周 昊，齊志文，陶 冉，陳虹霞，王成章*

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210042；2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

組蛋白去乙酰化酶(HDAC)是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的治療癌癥的重要靶點(diǎn)。HDAC異常導(dǎo)致的組蛋白乙?；癄顟B(tài)失衡與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，已經(jīng)在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HDAC的過度表達(dá)。HDAC抑制劑通過改變細(xì)胞內(nèi)乙?；?，從而在調(diào)節(jié)基因的翻譯過程、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘發(fā)細(xì)胞凋亡或分化、抑制腫瘤細(xì)胞血管再生等方面產(chǎn)生抗腫瘤活性[1]。設(shè)計(jì)開發(fā)低毒、高效的HDAC抑制劑類似物已成為國(guó)內(nèi)外抗腫瘤靶向藥物研究的熱點(diǎn)。按照結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，HDAC抑制劑可分為4大類：異羥肟酸類、苯甲酰胺類、親電酮類和環(huán)肽類[2]。其中,異羥肟酸類化合物具有特異性強(qiáng)、抗腫瘤活性好且毒副作用小等優(yōu)勢(shì)，是目前研究最廣泛且最深入的一類HDAC抑制劑，典型的異羥肟酸類HDAC抑制劑結(jié)構(gòu)按功能可分為3部分：表面識(shí)別區(qū)、連接臂區(qū)和鋅離子結(jié)合區(qū)。表面識(shí)別區(qū)主要由疏水片段構(gòu)成，通常是苯環(huán)衍生物；連接臂區(qū)為脂肪鏈；鋅離子結(jié)合區(qū)的功能基團(tuán)為異羥肟酸[3-4]。研究[2]表明:異羥肟酸基團(tuán)是HDAC抑制劑的關(guān)鍵藥效基團(tuán)，其可直接與HDAC酶的Zn2+結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而有效抑制HDAC的活性。目前，Merck公司的異羥肟酸類HDAC抑制劑Vorinostat(SAHA)已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療淋巴癌，此外，還有多個(gè)異羥肟酸類HDAC抑制劑處于臨床研究階段[5-6]。漆酚來源于我國(guó)天然產(chǎn)物生漆，漆酚是一種具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的烷基酚類化合物，其側(cè)鏈為不飽和C15的烷烴，漆酚具有很好的抗腫瘤生物活性，其對(duì)人體9種器官29種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用[7-8]，但是漆酚結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易氧化聚合，限制了其作為抗腫瘤藥物的開發(fā)與應(yīng)用[9-11]。Ryckewaert等[12]的研究表明不飽和漆酚具有一定的HDAC抑制活性，其結(jié)構(gòu)與FDA批準(zhǔn)使用的HDAC抑制劑SAHA結(jié)構(gòu)相似，但是還缺少HDAC抑制關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元鋅離子結(jié)合區(qū)。因此本研究擬通過醚化反應(yīng)阻斷漆酚氧化聚合，通過Diels-Alder、水解和羥氨化等反應(yīng)，在漆酚側(cè)鏈尾部引入異羥肟酸基團(tuán)，并且在其苯環(huán)或烷基鏈引入不同藥效基團(tuán)，合成不同的漆酚基異羥肟酸衍生物，評(píng)價(jià)其對(duì)HDAC 2的抑制活性，采用分子模擬軟件對(duì)漆酚基異羥肟酸衍生物與HDAC 2進(jìn)行分子對(duì)接研究，分析二者之間的相互作用，為天然產(chǎn)物漆酚用于HDAC抑制劑的開發(fā)提供重要理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

漆酚，實(shí)驗(yàn)室自制，取一定量生漆原料，以1 ∶20(g ∶mL)甲醇超聲波作用10 min后，減壓回收溶劑，即得精制漆酚，純度大于90%。HDAC檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；甲醇(色譜純)，石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等試劑均為分析純。IR采用德國(guó)TENSOR 27型FT-IR紅外光譜儀測(cè)定；1HNMR和13CNMR譜采用德國(guó)BRUKER 500 MHz核磁共振儀測(cè)定(TMS為內(nèi)標(biāo))；質(zhì)譜采用安捷倫LC-QTOF-MS高分辨質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2 漆酚基異羥肟酸衍生物的合成

