劉振平，姜 容，龐鈳靖

(重慶安全技術(shù)職業(yè)學(xué)院，重慶 404020)

1 引 言

四環(huán)素類抗生素(Tetracyclines，TCs)對(duì)革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌、支原體、衣原體、立克次體和原蟲具有廣譜、高效的抗菌活性[1-3]。四環(huán)素類抗生素已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療，同時(shí)也有被用作生長促進(jìn)劑的報(bào)道[4]。隨著集約養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，細(xì)菌病害的頻繁爆發(fā)給人類造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，TCs可有效控制這些病害[1]。但是，TCs會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生肝損傷、牙齒變黃和腸道菌群紊亂等副作用，日常的攝入還會(huì)增加微生物的耐藥性[5]。另外，在低濃度時(shí)，TCs可能會(huì)引起敏感個(gè)體的過敏反應(yīng)[6]。因此，建立動(dòng)物食品中TCs殘留的檢測(cè)方法對(duì)于保障食品安全具有重要意義。

近年來，研究人員開發(fā)了很多TCs及其類似物殘留的檢測(cè)方法，比如利用紫外高效液相色譜法、二極管陣列、熒光法、質(zhì)譜分析法等對(duì)動(dòng)物的肝、腎、脂肪、蛋、血漿和魚、蝦等進(jìn)行TCs殘留定量分析[7-16]。這些方法雖然靈敏但存在成本高、操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長、所用試劑有毒等問題，限制了實(shí)際應(yīng)用。以熒光信號(hào)為基礎(chǔ)的熒光檢測(cè)方法已被證明是快速檢測(cè)目標(biāo)的有效和可行的方法[17-20]?；诹孔狱c(diǎn)(Quantum dots，QDs)的熒光或室溫磷光信號(hào)用于探針研究引起了廣泛關(guān)注[21]。與傳統(tǒng)有機(jī)染料相比，量子點(diǎn)具有激發(fā)光譜寬、連續(xù)、發(fā)光效率高、光化學(xué)穩(wěn)定性高、光譜窄對(duì)稱、顏色可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)[22]，因此，也被廣泛應(yīng)用于微生物、生物大分子、無機(jī)分子和金屬離子的定量檢測(cè)[23-27]。另外，由于壽命和發(fā)射波長較長，量子點(diǎn)的磷光特性在一定程度上優(yōu)于熒光，可避免目標(biāo)物自熒光發(fā)射和熒光散射光的干擾[28]。

內(nèi)濾效應(yīng)(Inner-filter effect，IFE)是目標(biāo)物的吸收光譜與熒光或磷光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射光譜重疊時(shí)，當(dāng)有目標(biāo)物存在的情況下，激發(fā)或發(fā)射光被部分吸收而導(dǎo)致熒光或磷光猝滅的現(xiàn)象[29]。本研究利用TCs對(duì)錳摻雜硫化鋅量子點(diǎn)(Mn∶ZnS QDs)室溫磷光產(chǎn)生的內(nèi)濾效應(yīng)，以強(qiáng)力霉素(Doxycycline，DTC)為代表，建立了簡便、高效、低成本探針體系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蜂蜜中TCs殘留的定量檢測(cè)。

2 材料與方法

2.1 試劑

強(qiáng)力霉素，重慶葆光生物技術(shù)有限公司;Zn-SO4、NaOH、C2H5OH、MnCl2、Na2S·9H2O，成都市科龍化工試劑廠;L-半胱氨酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DTC陰性蜂蜜樣品，重慶蜂谷美地生態(tài)養(yǎng)蜂有限公司。

2.2 儀器與設(shè)備

TU-1901紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;LS-55發(fā)光分光光度計(jì)，美國Perkin Elmer公司;KQ-700DB超聲設(shè)備，昆山市超聲儀器有限公司;pH-S20K pH計(jì)，瑞士Mettler Toledo公司;Tecnai F20透射電子顯微鏡，美國FEI公司;FLS920熒光壽命光譜儀，英國Edinburgh公司(Edinburgh analytical instrument FLS920 fluorescence spectrometer);Bruker vetex70傅里葉紅外光譜儀，德國 Bruker公司;Zeta Sizer Nano ZS90粒徑及Zeta電位分析儀，英國Malvern公司;超純水系統(tǒng)，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 原理

基于內(nèi)濾效應(yīng)的Mn∶ZnS QDs磷光探針對(duì)DTC的高靈敏檢測(cè)原理如圖1所示。L-半胱氨酸修飾的Mn∶ZnS QDs在289 nm波長的激發(fā)光作用下，在583 nm處發(fā)射磷光，目標(biāo)物DTC的紫外吸收光譜與Mn∶ZnS QDs的磷光激發(fā)光譜存在較大程度重疊，因此，當(dāng)Mn∶ZnS QDs體系中存在DTC時(shí)，部分激發(fā)光被DTC吸收，導(dǎo)致Mn∶ZnS QDs磷光發(fā)射強(qiáng)度降低，進(jìn)而建立DTC濃度與磷光信號(hào)的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)DTC的快速定量檢測(cè)。

