1 Schematic diagram of enzyme immobilization strategies

吸附法是最簡(jiǎn)單、方便的固定化方法，主要分為表面吸附和孔道吸附兩類(lèi)，通過(guò)弱的相互作用力(如氫鍵、范德華力、親疏水作用和靜電作用等)實(shí)現(xiàn)酶的固定化。共價(jià)結(jié)合法主要利用酶表面的氨基酸殘基，如氨基(—NH2)、羧基(—COOH)或巰基(—SH)等與載體材料上特定官能團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，以強(qiáng)的共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)兩者的結(jié)合。包埋法是將酶包封在材料中，一般是將載體原料與酶“一鍋反應(yīng)”，通過(guò)機(jī)械攪拌、加入交聯(lián)劑等將酶分子包裹在凝膠等材料中的方法。交聯(lián)法是利用酶自身的雙官能團(tuán)結(jié)構(gòu)或者加入一些交聯(lián)劑(如戊二醛、甲苯二異氰酸酯等)聯(lián)結(jié)起來(lái)而不需要載體的一種固定化方法。此外，原位合成法(denovo法)也是一種酶的高效固定方法，主要是基于MOFs材料而發(fā)展起來(lái)的，是指將酶溶液與合成MOFs的前體(如金屬鹽和配體)混合在一起，在MOFs結(jié)構(gòu)的形成、生長(zhǎng)過(guò)程中，同時(shí)實(shí)現(xiàn)酶的包覆的新型固定化策略。5種固定化方式各有優(yōu)缺點(diǎn)，總結(jié)于表1中。

2 固定化酶的載體

選擇合適的固體載體對(duì)酶的固定及其應(yīng)用起著至關(guān)重要的作用。載體材料的選擇應(yīng)當(dāng)考慮酶的類(lèi)型、反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)條件及應(yīng)用領(lǐng)域等方面。理想的固定化酶載體應(yīng)滿足以下條件：①具有熱穩(wěn)定性、力學(xué)穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。②該載體應(yīng)具有較高的負(fù)載酶能力，不能導(dǎo)致酶的變性或失活。③提供生物相容且有利于酶催化反應(yīng)的微環(huán)境。④工業(yè)應(yīng)用的載體應(yīng)是相對(duì)便宜和環(huán)境友好的材料[15-18]。隨著生物、材料和化學(xué)學(xué)科的不斷交叉發(fā)展，越來(lái)越多的可服務(wù)于固定化生物分子的新型載體材料被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。按照載體材料化學(xué)組成的不同，可將其分為無(wú)機(jī)載體材料(包括沸石[19]、多孔二氧化硅[20]、活性炭[21、硅藻土[22]和氧化鋁等)、無(wú)機(jī)-有機(jī)雜化載體材料(包括金屬-有機(jī)框架材料(MOFs)等[6]以及純有機(jī)載體材料(包括天然高分子材料[23]、共價(jià)有機(jī)框架材料(COFs)[7]等)這三大類(lèi)。其中，金屬-有機(jī)框架材料(MOFs)和共價(jià)有機(jī)框架材料(COFs)兩種新型結(jié)晶性材料具有可調(diào)節(jié)的孔道、較高的比表面積、多樣的結(jié)構(gòu)及易于后修飾等特點(diǎn)，成為近幾年來(lái)固定載體的研究熱點(diǎn)，引起國(guó)內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注。

表1 5種酶固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)

2.1 無(wú)機(jī)載體材料

無(wú)機(jī)載體材料(包括沸石、多孔二氧化硅、活性炭、硅藻土、金屬氧化物及碳納米管等)由于熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)、力學(xué)強(qiáng)度高、來(lái)源廣泛和價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于酶的固定化。

Diaz等[24]首次將4種尺寸不同的酶(細(xì)胞色素C、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和過(guò)氧化物酶)成功固定在孔徑為4 nm的介孔二氧化硅MCM-41上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)負(fù)載效率與酶的尺寸大小有明顯的相關(guān)性。

