趙淑銳，楊 源，鄭美青，薛 冰

（首都醫(yī)科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

自由基是含有未成對(duì)電子的原子基團(tuán)，具有非常活潑的化學(xué)性質(zhì)，易失去或得到電子而發(fā)生氧化還原反應(yīng)。這類(lèi)物質(zhì)不但可以直接參與生物體的一些生理和病理過(guò)程，而且在體內(nèi)的多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色[1-2]。

芬頓（Fenton）反應(yīng)是一種非常成熟的產(chǎn)生羥自由基的方法，由于其高效、廉價(jià)、選擇性好等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于研究。芬頓反應(yīng)所需試劑包含 Fe2+和H2O2，其中Fe2+作為催化劑存在。其反應(yīng)機(jī)制是H2O2和Fe2+反應(yīng)生成強(qiáng)氧化能力的羥自由基和Fe3+，F(xiàn)e3+又被H2O2還原回Fe2+，形成循環(huán)反應(yīng)，直至H2O2耗盡，反應(yīng)終止[3]。由于羥自由基存在壽命短、濃度低等問(wèn)題，在檢測(cè)方面存在一定的難度。目前研究中大多采用幾種間接方式，如電子自旋共振法（ESR）、熒光法、分光光度法等。

本文采用芬頓反應(yīng)體系中加入羥自由基清除劑—抗氧化劑維生素C 的方法，以觀察羥基自由基效應(yīng)是否減弱或消除[4]，考察電子自旋共振法（ESR）、熒光法、分光光度法3 種檢測(cè)方法中維生素C 對(duì)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基的清除作用。為體內(nèi)、體外氧化反應(yīng)中羥基自由基的測(cè)量提出了一個(gè)思路和參考方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電子順磁共振波譜儀（ESR）JEOL JES-FA300，RF-5000 熒光分光光度計(jì)（Shimadzu 公司，日本），UV-2450 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Shimadzu 公司，日本）、分析天平（220 g/0.1 mg）、玻璃毛細(xì)管（0.9～ 1.1 mm）、封口膠、順磁管、25 mL 容量瓶。

1.2 試劑

DMPO（5,5-Dimethyl-1-pyrroline N-Oxide，5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物）、維生素 C 購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；水楊酸（分析純）、苯甲酸（分析純）、30%市售H2O2、FeCl3（分析純）、FeSO4·7H2O（分析純）均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 熒光分光光度法測(cè)定羥自由基

熒光分光光度法利用Fenton 體系產(chǎn)生·OH，與熒光很弱的苯甲酸反應(yīng)，生成具有強(qiáng)熒光的二羥基苯甲酸[5]，加入清除劑清除·OH，使體系熒光強(qiáng)度降低，通過(guò)測(cè)定體系熒光強(qiáng)度的變化間接測(cè)定體系·OH 變化。

2.1.1 配制溶液

配制15 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4），準(zhǔn)確稱(chēng)取61.0 mg 苯甲酸溶于20 mL 超純水中，得到25 mmol/L 的苯甲酸水溶液，準(zhǔn)確稱(chēng)取 5.6 mg FeSO4·7H2O 溶于10 mL 超純水中，得到2 mmol/L 的FeSO4水溶液，市售濃度30% H2O2稀釋20 倍得1.5%的H2O2溶液，準(zhǔn)確稱(chēng)取維生素C 35.2 mg，加入1 mL超純水得到濃度為200 mmol/L 的維生素水溶液，然后用超純水稀釋至10、30、50、70、90、110 mmol/L。

2.1.2 測(cè)定不同濃度維生素C 清除·OH 的能力

取7 支5 mL EP 管，每支加入pH7.4 磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL，25 mmol/L 苯甲酸水溶液0.5 mL，2 mmol/L 的FeSO4水溶液0.4 mL。其中一支EP 管作空白加超純水0.1 mL，其余6 支分別加入10、30、50、70、90、110 mmol/L 的維生素C 水溶液0.1 mL；最后再分別加入1.5%H2O2水溶液0.1 mL。混勻，室溫下反應(yīng)45 min[6]，于λex300 nm、λem408 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各管的熒光強(qiáng)度F，并計(jì)算不同樣品對(duì)·OH 的清除率[7]。清除率I(%)的計(jì)算公式：I=(F0-Fx)/F0×100。式中：F0為空白對(duì)照樣品熒光強(qiáng)度測(cè)量值；Fx為加入待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度測(cè)量值。根據(jù)濃度與清除率的變化，計(jì)算出維生素C 清除羥自由基的IC50值。