2.3.2 Mn∶ZnS QDs的合成

為增加Mn∶ZnS QDs的水溶性，以L-半胱氨酸作為穩(wěn)定劑，合成方法在參考文獻(xiàn)[30]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了部分優(yōu)化:50 mL 0.03 mol·L-1-半胱氨酸與5 mL 0.1 mol·L-1ZnSO4混合于三口燒瓶中，用2 mol·L-1NaOH溶液將混合溶液pH調(diào)整為11，通氮?dú)馐覝財(cái)嚢? h后，隔絕空氣注射1.4 mL 0.01 mol·L-1MnCl2繼續(xù)攪拌30 min，5 mL 0.1 mol·L-1Na2S 快速注入溶液中繼續(xù)攪拌30 min后，放入50℃水浴中在空氣中陳化3.5 h。用等體積的無水乙醇離心分離(10 000 r/min，20 min)，乙醇洗滌兩次后沉淀物真空干燥即得L-半胱氨酸作為穩(wěn)定劑的Mn∶ZnS QDs粉末，備用。

圖1 基于內(nèi)濾效應(yīng)的Mn∶ZnS QDs磷光探針檢測(cè)強(qiáng)力霉素原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of DTC detected principle for Mn∶ZnS QDs phosphorescence probe based on IFE

2.3.3 試驗(yàn)條件優(yōu)化

Mn∶ZnS QDs濃度的選擇:根據(jù) LS-55分光光度計(jì)的量程和Mn∶ZnS QDs磷光強(qiáng)度，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定最終體系中Mn∶ZnS QDs濃度為0.1 mg·mL-1。

探針體系 pH的確定:根據(jù) pH對(duì) Mn∶ZnS QDs磷光強(qiáng)度的影響，選擇磷光最強(qiáng)時(shí)的pH作為體系最終pH。

2.3.4 DTC檢測(cè)

精確稱取一定量的Mn∶ZnS QDs粉末超聲分散在pH=9的PBS中，配制成0.3 mg·mL-1Mn∶ZnS QDs溶液，取1 mL上述溶液，加入不同濃度的DTC溶液后用pH=9的PBS稀釋至3.0 mL，分別配制成含有 DTC 0.05，0.25，1，2.5，5，10，25，50，100，150 μmol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將 L-55型分光光度計(jì)設(shè)置為磷光模式，在289 nm激發(fā)波長下測(cè)量583 nm處的磷光強(qiáng)度。

2.3.5 選擇性試驗(yàn)

按照2.3.4的方法分別測(cè)定最終濃度為25 μmol·L-1的四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素、克林霉素和呋喃西林溶液，重復(fù)3次，結(jié)果與空白對(duì)比。

2.3.6 實(shí)際樣品處理

本研究以蜂蜜為檢測(cè)對(duì)象來測(cè)試基于Mn∶ZnS QDs磷光探針對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)的實(shí)用性。DTC與較多金屬離子如Cu2+、Al3+、Mg2+等有較強(qiáng)的螯合作用，為避免金屬離子的干擾，本研究參考已報(bào)道的檢測(cè)蜂蜜中四環(huán)素的樣品前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行處理[31-32]。具體步驟為:5 g蜂蜜樣品加入一定量的DTC標(biāo)準(zhǔn)溶液后與20 mL McIL-vaine-Na2EDTA緩沖溶液(M-E，檸檬酸12.93 g，37.33 g Na2EDTA，22.38 g Na2HPO4·12H2O 配成1 L溶液，pH=4.0)混合，加入5 mL 5%的三氯乙酸，旋渦混合5 min，超聲5 min，4℃ 下4 000 r/min離心20 min，取上清液用pH=4的NaOH調(diào)節(jié)pH=9，避光4℃儲(chǔ)存，使用前用5倍10 mmol·L-1Tris-HCl(pH=9)稀釋，配制成含DTC最終濃度分別為 0.5，5，20，60，120 μmol·L-1的蜂蜜樣品。

2.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Office Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理，采用OriginPro 8.5作圖和線性分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 Mn∶ZnS QDs的表征