Sheng等[25]通過(guò)席夫堿反應(yīng)將木瓜蛋白酶共價(jià)固定在多孔Fe3O4納米顆粒上，固定化的木瓜蛋白酶比游離酶具有更高的活性、更寬的pH和溫度適用范圍，循環(huán)催化8次后仍保持70%的初始酶活。

Khan等[26]分別通過(guò)物理吸附和共價(jià)固定兩種方法將β-半乳糖苷酶固定在修飾后的鈷/多壁碳納米管(MWCNTs)復(fù)合物上，兩種方法均提高了酶的穩(wěn)定性和循環(huán)利用性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)共價(jià)固定法比物理吸附具有更高的負(fù)載量和循環(huán)利用性。

雖然無(wú)機(jī)材料已被廣泛應(yīng)用，但是由于其結(jié)構(gòu)不易調(diào)控、有時(shí)易發(fā)生酶泄露等問(wèn)題，導(dǎo)致其應(yīng)用仍具有一定的局限性。

2.2 無(wú)機(jī)-有機(jī)雜化載體材料

金屬-有機(jī)骨架材料(MOFs),又稱(chēng)多孔配位聚合物(PCPs)，是一類(lèi)由無(wú)機(jī)金屬離子或金屬簇(nodes)與有機(jī)配體(linker)通過(guò)配位鍵連接而成的一類(lèi)新型的多孔晶體材料，在氣體吸附和分離、能源儲(chǔ)存、質(zhì)子傳導(dǎo)和藥物傳輸?shù)确矫婢哂芯薮蟮膽?yīng)用潛力[27-30]。由于金屬節(jié)點(diǎn)和有機(jī)配體的結(jié)構(gòu)及種類(lèi)具有多樣性，科研工作者可以靈活設(shè)計(jì)并合成具有特定幾何形狀、尺寸和功能的MOFs。同時(shí)，MOFs具有極高的比表面積和高孔隙率的特點(diǎn)，使其可作為優(yōu)良的生物分子固定化平臺(tái)。用MOFs固定酶具有以下優(yōu)點(diǎn)[6,31-32]：①高比表面積和高孔隙率使得其可達(dá)到很高的酶負(fù)載量。②MOFs具有開(kāi)放的孔隙結(jié)構(gòu)，底物和產(chǎn)物可以通過(guò)孔隙進(jìn)行運(yùn)輸和傳遞。③MOFs的金屬節(jié)點(diǎn)、配體和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有多樣性，可以根據(jù)酶的性質(zhì)和應(yīng)用目的進(jìn)行相應(yīng)的載體材料設(shè)計(jì)和優(yōu)化，以提升酶的固定化效果。④MOFs具有高結(jié)晶性，可提供材料明確而清晰的結(jié)構(gòu)信息，這為進(jìn)一步研究載體與酶的相互作用及相關(guān)機(jī)制提供了有利條件。

2011年，筆者所在課題組的Lykourinou等[33]首次成功將微過(guò)氧化物酶(MP-11)固定在介孔的Tb-mesoMOF中，并證明了MP-11@Tb-mesoMOF在有機(jī)溶劑中具有很好的催化性能和優(yōu)良的重復(fù)利用性。為了探究MOFs的包裹機(jī)制，Chen等[34]進(jìn)一步研究了尺寸為2.6 nm×3.2 nm×3.3 nm的細(xì)胞色素c(Cyt c)進(jìn)入孔隙窗口為1.3 nm和1.7 nm的Tb-mesoMOF機(jī)制，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，Cyt c能夠進(jìn)入孔隙比酶本身尺寸更小的MOF孔道，并且在進(jìn)入過(guò)程中酶的構(gòu)象會(huì)發(fā)生明顯變化，在穿過(guò)MOFs相對(duì)較小的孔隙窗口后，酶進(jìn)入了較大的籠狀孔空間中(～3.9 nm)，因而自身會(huì)發(fā)生構(gòu)象恢復(fù)，從而恢復(fù)其活性(圖2)。這一有趣的發(fā)現(xiàn)與自然界中普遍存在的生物大分子穿膜現(xiàn)象高度相似，這一研究也為利用多孔框架材料固定化生物分子研究其傳遞現(xiàn)象提供了新的思路。此外，Chen等[35]進(jìn)一步解釋了酶為什么可以保留在MOFs孔內(nèi)部而不易泄露，通過(guò)拉曼光譜等研究發(fā)現(xiàn)MP-11與Tb-mesoMOF之間有著強(qiáng)π-π相互作用，使得酶與MOFs的結(jié)合更牢固(圖3)。這些工作為接下來(lái)設(shè)計(jì)和優(yōu)化MOFs材料，進(jìn)而為酶的固定化方向奠定了理論基礎(chǔ)。