1.2.1亞甲基醚漆酚異羥肟酸(化合物1) 將3.2 g漆酚溶于50 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和50 mL 二氯甲烷(DCM)中，加入0.8 g NaH，氬氣保護(hù)下回流過夜，冷卻至室溫后緩慢加入100 mL水，DCM萃取(60 mL ×3)，飽和食鹽水洗后，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸干，柱層析(石油醚(PE)洗脫)得亞甲基醚漆酚。取1.2 g亞甲基醚漆酚，溶于2 mL甲苯，加入2 mL丙烯酸酯，氬氣保護(hù)下加熱回流36 h，減壓蒸干溶劑，加入10 mL乙醇，1.2 g KOH，加熱回流10 min，減壓蒸干溶劑，加入10 mL水，乙酸乙酯(EA)萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸干,柱層析,洗脫劑V(PE) ∶V(EA)=3 ∶1,得中間產(chǎn)物S1。

將30 mg S1 溶于1 mL無(wú)水DMF 中，加入30 μL的N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)，110 mg 硅基保護(hù)羥胺，57 mg 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)，反應(yīng)攪拌過夜，加壓蒸干溶劑，將產(chǎn)物溶于2 mL TBAF-THF 溶液中，室溫?cái)嚢?0 min，減壓蒸干,直接柱層析,洗脫劑V(DCM) ∶V(MeOH)=50 ∶1,得目標(biāo)產(chǎn)物化合物1。

1.2.28′-羥基亞甲基醚漆酚異羥肟酸(化合物2) 取410 mg化合物S1溶于5 mL 二氯甲烷，加入250 mg 間氯過氧苯甲酸(mCPBA)，室溫?cái)嚢柽^夜，飽和碳酸氫鈉溶液洗滌(5 mL ×3)，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸干得無(wú)色油狀物，將其全部溶于2 mL 無(wú)水四氫呋喃中，緩慢滴加到5 mL 含500 mg 氫化鋁鋰混懸液中，升溫至70 ℃反應(yīng)2 h，冷卻至室溫，緩慢加入0.5 mL 水后，再加入0.5 mL 15%氫氧化鈉溶液，再次滴加1.5 mL 水，攪拌30 min后過濾，5 mL 四氫呋喃洗滌，濾液減壓除去四氫呋喃，加入3 mL 水，乙酸乙酯萃取(3 mL×4)，飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥，硅膠柱層析，洗脫劑V(PE) ∶V(EA)=2 ∶1，得中間產(chǎn)物S2。

取60 mg S2 溶于0.5 mL 丙酮中，冰水浴降溫，滴加入200 μL Jones試劑(三氧化鉻-硫酸水溶液)，室溫反應(yīng)30 min，加入100 μL異丙醇，攪拌20 min，加入2 mL 飽和氯化鈉溶液，EA萃取(2 mL ×5)，無(wú)水硫酸鈉干燥，硅膠柱層析，洗脫劑V(PE) ∶V(EA)=1 ∶1，得中間產(chǎn)物S3。

取55 mg S3 溶于0.5 mL 甲醇中，加入10 mg NaBH4，室溫反應(yīng)30 min，減壓蒸干溶解，加入3 mL EA 溶解，飽和食鹽水洗滌兩次，水洗液用EA 萃取(3 mL ×2)，無(wú)水硫酸鈉干燥，加壓蒸干溶劑，真空干燥2 h，加入1 mL DCM，13 mg四氫吡喃基羥胺(NH2OTHP)，15 mg 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·Cl)，20 μL三乙醇胺(TEA)，反應(yīng)過夜，5% 檸檬酸水溶液洗滌(2 mL ×2)，水相DCM 萃取(3 mL×2)，合并有機(jī)相，減壓蒸干溶劑，加入0.8 mL 甲醇溶解，冰水浴降溫，加入1 mL 10% HCl 溶液，反應(yīng)1 h，減壓蒸干溶劑，加入2 mL 甲醇溶解，微孔濾膜過濾，得目標(biāo)產(chǎn)物化合物2。