2.2 紫外可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定羥自由基

利用·OH 能選擇性攻擊水楊酸（SA）產(chǎn)生二羥基苯甲酸，由于酚羥基與Fe3+顯色反應(yīng)生成紫紅色配合物，用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定530 nm 處吸光值可反映體系中·OH 濃度，加入·OH 清除劑會(huì)使水楊酸-Fe2+-H2O2溶液吸光度降低[8]。

2.2.1 配制溶液

準(zhǔn)確稱(chēng)取13.9 mg FeSO4·7H2O 溶于10 mL 超純水中，得到5 mmol/L 的FeSO4水溶液，準(zhǔn)確稱(chēng)取8.1 mg FeCl3溶于10 mL 超純水中，得5 mmol/L 的FeCl3水溶液，市售濃度30% H2O2稀釋300 倍得0.1%的H2O2溶液，準(zhǔn)確稱(chēng)取13.8 mg 水楊酸，溶于10 mL 乙醇溶液中得5 mmol/L 的水楊酸乙醇溶液，將節(jié)2.1.1 中所得200 mmol/L 的維生素C 水溶液稀釋40 倍，得到濃度為5 mmol/L 的維生素C 水溶液。

2.2.2 水楊酸與不同試劑的光譜掃描

取6 只25 mL 容量瓶，每只容量瓶中加入3 mL 5 mmol/L 的水楊酸乙醇溶液，6 只容量瓶分別加入FeSO4水溶液、FeCl3水溶液、0.1%H2O2溶液、5 mmol/L的維生素C 水溶液，1 mL 的5 mmol/L 的FeSO4水溶液和0.1%的H2O2溶液、超純水各1 mL，最后加超純水定容到25 mL 并搖勻，20 min 后對(duì)上述6 種溶液進(jìn)行光譜掃描[9]，保存數(shù)據(jù)。

2.2.3 測(cè)定不同濃度維生素C 清除·OH 的能力

取8 只25 mL 容量瓶，每只加入3 mL 的5 mmol/L的水楊酸乙醇溶液和1 mL 5 mmol/L 的FeSO4水溶液；其中1 只作為未損傷組加超純水定容至25 mL，1 只作為損傷組加1 mL 0.1%的H2O2溶液后加水定容至25 mL，其余6 只分別加入1、2、3、4、5、6 mL 的5 mmol/L 的維生素C 水溶液，然后每只加入1 mL 0.1%的H2O2溶液后定容到25 mL，搖勻。室溫反應(yīng)20 min，測(cè)定530 nm 波長(zhǎng)處的吸光度A，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計(jì)算不同組樣品對(duì)·OH 的清除率[9-10]。清除率I(%)的計(jì)算公式：I=(Ae-Ax)/(Ae-A0)×100%。式中：A0為未損傷組吸光度的測(cè)量值，Ae為損傷組的吸光度測(cè) 量值，Ax為加入待測(cè)樣品的吸光度測(cè)量值；根據(jù)濃度與清除率的變化，計(jì)算出維生素C 清除羥自由基的IC50值。

2.3 電子順磁共振波譜法測(cè)定羥自由基

1945 年發(fā)展起來(lái)的電子順磁共振技術(shù)，為自由基的檢測(cè)開(kāi)辟了新的途徑。其原理是利用自旋捕捉劑與不穩(wěn)定的自由基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生另外一種穩(wěn)定的，可以用電子自旋共振波譜法檢測(cè)的新自由基（自旋加合物）。DMPO（5,5-Dimethyl-1-pyrroline N-Oxide，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物）作為自旋捕捉劑捕捉·OH，生成穩(wěn)定形態(tài)的DMPO-OH，可進(jìn)行ESR 分析，其特征圖譜為1∶2∶2∶1[11]。其反應(yīng)式為：Fe2++H2O2→ Fe3++OH－+·OH，DMPO+·OH → DMPO-OH。

2.3.1 配制溶液

準(zhǔn)確稱(chēng)取13.9 mg 的FeSO4·7H2O 溶于5 mL 超純水中，得到10 mmol/L 的FeSO4溶液；將市售濃度30% H2O2稀釋30 倍，得濃度1%的H2O2溶液；準(zhǔn)確稱(chēng)取250 mg 的DMPO，加入22 mL 水溶解得到濃度為100 mmol/L 的DMPO 水溶液。將節(jié)2.1.1 中得到200 mmol/L 的維生素 C 水溶液稀釋 4 倍得到50 mmol/L 的維生素C 水溶液。用超純水稀釋至9.6、8.0、6.4、4.8、3.2、1.6 mmol/L。