圖2 細(xì)胞色素c向Tb-mesoMOF孔隙擴(kuò)散的機(jī)制[34]Fig.2 Tentative mechanism of Cyt c diffusing into the pores of Tb-mesoMOF[34]

圖3 MP-11@Tb-mesoMOF,Tb-mesoMOF和 MP-11的拉曼光譜(a)以及MP-11與 Tb-mesoMOF相互作用的機(jī)制(b)[35]Fig.3 Raman spectra of MP-11@Tb-mesoMOF,Tb- mesoMOF and MP-11 (a) and tentative mech- anism for the specific interactions between MP-11 and Tb-mesoMOF (b)[35]

2015年，周宏才教授課題組的Feng等[36]用具有優(yōu)良水穩(wěn)定性的MOFs(PCN-332、PCN-333)固定化酶，很好地保持了酶的催化活性并實(shí)現(xiàn)較高的重復(fù)利用性。隨后，Lian等[37]制備了具有3種不同孔徑的多級(jí)孔道結(jié)構(gòu)PCN-888，通過(guò)分步包埋的方法將兩種不同尺寸的酶分子葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根過(guò)氧化氫酶(HRP)分區(qū)固定在MOFs的多級(jí)孔道中，構(gòu)建了級(jí)聯(lián)反應(yīng)的納米反應(yīng)器。此外，劉錚教授和戈鈞教授團(tuán)隊(duì)的Lyu等[8]在2014年首次通過(guò)原位包裹法將Cyt c固定在ZIF-8中，解決了MOFs難以固定大尺寸酶分子和酶泄露等問(wèn)題。

2.3 有機(jī)載體材料

有機(jī)材料按照其來(lái)源可分為天然高分子材料和合成有機(jī)材料(包括非多孔有機(jī)材料和多孔有機(jī)材料)，而用于固定化酶研究的有機(jī)載體主要是天然高分子材料和共價(jià)有機(jī)骨架材料兩大類(lèi)。

2.3.1 天然高分子材料

天然高分子材料主要包括海藻酸鹽、明膠、殼聚糖、甲殼素、纖維素和淀粉等[23]。這類(lèi)材料具有來(lái)源廣泛、成本低廉、生物兼容性好及生物可降解等優(yōu)點(diǎn)，是用于固定化酶的良好載體材料，可有效改善酶的穩(wěn)定性和使用效率。其中，海藻酸鹽是研究較多的用以固定化酶的天然高分子載體材料。另外，在海藻酸溶液中加入二價(jià)陽(yáng)離子交聯(lián)劑，如CaCl2溶液,可以制備具有獨(dú)特性質(zhì)的水凝膠或微球結(jié)構(gòu)，即常用的海藻酸鈣載體。2011年，Wang等[38]為了提高GOx的穩(wěn)定性和催化率，將葡萄糖氧化酶固定在海藻酸鈣和殼聚糖的復(fù)合物(CACM)上，研究發(fā)現(xiàn)，CACM-GOx在4 ℃儲(chǔ)存兩個(gè)月后仍能保留初始酶活的70.4%，明顯高于游離酶的7.5%。

2019年，Yang等[39]將脂肪酶固定在經(jīng)過(guò)化學(xué)改性的海藻酸鈣載體上，提供了一種可用于油/水雙相的催化體系，并具有良好的穩(wěn)定性和可回收性，循環(huán)催化10次仍保持90%初始酶活。

雖然天然高分子在固定化酶上具有生物兼容性良好等優(yōu)點(diǎn)，但這類(lèi)材料力學(xué)強(qiáng)度通常較低，有時(shí)也會(huì)由于微生物的侵入而被分解。

