黃 煜，蔣家璇，張凱迪，姚沛琳

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

0 引言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB） 是可以利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱[1]。乳酸菌不僅可以提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善食品的風(fēng)味，還可以提高食品保鮮和附加值，而且還具有特殊的生理活性。大量研究表明，乳酸菌可以降低血清膽固醇、控制內(nèi)毒素、制造營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而對(duì)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、生理功能、衰老過程等產(chǎn)生作用。由于乳酸菌具有諸多益生作用，人們對(duì)此加以重視并開發(fā)利用[2]。

氧化是肌膚衰老的最大威脅，還可引發(fā)心血管、關(guān)節(jié)炎、癌癥等疾病[3]。飲食不健康、日曬、環(huán)境污染、壓力等都可以讓機(jī)體內(nèi)自由基泛濫，從而使肌膚產(chǎn)生各種氧化現(xiàn)象?？寡趸镔|(zhì)就是以低濃度存在就能有效抑制自由基的氧化反應(yīng)的物質(zhì)，其可以直接作用在自由基上，也可以間接消耗掉容易生成自由基的物質(zhì)，防止發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)[4]。人體中的抗氧化物質(zhì)一部分由自身合成，另外一部分由食物供給。乳酸菌作為一種研究較多的益生菌，能夠降低自由基的生成[5]，作為一種天然抗氧化劑具有較大的研究?jī)r(jià)值。

從皖北地區(qū)腌制咸菜（宿州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采購(gòu)的腌制雪菜、豆角、白菜等）中分離出來的20株乳酸菌的基礎(chǔ)上，測(cè)定其菌體及無細(xì)胞提取物的羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原能力、螯合亞鐵離子能力這4個(gè)抗氧化指標(biāo)，比較它們之間抗氧化活性的差異，篩選出具有高抗氧化活性的菌株，為后續(xù)研究提供優(yōu)良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

20株乳酸菌，從皖北地區(qū)采集的腌制菜中篩選得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：魚粉蛋白胨10 g/L，酵母粉5/L，牛肉浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸錳0.25 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，吐溫-80 1 mL/L，于121℃下高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑

焦性沒食子酸、七水合硫酸亞鐵、六水合三氯化鐵、六氰合鐵（III）酸鉀、水楊酸、DPPH試劑等，均購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化

20株乳酸菌菌株保存于含30%（V/V） 甘油的MRS培養(yǎng)基中，于-80℃下保存，使用前按2%（V/V） 接種量接于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)20 h，連續(xù)活化2次[6]。

1.2.2 乳酸菌無細(xì)胞提取物的制備

參考Liu C等人[7]的方法，并稍作修改。收集活化后的乳酸菌（4℃，以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心10 min），用PBS清洗2次后，重懸于PBS中，超聲破碎。超聲破碎條件設(shè)置為：功率60 W，工作3 s停8 s，共15 min。將超聲后的破碎液以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心20 min后取其上清液，經(jīng)過0.22 μm的濾膜過濾后得到無細(xì)胞提取物。

1.2.3 乳酸菌DPPH清除率的測(cè)定

取樣品1 mL，濃度0.2 mmol/L的DPPH-無水乙醇溶液1 mL，依次加入試管中，二者充分混勻后，于37℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h，隨后立即于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定制品的吸光度值，該方法用蒸餾水做空白對(duì)照[8]。自由基清除率計(jì)算方法如下：

式中：A1——空白管的吸光度；

A2——樣品管的吸光度。

1.2.4 乳酸菌羥自由基清除能力的測(cè)定

1，10- 菲羅啉 2.5 mmol/L溶液、PBS（pH 值 7.4）和樣品溶液各加入1 mL，再加1 mL濃度2.5 mmol/L FeSO4溶液。充分混合后，加入1 mL濃度20 mmol/L的H2O2溶液。反應(yīng)混合物在37℃水浴中保持1.5 h。離心收集的上層清液是以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心10 min，其波長(zhǎng)為536 nm。同時(shí)，按照上述方法，用1 mL PBS代替混合物中1 mL的樣品溶液作為空白對(duì)照組，測(cè)定536 nm處的吸光度[9]。自由基清除率計(jì)算方法如下：

式中：A1——對(duì)照組在波長(zhǎng)536 nm處測(cè)得的吸光度；

A2——樣品管在波長(zhǎng)536 nm處測(cè)得的吸光度。

1.2.5 乳酸菌還原能力的測(cè)定

取樣品0.5 mL，加入1%鐵氰化鉀溶液0.5 mL后PBS（pH值6.6）?；旌显?0℃恒溫水浴20 min。從水浴中取出后，迅速在冰浴中冷卻。加入10%三氯乙酸溶液0.5 mL，混合離心，取上清液（以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min）。取上清液1 mL，加入0.1%氯化鐵溶液1 mL，拌勻。10 min后，以鹽酸半胱氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)，用蒸餾器代替混合物中的樣品于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)量水的吸光度[10]。吸光度越高，待測(cè)樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.2.6 乳酸菌螯合亞鐵離子的測(cè)定方法