分別通過透射電鏡、傅立葉變換紅外光譜和磷光光譜對(duì)合成的以L-半胱氨酸為穩(wěn)定劑的Mn∶ZnS QDs進(jìn)行表征。如圖2所示為Mn∶ZnS QDs的透射電鏡圖像，經(jīng)過計(jì)算其平均粒徑為3.8 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[33]。在L-半胱氨酸修飾的Mn∶ZnS QDs紅外光譜圖(圖3)中可以看出，3 468 cm-1處為羧基中羥基的伸縮振動(dòng)峰，3 331 cm-1和3 269 cm-1處是氨基的特征吸收峰，1 602 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰為N―C伸縮振動(dòng)峰，1 128 cm-1處的強(qiáng)吸收峰由羧基中的羰基產(chǎn)生，但是2 600 cm-1處的巰基振動(dòng)峰消失了，這是由于巰基在內(nèi)部與量子點(diǎn)結(jié)合的緣故[34]。上述結(jié)果表明，L-半胱氨酸已鍵合在Mn∶ZnS QDs表面。從 Mn∶ZnS QDs的磷光光譜圖(圖4)中可以看出，在289 nm的激發(fā)光作用下，Mn∶ZnS QDs在583 nm處發(fā)出較強(qiáng)的磷光。

圖2 Mn∶ZnS QDs透射電鏡圖像，嵌圖為粒徑分布圖。Fig.2 TEM image of Mn∶ZnS QDs，the illustration is a particle size distribution.

圖3 L-半胱氨酸修飾的Mn∶ZnS QDs紅外光譜Fig.3 FT-IR spectra of Mn∶ZnS QDs modificated by L-cysteine

圖4 L-半胱氨酸修飾的Mn∶ZnS QDs磷光光譜Fig.4 Excitation and emission phosphorescence spectra of Mn∶ZnS QDs

3.2 磷光猝滅機(jī)理分析

圖5 不同濃度DTC紫外吸收光譜Fig.5 Ultraviolet absorption spectra of different concentrations of DTC

圖6 Mn∶ZnS QDs磷光激發(fā)光譜和DTC紫外吸收光譜Fig.6 Excitation spectra of Mn∶ZnS QDs and DTC ultraviolet absorption spectra

如圖 5 所示，濃度分別為 8，12，25，50，75 μmol·L-1DTC的紫外吸收光譜，在289 nm處的吸光度隨濃度的增大而增強(qiáng)。從圖6可以看出，DTC的紫外吸收光譜和Mn∶ZnS QDs磷光激發(fā)光譜圖存在較大程度的重疊，同時(shí)根據(jù)朗伯比爾定律計(jì)算得到DTC在最大紫外吸收波長處的吸光系數(shù)為1.35×104。向Mn∶ZnS QDs體系溶液中加入一定濃度的DTC時(shí)，Mn∶ZnS QDs的磷光信號(hào)會(huì)出現(xiàn)一定程度的猝滅，且隨著DTC濃度的增大磷光信號(hào)猝滅程度也隨之增大(圖7)。一般地，磷光壽命可以代表物質(zhì)的激發(fā)態(tài)信息，因此確定磷光壽命對(duì)于研究能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移引起的磷光猝滅具有重要意義[33]。如圖8所示，對(duì)在最大激發(fā)波長下測(cè)試的磷光壽命曲線進(jìn)行擬合后得到Mn∶ZnS QDs中加入DTC前后的磷光壽命分別是2.399 ms和2.062 ms，未發(fā)生明顯變化，表明DTC對(duì)量子點(diǎn)的猝滅效應(yīng)不是基于Mn∶ZnS QDs和DTC之間的能量轉(zhuǎn)移。如圖9所示，左縱軸為25 μm DTC的紫外吸收光譜，右縱軸各點(diǎn)表示在對(duì)應(yīng)波長的光作為激發(fā)光時(shí) DTC(25 μmol·L-1)對(duì)Mn∶ZnS QDs磷光的猝滅程度，即P0-P(P0為猝滅前的磷光強(qiáng)度，P為體系存在DTC時(shí)的磷光強(qiáng)度)，猝滅效應(yīng)隨激發(fā)波長的變化而變化，在 DTC的最大紫外吸收波長處猝滅效果最強(qiáng)。另外，本研究還對(duì)Mn∶ZnS QDs、DTC及其混合物的Zeta電位進(jìn)行了測(cè)量，分別為-30.7，-28.3，-29.1 mV，說明 Mn∶ZnS QDs和 DTC 均帶負(fù)電不存在相互吸引的靜電作用。以上結(jié)果表明，DTC對(duì)Mn∶ZnS QDs磷光的猝滅機(jī)理是內(nèi)濾效應(yīng)。

圖7 Mn∶ZnS QDs磷光信號(hào)強(qiáng)度隨DTC濃度增大而降低Fig.7 Signal strength of Mn∶ZnS QDs decreases with the increase of the DTC concentration

圖8 Mn∶ZnS QDs和Mn∶ZnS QDs+DTC磷光壽命曲線Fig.8 Phosphorescence lifetime curve of Mn∶ZnS QDs solution and Mn∶ZnS QDs+DTC solution