2.3.2 共價(jià)有機(jī)框架材料

共價(jià)有機(jī)框架材料(COFs)，是一類(lèi)完全由有機(jī)單體通過(guò)共價(jià)鍵連接而形成的結(jié)晶性多孔材料，近年來(lái)在材料研究領(lǐng)域迅速發(fā)展起來(lái)[7,40-43]。COFs材料不僅有著與MOFs類(lèi)似的可用于固定化酶的良好性質(zhì)，如結(jié)構(gòu)可調(diào)性、高孔隙率和高比表面積等，還具有密度低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，是一類(lèi)在固定化酶領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力的新型材料。

2015年Banerjee課題組的Kandambeth等[44]將胰蛋白酶固定在具有介孔結(jié)構(gòu)的COF-Dha-Tab上，負(fù)載量達(dá)到15.5 μmol/g，固定化后可保持游離酶活的60%，這是首次將酶固定在COFs材料上，為開(kāi)發(fā)新型固定化酶載體提供了新的思路。2018年，馬勝前教授課題組的Sun等[45]將脂肪酶(PS)吸附固定在COFs材料中，研究發(fā)現(xiàn)PS@COFs的穩(wěn)定性和催化活性遠(yuǎn)高于其他類(lèi)型的多孔材料，如MCM-41和PCN-128(圖4)，這是由于COFs獨(dú)特的介孔結(jié)構(gòu)和表面化學(xué)的可調(diào)節(jié)性使其具有更好的親和力和生物相容性，為酶發(fā)揮催化性能提供了適宜的孔道微環(huán)境。2018年，筆者所在課題組的Zhang等[46]通過(guò)共價(jià)連接法將溶菌酶固定在COFs中，用于手性分子的高效分離，酶負(fù)載量達(dá)到22 μmol/g，且無(wú)泄露。有趣的是，酶分子的兩親性能在其固定化后制備的手性拆分柱中被繼承，因而此新型手性分離柱可兼容正相和反相高效液相色譜(HPLC)(圖5)。

圖4 脂肪酶及用于固定酶的多孔材料(a)和多孔材料對(duì)脂肪酶吸附(b)[45]Fig.4 Graphic view of lipase PS and porous materials used for the immobilization of enzymes (a)and enzyme uptake capacity of various porous materials after incubation in lipase PS solution (30 mg/mL for 6 h) (b)[45]

圖5 Lysozyme ? COF 1作為手性固定相及用于 手性分離對(duì)映體的分離效果[46]Fig.5 Illustration of lysozyme?COF 1 based CSPs for chiral separation[46]

3 固定化酶的應(yīng)用

自1916年固定化酶技術(shù)首次應(yīng)用以來(lái)[5]，科研工作者通過(guò)不斷探究和改進(jìn)固定化載體和策略，大大提高了酶的操作穩(wěn)定性、回收和重復(fù)利用性，使其在生物催化、生物傳感等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

3.1 生物催化

隨著酶學(xué)理論的不斷深入及“酶工程”的崛起，生物催化在化學(xué)、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到日益廣泛的應(yīng)用。酶在溫和條件下工作時(shí)具有較高的化學(xué)選擇性、立體選擇性和區(qū)域選擇性[47]。然而，游離酶的耐酸堿度范圍窄、熱穩(wěn)定性差及對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性差等缺點(diǎn)限制了其工業(yè)化應(yīng)用。固定化酶技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展不斷拓寬了酶的應(yīng)用范圍。Rafiei等[48]將脂肪酶包埋在微孔沸石咪唑酯骨架材料(ZIF-67)中，構(gòu)建一種新的生物催化劑lipase@ZIF-67,成功地催化了大豆油與生物柴油的酯交換反應(yīng)，并且在循環(huán)催化6次后，酶活無(wú)明顯降低。Hu等[49]將脂肪酶固定在經(jīng)聚二甲基硅氧烷(PDMS)修飾過(guò)的疏水UiO-66-PDMS材料中，并用于催化生產(chǎn)生物柴油，研究發(fā)現(xiàn)，固定化脂肪酶處理24 h時(shí)，生物柴油產(chǎn)率可達(dá)88%，連續(xù)操作10次后酶活性仍保持83%。