2.3.2 測(cè)定不同濃度維生素C 清除·OH 的能力

測(cè)定對(duì)照樣品以扣除試劑本身對(duì)自由基的影響，將10 mmol/L 的FeSO4·7H2O 溶液、超純水、100 mmol/L的DMPO 水溶液，1%的H2O2溶液各取5 μL 按順序加入EP 管中，渦旋混勻后利用虹吸原理吸入石英毛細(xì)管中，放入樣品保護(hù)測(cè)試管，記錄反應(yīng)時(shí)間保持測(cè)試液在反應(yīng)1.5 min 時(shí)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)樣品時(shí)用樣品溶液代替超純水，其余操作同上。每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，測(cè)量后取平均值。測(cè)試參數(shù)為Center filed:336mT,Sweep width:7.5×1,Sweep time:30.0s,Mod width:0.35 ×1,Amplitude:2.00 ×100,Power:1 mW；自由基清除率I(%)的計(jì)算公式：I=(h0-hx)/h0×100%；式中：h0為對(duì)照樣品中ESR 譜信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量值；hx為樣品中ESR 譜信號(hào)強(qiáng)度測(cè)量值[12]。I值越大，表明樣品清除自由基能力越強(qiáng)。根據(jù)濃度與清除率的變化，計(jì)算出維生素C 清除羥自由基的IC50值[12]。

3 結(jié)果及討論

3.1 熒光分光光度法測(cè)定維生素C 清除羥自由基的結(jié)果

熒光分光光度法測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)表1），維生素C 與空白對(duì)照相比表現(xiàn)出明顯的清除·OH 的活性。不同濃度維生素C 清除羥自由基曲線如圖1 所示，隨著維生素C 濃度的增加，其清除能力也逐漸增加。在3.55 mmol/L 濃度時(shí)，測(cè)到的信號(hào)熒光強(qiáng)度接近基線，顯示了較強(qiáng)的清除能力，計(jì)算熒光分光光度法測(cè)定維生素 C 清除羥自由基半數(shù)清除率 IC50為0.965 7 mmol/L。

苯甲酸-Fenton 體系熒光分光光度法法利用Fenton 體系產(chǎn)生·OH，與熒光很弱的苯甲酸反應(yīng)，生成具有強(qiáng)熒光的二羥基苯甲酸。該方法測(cè)量簡(jiǎn)單、方便、準(zhǔn)確，但是影響熒光強(qiáng)度的因素較多，包括環(huán)境溫度、酸度、溶劑、光照等。另外羥自由基壽命很短，在溶液中大約只能存在微秒級(jí)，且濃度很低，因此在室溫下需要有足夠反應(yīng)時(shí)間，才能不斷產(chǎn)生羥自由基與苯甲酸反應(yīng)。該方法有文獻(xiàn)報(bào)道45 min 后熒光強(qiáng)度達(dá)到最大并且最穩(wěn)定[13]。由于溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率和熒光強(qiáng)度會(huì)隨著溫度的升高而降低，因此要注意實(shí)驗(yàn)過(guò)程中環(huán)境溫度的影響。

表1 熒光法測(cè)定不同濃度維生素C 清除·OH 的熒光強(qiáng)度及清除率

圖1 熒光分光光度法測(cè)定不同濃度 維生素C 清除·OH 曲線

3.2 紫外可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定維生素C 清除羥自由基的結(jié)果

對(duì)水楊酸、水楊酸-Fe2+、水楊酸-Fe3+、水楊酸-H2O2、水楊酸-維生素C、水楊酸-Fe2+-H2O2溶液進(jìn)行紫外可見(jiàn)光光譜掃描，發(fā)現(xiàn)其中水楊酸、水楊酸-Fe2+、水楊酸-H2O2、水楊酸-維生素C 的紫外可見(jiàn)光吸收光譜基本相同，但從圖2 可以看出，水楊酸-Fe2+、水楊酸-Fe3+、水楊酸-Fe2+-H2O2的紫外吸收光譜存在一定差異，各組差異吸光度值見(jiàn)表2。水楊酸-Fe3+、水楊酸-Fe2+-H2O2溶液為紫紅色，最大吸收波長(zhǎng)為530 nm，二者吸收曲線相同；水楊酸-Fe2+在530 nm 波長(zhǎng)處沒(méi)有最大吸收，但加入H2O2后在530 nm 處則會(huì)產(chǎn)生明顯吸收；水楊酸、水楊酸-H2O2、水楊酸-維生素C 在530 nm 波長(zhǎng)處均未發(fā)現(xiàn)吸收。

紫外分光光度法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：維生素C 表現(xiàn)出明顯的清除·OH 的活性（見(jiàn)表3）。隨著維生素C 濃度的增加，清除能力也逐漸增加。計(jì)算水楊酸-紫外分光光度法測(cè)定維生素C 清除羥自由基半數(shù)清除率IC50為0.810 8 mmol/L。