1.2.36-硝基亞甲基醚漆酚異羥肟酸(化合物3) 將620 mg化合物S1溶于5 mL新蒸醋酐中，降溫至0 ℃，劇烈攪拌下加入300 mg無(wú)水硝酸銅，2 h后再加入300 mg無(wú)水硝酸銅，再過3 h后加入10 mL水，攪拌20 min后用乙酸乙酯萃取(10 mL×2)，有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌(20 mL×2)，無(wú)水硫酸鎂干燥；減壓蒸干得淡黃色油狀物，將其溶于10 mL甲醇中，加入0.5 mL水，1.1 g KOH，加熱回流3 h后減壓蒸干溶劑，再加入5 mL水，乙酸乙酯萃取(5 mL×3)，飽和食鹽水(10 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥，減壓蒸干得淡黃色油狀物，將油狀物45 ℃真空干燥5 h后溶于5 mL無(wú)水二氯甲烷中，加入160 mg NH2OTHP，400 mg O-苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)，0.6 mL N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，室溫反應(yīng)6 h，10%檸檬酸水溶液洗滌(5 mL×2)，之后飽和碳酸氫鈉溶液洗滌(10 mL×2)，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑；硅膠柱層析(V(PE) ∶V(EA)=2 ∶1)得無(wú)色油狀物，將其溶于3 mL甲醇中，加入0.5 mL 6 mol/L鹽酸溶液，室溫?cái)嚢? h，減壓蒸干溶劑，加入3 mL 水，乙酸乙酯萃取(3 mL ×3)，飽和碳酸氫鈉溶液(5 mL)洗滌，之后飽和食鹽水(5 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑得淡黃色油狀物，再將油狀物溶于1 mL甲醇中，微孔濾膜過濾，HPLC純化后，得到目標(biāo)產(chǎn)物化合物3。

化合物1～3的合成路線見圖1。

1.3 分子對(duì)接研究

采用GLIDE程序Version10.2將化合物分子與HDAC 2晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：4 LXZ)進(jìn)行對(duì)接；從PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載HDAC 2蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，對(duì)接前對(duì)HDAC 2晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整鍵序、添加氫原子、填充缺失的側(cè)鏈和環(huán)、去除水分子等預(yù)處理，并用OPLS_2005 力場(chǎng)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化優(yōu)化。配體化合物通過LigPrep模塊被最小化，產(chǎn)生適當(dāng)?shù)碾婋x、互變異構(gòu)、立體化學(xué)和環(huán)構(gòu)象，采用MMFFs力場(chǎng)計(jì)算部分原子電荷。采用Glide模塊生成一個(gè)受體柵格文件，該文件利用下載的晶體結(jié)構(gòu)中的原始配體確定活性位點(diǎn)的位置和大小，并模擬化合物配體與HDAC 2的結(jié)合模式。Glide對(duì)接采用額外精度(XP)模式和默認(rèn)協(xié)議，配體被視為靈活。所有對(duì)接化合物均按Glide評(píng)分函數(shù)進(jìn)行評(píng)分，并進(jìn)一步分析其結(jié)合方式和與關(guān)鍵氨基酸的相互作用。

