黃宇翔，張 軍，王志強(qiáng)，鄒 躍，陳 亮，吳憲，候美如

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院 161005）

豬偽狂犬病( Porcine pseudorabies，PR)是由ɑ 皰疹病毒引起的多種家畜和野生動(dòng)物感染的一種急性傳染病。 除豬以外的其他動(dòng)物發(fā)病后表現(xiàn)為發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎等癥狀。 該病危害各階段的豬，新生仔豬常出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、腹瀉、嘔吐、生長(zhǎng)不良等臨床表現(xiàn)，死亡率高達(dá)100%；成年母豬和公豬多表現(xiàn)為繁殖障礙以及呼吸道癥狀，給世界多國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。 歐美等一些發(fā)達(dá)國(guó)家，已經(jīng)根除了此病。 我國(guó)也在制定根除計(jì)劃，但近年來(lái)我國(guó)多省份仍有該病的報(bào)道， 嚴(yán)重影響和危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。 本試驗(yàn)從發(fā)病仔豬中分離鑒定一株豬偽狂犬病毒，為豬偽狂犬病流行病學(xué)調(diào)查、 疫苗的研發(fā)以及致病機(jī)理的研究提供重要的幫助。

1 材料和方法

1.1 病料及試驗(yàn)動(dòng)物

病料 2017 年齊齊哈爾郊區(qū)某豬場(chǎng)發(fā)生懷孕母豬流產(chǎn)，3～5 日齡仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉，并伴有神精癥狀。 剖檢死亡仔豬，采取腦、淋巴結(jié)、肝、肺等組織。

試驗(yàn)動(dòng)物 6 周齡BALB/c 小鼠，由哈藥生物疫苗有限公司提供。

1.2 試劑及細(xì)胞

TIANamp virus DNA/RNA kit 購(gòu)于OMEGA 公司； 高GC 含量PCR 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖購(gòu)于TaKaRa 公司。 DMEM 培養(yǎng)基，購(gòu)于GIBCO 公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清，購(gòu)于天津市灝洋生物制品科技有限公司；Vero 細(xì)胞由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.3 病料采集及處理

收集疑似患有PR 的仔豬的腦或淋巴結(jié)等組織， 通過(guò)無(wú)菌的條件下取約1.0g 的組織樣品，加入2.0mL 無(wú)菌生理鹽水，在組織均質(zhì)破碎儀中處理30s， 將其放置-80℃反復(fù)凍融3 次， 隨后4℃條件下12000r/min 離心10min；取200μL 上清液用于組織中病毒DNA 的提取，或取上清液經(jīng)過(guò)0.22μm 濾膜過(guò)濾后，分裝保存于-80℃冰箱保存，用于病毒分離。

1.4 PCR 檢測(cè)

應(yīng)用DNA 提取試劑盒提取樣品病毒核酸， 并進(jìn)行PCR 反應(yīng)試驗(yàn)。 參照文獻(xiàn)[1]以PRV 主要毒力基gE 基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 基因 片 段長(zhǎng)為217bp。 引物F1：CACGGAGGAGGAGCTGGGGCT；F2：GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT， 由 上海生工生物工程公司合成。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，63℃退火1min，72℃延伸1min，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 病毒的分離

將PCR 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的組織樣品處理后，取1.0mL 濾過(guò)液接種于生長(zhǎng)良好單層的Vero 細(xì)胞，37℃條件下吸附1h， 棄接種液，加入含2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，如未出現(xiàn)病變盲傳幾代，待細(xì)胞80%發(fā)生病變時(shí)終止培養(yǎng)，反復(fù)凍融3 次后，收集病毒液，置于-80℃保存。

1.6 病毒半數(shù)感染量（TCID50）測(cè)定

取病毒液，用無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)液作10 倍系列稀釋?zhuān)瑢⑾♂尪葹?0－1～10－10 的病毒液按100μL/孔接種到長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)稀釋度接種8 孔，同時(shí)培養(yǎng)板最后兩列接種DMEM 作為對(duì)照。 連續(xù)4d 觀察細(xì)胞病變情況，判定結(jié)果，按照Reed－Muench 法計(jì)算病毒的TCID50。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn)

試驗(yàn)分兩組，每組各5 只6 周齡BALB/c 小鼠，一組用200 TCID50稀釋毒經(jīng)腹股溝皮下進(jìn)行注射，接種量為0.5mL/只。 另一組接種等量的PBS 液作為陰性對(duì)照。 每天觀察和記錄小鼠的臨床癥狀和死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 病毒培養(yǎng)結(jié)果

病料處理液接種Vero 細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)后， 出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變，18h 細(xì)胞開(kāi)始變圓，42h 細(xì)胞圓縮，聚集，脫落（見(jiàn)圖2），60h 細(xì)胞嚴(yán)重脫落。

圖1 病料組織感染vero 細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變（10×40）

2.2 TCID50 測(cè)定結(jié)果

根據(jù)分離病毒不同滴度接種Vero 細(xì)胞后出現(xiàn)的細(xì)胞病變情況，利用Reed-Muench 法進(jìn)行毒價(jià)TCID50測(cè)定，結(jié)果TCID50＝10-8.1/0.1mL(見(jiàn)表1)。

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2.3 PCR 檢測(cè)結(jié)果動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

按TIANamp virus DNA/RNA kit 操作說(shuō)明以病毒培養(yǎng)液為樣本提取病毒DNA，以此為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果，可見(jiàn)清析的目的條帶（見(jiàn)圖2）。

圖2 PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

BALB/c 小鼠接種該病毒液后出現(xiàn)了典型的PR 癥狀：發(fā)病的小鼠啃咬接種部位， 嚴(yán)重的皮膚出血， 皮毛脫落， 接種120h后，病毒接種組全部死亡。 對(duì)照組小鼠無(wú)異常變化。

3 討論

試驗(yàn)從疑似豬偽狂犬病毒感染的病料中分離到一株病毒，經(jīng)vero 細(xì)胞傳代培養(yǎng)， 出現(xiàn)了明顯細(xì)胞圓縮等特征性病變；經(jīng)PCR 試驗(yàn)檢測(cè)到特異性目的條帶；動(dòng)物試驗(yàn)出現(xiàn)了典型的PR 癥狀，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[2～3]。 以上結(jié)果證明此次分離的病毒為豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株。 該豬場(chǎng)一直用進(jìn)口Bartha k61 弱毒疫苗進(jìn)行免疫，但是偽狂犬病發(fā)生后仍然造成了流產(chǎn)率驟然上升、仔豬腹瀉和神經(jīng)癥狀，死亡率較高。 經(jīng)典毒株疫苗是否已經(jīng)難以抵抗新流行毒株發(fā)病還需進(jìn)一步研究。 該分離毒株可為豬偽狂犬流行病學(xué)研究和新型疫苗研發(fā)提供有用的生物材料， 對(duì)于控制我國(guó)豬偽狂犬病的流行具有重要意義。