圖2 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)掃描的吸收曲線

表2 紫外可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定各組 樣品在530 nm 處的吸光度

表3 紫外可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定不同組別 在530 nm 處的吸光度值及清除率

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，水楊酸-紫外可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定羥自由基具有測(cè)量簡(jiǎn)單、便捷、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。但是，因?yàn)榉磻?yīng)過(guò)程相對(duì)比較復(fù)雜，水楊酸與羥自由基反應(yīng)可生成2,3-二羥基苯甲酸或2,5-二羥基苯甲酸，有很多的中間產(chǎn)物與支線產(chǎn)物。此外羥自由基的壽命很短，特別是濃度很低的時(shí)候，因此需要提供足夠的反應(yīng)時(shí)間，使不斷產(chǎn)生的羥自由基與水楊酸反應(yīng)，直到產(chǎn)生足夠?qū)嶒?yàn)檢測(cè)的二羥基苯甲酸。因此水楊酸-紫外分光光度法測(cè)定羥自由基所需要的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。此外，由于此方法測(cè)量的基本原理是基于酚羥基與Fe3+顯色反應(yīng)生產(chǎn)的紫紅色物質(zhì)，一旦測(cè)試實(shí)驗(yàn)中存在還原性很強(qiáng)的物質(zhì)，就會(huì)導(dǎo)致Fe3+被還原，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性[14]。

3.3 電子順磁共振波譜法測(cè)定維生素C 清除羥自由基的結(jié)果

電子順磁共振波譜法實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表4）表明：與空白對(duì)照相比，維生素C 表現(xiàn)出明顯的清除·OH 的活性，不同濃度維生素C 清除·OH 信號(hào)見(jiàn)圖3?？梢悦黠@地看出隨著維生素C 濃度的增加，羥自由基加合物的信號(hào)也明顯減弱，表明其清除能力也逐漸增加。依據(jù)清除率計(jì)算電子順磁共振波譜法測(cè)定維生素C 清除羥自由基半數(shù)清除率IC50為0.738 1 mmol/L。

表4 順磁法測(cè)定維生素C 清除·OH 自由結(jié)果

圖3 不同濃度維生素C 清除羥自由基的ESR 圖譜

由電子順磁共振波譜法實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，運(yùn)用自由基捕集劑（DMPO-ESR）技術(shù)測(cè)定羥基自由基的簡(jiǎn)單快速有效，DMPO 作自由基捕獲劑與羥基自由基產(chǎn)生的自旋加合物的ESR 譜表現(xiàn)出1∶2∶2∶1 的特征譜線，可以提供自由基結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息。該方法既可以用來(lái)定量檢測(cè)也可以用作定性檢測(cè)。但是它的儀器成本較高，還有一個(gè)因素就是大多自旋加合物都不能穩(wěn)定存在，有的可能只能穩(wěn)定存在幾分鐘或幾十分鐘[15]，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡快進(jìn)行測(cè)試，并精準(zhǔn)控制測(cè)試的時(shí)間，以保證實(shí)驗(yàn)的平行性。目前的研究領(lǐng)域主要在醫(yī)療、病理和藥理實(shí)驗(yàn)等研究方面[16]。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)采用3 種不同的檢測(cè)方法檢測(cè)Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基，發(fā)現(xiàn)3 種測(cè)定方法均能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)羥自由基存在。其中熒光法、紫外可見(jiàn)光分光光度法測(cè)定羥自由基其中涉及多步反應(yīng)屬于間接法檢測(cè)羥自由基，方法簡(jiǎn)便、易操作，不涉及大型貴重儀器，適用于定量檢測(cè)中低濃度的羥自由基的研究。由于這2種方法均涉及反應(yīng)時(shí)間問(wèn)題，所以所需要的檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。自旋捕捉-電子自旋共振技術(shù)能夠直接捕捉住目標(biāo)羥基自由基，簡(jiǎn)單易行。電子自旋共振法與熒光法、紫外分光光度法方法相比，具有靈敏度高、反應(yīng)快速等優(yōu)點(diǎn)，而且該方法可以提供自由基結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息，也可以用作定性檢測(cè)。另外該方法對(duì)樣品的狀態(tài)基本沒(méi)有要求（固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)均可）。儀器比較昂貴，普遍性不高是該方法的主要缺點(diǎn)。相信隨著自由基研究領(lǐng)域以及科技的不斷發(fā)展，會(huì)有越來(lái)越多的先進(jìn)且便捷廉價(jià)的檢測(cè)羥自由基的方法來(lái)完善這一檢測(cè)技術(shù)。