加入0.1 mL抗壞血酸、0.1 mL硫酸亞鐵和100 mL硫酸亞鐵。2 mol/L的氫氧化鈉溶液，在37℃恒溫水浴20 min后，三氯乙酸沉淀的蛋白質(zhì)，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，取上清液0.2 mL，添加0.1%的鄰菲羅啉2 mL反應(yīng)10 min后，于510 nm處測(cè)量吸光度，OD值，同時(shí)做空白試驗(yàn)（PBS）[11]。

式中：P0——PBS系統(tǒng)OD值；

P1——樣品系統(tǒng)的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

乳酸菌對(duì)DPPH自由基清除率結(jié)果見表1。

DPPH自由基清除率的測(cè)定是一種使用很廣泛的評(píng)價(jià)和篩選抗氧化劑抗氧化能力的方法。DPPH清除率越大表明抗氧化能力越強(qiáng)[12]。試驗(yàn)測(cè)定了20株乳酸菌的無細(xì)胞提取物對(duì)DPPH自由基的清除情況。20株菌株都表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除能力?？傮w而言，菌體細(xì)胞DPPH自由基清除率要比無細(xì)胞提取物強(qiáng)。其中，菌株4-1，3-3的無細(xì)胞提取物對(duì)DPPH自由基清除能力比較強(qiáng)，分別為61.24%，60.85%；菌株3-1，3-3的菌體細(xì)胞對(duì)DPPH自由基清除率較強(qiáng)，分別為56.98%，52.71%。

2.2 乳酸菌清除羥自由基能力的測(cè)定

表1 乳酸菌對(duì)DPPH自由基清除率結(jié)果

乳酸菌清除羥自由基能力結(jié)果見表2。

表2 乳酸菌清除羥自由基能力結(jié)果

羥基自由基是一種體內(nèi)氧化能力較強(qiáng)的自由基，可對(duì)大分子造成損傷。因此，清除羥自由基的能力也是衡量抗氧化能力的重要指標(biāo)[13]。研究測(cè)定了不同乳酸菌的無細(xì)胞提取物對(duì)羥基自由基的清除能力，各菌株均表現(xiàn)出一定的羥基自由基清除能力?？傮w看來，菌體和無細(xì)胞提取物清除羥自由基能力相差不大，其中菌株7-1和6-2的菌體對(duì)羥基自由基清除能力較強(qiáng)，分別為48.80%，47.06%；菌株7-1和5-3的無細(xì)胞提取物對(duì)羥基自由基清除能力較強(qiáng)，分別為50.93%，49.96%；菌株5-1的無細(xì)胞提取物對(duì)羥基自由基清除能力最低，為5.76%。

2.3 乳酸菌還原能力的測(cè)定

乳酸菌還原能力的測(cè)定結(jié)果見表3。

抗氧化能力與還原能力直接相關(guān)[14]，20株乳酸菌的菌體和無細(xì)胞提取物的還原能力測(cè)定結(jié)果均顯示乳酸菌具有一定的還原能力，無細(xì)胞提取物的還原能力相對(duì)于菌體的還原能力而言更強(qiáng)。其中，菌株1-2的菌體細(xì)胞的還原力相對(duì)較強(qiáng)，為0.233，而菌株6-2的菌體細(xì)胞最弱，為0.086；菌株3-5的無細(xì)胞提取物的還原能力較強(qiáng)，為0.248，而菌株3-1的還原能力最低，為0.035。

2.4 乳酸菌螯合亞鐵離子的測(cè)定

乳酸菌螯合亞鐵離子的結(jié)果見表4。

表3 乳酸菌還原能力的測(cè)定結(jié)果

表4 乳酸菌螯合亞鐵離子的結(jié)果

由表4可知，20株乳酸菌均具有一定的螯合亞鐵離子的能力，但是菌體細(xì)胞和無細(xì)胞提取物對(duì)亞鐵離子的螯合能力基本上差別不大。其中，菌株10-1的無細(xì)胞提取物螯合亞鐵離子能力最強(qiáng)，為65.56%，其次是6-2，為34.00%；菌株A-1的菌體細(xì)胞相對(duì)較好，為65.66%，而菌株4-1的則最差，為0.75%。

3 結(jié)論

乳酸菌的抗氧化作用與其對(duì)人體健康息息相關(guān)[15]。試驗(yàn)以羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原能力的測(cè)定、螯合亞鐵離子能力的測(cè)定為體外抗氧化能力評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)20株分離于皖北地區(qū)不同腌制菜中的乳酸菌為篩選源，比較其菌體細(xì)胞和無細(xì)胞提取物的抗氧化活性。結(jié)果表明，20株菌株中，菌體細(xì)胞的DPPH自由基清除率要比無細(xì)胞提取物強(qiáng)要強(qiáng)，而清除羥自由基能力和螯合亞鐵離子能力兩者相差不大，無細(xì)胞提取物的還原能力相對(duì)于菌體細(xì)胞的更強(qiáng)?？傮w上，菌株7-1抗氧化能力較好。其中菌株7-1，3-3，A-1的菌體細(xì)胞抗氧化能力強(qiáng)，菌株3-1，3-5，10-1的無細(xì)胞提取物抗氧化能力強(qiáng)。在今后的研究中，可以對(duì)抗氧化能力強(qiáng)的乳酸菌采用細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，對(duì)其體內(nèi)抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。