1.4 HDAC 2酶抑制活性

通過HDAC檢測(cè)試劑盒AK-501檢測(cè)化合物1～3對(duì)HDAC 2的抑制活性，將樣品和陽(yáng)性對(duì)照藥伏立諾他(SAHA)用Tris緩沖液(50 mmol/L，pH值8.0)分別配制成質(zhì)量濃度20、4、0.8、0.16 mg/L的溶液，于96孔板上每孔依次加10 μL緩沖液、 10 μL樣品溶液、 5 μL酶溶液和25 μL底物溶液，空白孔加25 μL緩沖液和25 μL底物溶液，對(duì)照孔加20 μL緩沖液、 5 μL酶溶液和25 μL底物溶液，加畢，37 ℃下孵化30 min，加入顯色劑50 μL，再在37 ℃下孵化15 min，靜置后用Thermo(Multiskan Go)酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)條件下讀取吸光值，計(jì)算各化合物對(duì)HDAC 2的抑制率和IC50值。抑制率=(對(duì)照孔平均OD值-化合物孔平均OD值)/對(duì)照孔平均OD值。

圖1 目標(biāo)化合物1-3的合成路線圖

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的合成及結(jié)構(gòu)鑒定

所有目標(biāo)化合物均未見文獻(xiàn)報(bào)道，合成的目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR、 ESI-MS和IR確證。以三烯烷基漆酚為起始原料，與二氯甲烷和NaH進(jìn)行醚化反應(yīng)，生成亞甲基醚漆酚，可有效阻斷漆酚的氧化聚合。利用漆酚烷基側(cè)鏈的共軛雙鍵與丙烯酸酯進(jìn)行Diels-Alder反應(yīng)，再通過水解得到具有環(huán)己烯甲酸結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵中間體S1，將S1與O-(叔丁基二甲基硅烷)羥胺和HATU進(jìn)行反應(yīng)，即可得到側(cè)鏈尾部具有異羥肟酸基團(tuán)的目標(biāo)化合物1。為了考察漆酚苯環(huán)和脂肪鏈上引入功能基團(tuán)對(duì)HDAC抑制活性的影響，合成了目標(biāo)化合物2和3。以中間體S1為原料，先與mCPBA反應(yīng)，使脂肪鏈上雙鍵氧化成酮，再通過氫化鋁鋰還原成羥基，但同時(shí)S1側(cè)鏈尾部的羰基也被還原成羥基，因此繼續(xù)通過與Jones試劑進(jìn)行氧化反應(yīng)，與NaBH4進(jìn)行還原反應(yīng)得到中間體S4，將S4與NH2OTHP反應(yīng)，即得到脂肪鏈上具有羥基結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物2。以中間體S1為原料，先與無(wú)水硝酸銅進(jìn)行反應(yīng)，使苯環(huán)上引入硝基，再與NH2OTHP反應(yīng)，即得到苯環(huán)上具有硝基結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物3。

2.2 分子對(duì)接研究

采用Grid評(píng)分函數(shù)評(píng)價(jià)化合物與HDAC 2的對(duì)接效果(圖2)，Glide評(píng)分是通過計(jì)算蛋白質(zhì)和配體之間氫鍵、靜電相互作用、范德華力、疏水作用等，對(duì)這些作用力進(jìn)行綜合評(píng)判得到對(duì)接分?jǐn)?shù)，Glide評(píng)分是篩選活性和非活性化合物的一種很好的方法[13-14]。

化合物1、2和3的對(duì)接分?jǐn)?shù)分別為-7.724、-7.914和-7.946，表明3種化合物均能很好地與HDAC 2的活性口袋結(jié)合。由對(duì)接結(jié)合模式(圖3)可以看出，3種化合物的脂肪鏈部分占據(jù)了口袋中長(zhǎng)而窄的管道部位，異羥肟酸基團(tuán)都位于管道的底部，異羥肟酸基團(tuán)中羥基和羰基可與HDAC 2酶的組氨酸145(His145)和酪氨酸308(Tyr308)形成氫鍵相互作用，其中羥基都可和口袋底部的Zn2+形成穩(wěn)定螯合。