3.2 生物傳感

生物傳感是將DNA、抗體或酶通過(guò)共價(jià)結(jié)合、吸附或包封等方法固定在特定的材料上，開(kāi)發(fā)出靈敏的生物傳感器和生物檢測(cè)方法[50]。固定化酶用于生物傳感可以快速靈敏和具有選擇性地分析目標(biāo)分子，因而成為檢測(cè)各種生物和化學(xué)成分的重要工具，在醫(yī)療診斷、食品的毒素檢測(cè)、制藥、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及農(nóng)業(yè)等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。1962年，Clark等[51]用GOx設(shè)計(jì)生物傳感器，用于葡萄糖的檢測(cè)，首次實(shí)現(xiàn)生物傳感的應(yīng)用。經(jīng)過(guò)60多年的研究，生物傳感在靈敏度和檢測(cè)范圍上得到很大的進(jìn)步和提高。2015年，Patra等[52]用一種生物相容性、電化學(xué)性質(zhì)良好的納米復(fù)合材料MIL-100(Fe)-Pt來(lái)固定GOx，制備了用于檢測(cè)葡萄糖的新型生物傳感器，在很短的響應(yīng)時(shí)間(<5 s)內(nèi)，其檢測(cè)限可達(dá)5 μmol/L。

3.3 生物分離

天然酶不僅具有手性結(jié)構(gòu)單元，還具有特異性相互作用的特點(diǎn)，而一些多孔材料(如MOFs、COFs)具有特定的孔道尺寸和孔道環(huán)境，且可以很好地固定化酶，提高其穩(wěn)定性。將兩者結(jié)合起來(lái)所得的復(fù)合材料，使得酶分子在分離方面也具有巨大的應(yīng)用潛力。2018年，Ren等[53]利用聚乙烯亞胺(PEI)、MOFs、漆酶和聚多巴胺(PDA)對(duì)工業(yè)用聚丙烯腈(PAN)超濾膜的分離層和支撐層進(jìn)行“三維改性”，制備了一種高滲透、高效且穩(wěn)定的生物催化膜，用于去除水中的微污染物；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LacPAN-MIL-101-L生物催化膜具有良好的滲透性和去除微污染性能。同年，筆者所在課題組的Zhang等[46]將具有手性結(jié)構(gòu)的溶菌酶通過(guò)共價(jià)鍵固定在COFs材料(COF-1)上，得到的復(fù)合材料作為手性固定相，用于HPLC中外消旋化合物的分離，研究發(fā)現(xiàn)：該手性固定相可用于正相、反相和極性有機(jī)相HPLC中，對(duì)多種外消旋體均表現(xiàn)出較高的手性分離效率，并且具有很好的重現(xiàn)性和重復(fù)利用性(圖5)。

4 總結(jié)與展望

隨著酶的工業(yè)化發(fā)展，人們對(duì)于獲得操作穩(wěn)定性好、應(yīng)用條件寬、易于回收利用的固定化酶技術(shù)的需求越來(lái)越大，對(duì)固定化策略和固定化載體的探索和創(chuàng)新也越來(lái)越迫切。雖然近年來(lái)在固定化策略和載體材料發(fā)展上取得了很大的突破，酶的可操作性和回收利用性得到很大提高，但也存在一些不足：如，固定化過(guò)程影響酶的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致活性下降、酶的泄露、傳質(zhì)受阻、載體結(jié)構(gòu)坍塌、固定化過(guò)程復(fù)雜、載體改性成本高等問(wèn)題。未來(lái)仍需不斷探索新的固定化策略和載體，并將不同的策略和載體材料結(jié)合起來(lái)解決當(dāng)前固定化酶技術(shù)中的問(wèn)題。其中，MOFs和COFs材料的改性、聯(lián)用將會(huì)成為固定化酶載體的研究熱點(diǎn)，同時(shí)也會(huì)利用新的技術(shù)，創(chuàng)新性地從分子結(jié)構(gòu)、構(gòu)象變化等方面深入探究酶與載體材料之間的作用機(jī)制，為進(jìn)一步優(yōu)化固定化酶技術(shù)提供理論指導(dǎo)。