圖2 FDA批準(zhǔn)的異羥肟酸型HDAC抑制劑(SAHA)和三烯烷基漆酚的結(jié)構(gòu)圖

a.化合物1 compound 1；b.化合物2 compound 2；c.化合物3 compound 3

此外化合物3苯環(huán)上的硝基還可與谷氨酸103(Glu103)和天冬氨酸 104(Asp104)形成氫鍵作用。化合物與HDAC結(jié)合中的氫鍵和疏水相互作用，在穩(wěn)定配合物和提高結(jié)合親和力方面起著至關(guān)重要的作用[15]。3種化合物中化合物2和3顯示出較高的Glide評(píng)分，這表明在漆酚的烷基側(cè)鏈中引入電子供體基團(tuán)羥基或在苯環(huán)上引入硝基等取代基，可顯著提高其對(duì)HDAC 2的結(jié)合親和力，因?yàn)樗鼈兡芘c殘基形成更強(qiáng)的氫鍵相互作用。

2.3 HDAC2酶抑制活性

圖4 不同濃度化合物對(duì)HDAC 2抑制率的影響 Fig.4 Effect of different concentrations of compounds on inhibition rate of HDAC 2

不同濃度的3種化合物和陽(yáng)性藥SAHA對(duì)HDAC 2的抑制效果如圖4所示?？梢钥闯觯衔?、2和3對(duì)HDAC 2均起到了良好的抑制作用，抑制率均隨著濃度的增加呈上升趨勢(shì)，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。

當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，化合物1、2和3對(duì)HDAC 2的抑制率為94.2%、96.2%和97.6%，其對(duì)HDAC 2的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)為0.33、0.29和0.24 mg/L?；衔?和3對(duì)HDAC 2的抑制效果要優(yōu)于化合物1，其IC50值和陽(yáng)性藥SAHA(IC50=0.20 mg/L)的相當(dāng)。3種化合物物對(duì)HDAC 2的抑制結(jié)果與分子對(duì)接結(jié)果一致，表明在漆酚的烷基側(cè)鏈中引入供電子基團(tuán)羥基，或在苯環(huán)上引入硝基等取代基可顯著提高其對(duì)HDAC 2的抑制活性。

3 結(jié) 論

3.1通過醚化反應(yīng)阻斷漆酚氧化聚合，再經(jīng)Diels-Alder、羥氨化等反應(yīng)，在漆酚側(cè)鏈尾部引入異羥肟酸基團(tuán)，在其苯環(huán)或脂肪鏈引入硝基、羥基等官能團(tuán)，合成了3種新型亞甲基醚漆酚異羥肟酸衍生物，分別是亞甲基醚漆酚異羥肟酸(化合物1)、8′-羥基亞甲基醚漆酚異羥肟酸(化合物2)和6-硝基亞甲基醚漆酚異羥肟酸(化合物3),并用1H NMR,13C NMR和MS對(duì)合成的目標(biāo)化合物進(jìn)行了確認(rèn)。

3.2目標(biāo)化合物與HDAC2的分子對(duì)接結(jié)果顯示：化合物1、2和3的對(duì)接分?jǐn)?shù)分別為-7.724，-7.914和-7.946，均能很好地與HDAC 2的活性口袋結(jié)合，異羥肟酸基團(tuán)中羥基和羰基可與HDAC 2酶的His145和Tyr308形成氫鍵相互作用，并能與活性口袋底部的Zn2+形成穩(wěn)定螯合，化合物3苯環(huán)上的硝基還可與Glu103和Asp104形成氫鍵作用。

3.3通過試劑盒AK-501檢測(cè)化合物對(duì)HDAC2的抑制活性，結(jié)果表明：化合物1、2和3對(duì)HDAC 2均起到了良好的抑制作用，其對(duì)HDAC 2的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)分別為0.33、0.29和0.24 mg/L。其中化合物2和3對(duì)HDAC 2的抑制效果要優(yōu)于化合物1，其IC50值和陽(yáng)性藥SAHA(IC50=0.20 mg/L)的相當(dāng)。說明在漆酚的脂肪鏈中引入羥基或在苯環(huán)上引入硝基等可提高其對(duì)HDAC 2的親和力和抑制活性，本研究可為漆酚基HDAC抑制劑的開發(fā)提供重要的參考。