圖9 Mn∶ZnS QDs(25 μmol·L-1DTC)磷光猝滅程度與DTC紫外吸收光譜的關(guān)系Fig.9 Comparison of absorbance of DTC and the excitation wavelength-dependent phosphorescence quenching of Mn∶ZnS QDs in the presence of 25 μmol·L-1DTC

3.3 探針體系pH優(yōu)化結(jié)果

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Mn∶ZnS QDs的磷光信號(hào)受pH影響較大，如圖10所示，Mn∶ZnS QDs在酸性條件下磷光強(qiáng)度低的原因可能與量子點(diǎn)和穩(wěn)定劑的解離有關(guān);隨著pH逐漸增大穩(wěn)定劑與量子點(diǎn)的共價(jià)鍵作用逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)為磷光強(qiáng)度不斷增大，且在pH=9～11范圍內(nèi)具有較強(qiáng)磷光信號(hào)且相對(duì)穩(wěn)定。同時(shí)測(cè)試了DTC穩(wěn)定性受pH的影響，隨著pH逐漸增大，DTC的紫外吸光度無顯著變化。綜合以上結(jié)果，本研究選擇9作為體系的pH值。

圖10 pH對(duì)Mn∶ZnS QDs磷光強(qiáng)度和DTC紫外吸光度的影響Fig.10 Effect of pH on phosphorescence intensity of Mn∶ZnS QDs and UV absorbance of DTC

3.4 DTC的定量檢測(cè)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，本研究建立磷光探針對(duì) DTC 濃度梯度為 0.05，0.25，2.5，25，50，100，150 μmol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了測(cè)定。如圖11所示，隨著DTC濃度的不斷增大，Mn∶ZnS QDs磷光信號(hào)不斷減弱。DTC 在0.05～150 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)與Mn∶ZnS QDs磷光猝滅前后比值的自然對(duì)數(shù)[ln(P0/P)]呈良好的線性關(guān)系，線性方程為lnP0/P=0.01758C(DTC)+0.01351，相關(guān)系數(shù) R2=0.999，檢出限為 0.009 7 μmol·L-1(信噪比為3(S/N=3))。該磷光探針與其他文獻(xiàn)報(bào)道的DTC檢測(cè)法相比，有較低的檢測(cè)限和較寬的檢測(cè)范圍(見表1)。此外，將制備好的Mn∶ZnS QDs磷光探針體系置于4℃ 條件下避光保存，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，每隔一天對(duì)濃度為25 μmol·L-1的DTC進(jìn)行檢測(cè)，用來檢驗(yàn)該探針的穩(wěn)定性。在25 μmol·L-1的DTC條件下，紫外吸收測(cè)定結(jié)果的日內(nèi)精密度為3.34%，日間精密度為4.15%。上述結(jié)果表明，放置一段時(shí)間的探針體系檢測(cè)效果與制備初期檢測(cè)效果差異不大，具有良好的穩(wěn)定性(7 d)。

圖11 不同DTC濃度對(duì)Mn∶ZnS QDs磷光強(qiáng)度的影響Fig.11 Effect of DTC concentration on phosphorescence intensity of Mn∶ZnS QDs

表1 本研究磷光探針與其他方法比較Tab.1 Comparison with other detection methods

3.5 選擇性試驗(yàn)

圖12 磷光探針選擇性分析Fig.12 Selectivity analysis of phosphorescence probe

為驗(yàn)證本研究磷光探針的選擇性，排除實(shí)際樣品檢測(cè)中可能遇到的其他族類或結(jié)構(gòu)類似抗生素的干擾，分別加入25 μmol·L-1的四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素、克林霉素和呋喃西林進(jìn)行磷光信號(hào)測(cè)定，結(jié)果如圖12所示。與空白對(duì)照，當(dāng)檢測(cè)體系中存在25 μmol·L-1DTC或四環(huán)素時(shí)，磷光信號(hào)明顯降低，但是當(dāng)檢測(cè)體系中的DTC或四環(huán)素由其他抗生素替代時(shí)，磷光信號(hào)無明顯變化。

3.6 蜂蜜樣品檢測(cè)結(jié)果

取適量DTC陰性蜂蜜樣品，按照2.3.6方法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，以實(shí)際測(cè)得的DTC濃度與添加的DTC濃度的比值來計(jì)算加標(biāo)回收率，所得加標(biāo)回收率為92.4%～110%，RSD均小于4.15%(n=3)。結(jié)果表明，該磷光探針準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際蜂蜜樣品中DTC含量的測(cè)定(見表2)。

表2 蜂蜜樣品中DTC的檢測(cè)Tab.2 Detection for DTC in honey samples

4 結(jié) 論

本研究以TCs對(duì)Mn∶ZnS QDs磷光的內(nèi)濾效應(yīng)為基礎(chǔ)，以DTC為代表構(gòu)建了用于檢測(cè)蜂蜜中TCs殘留的磷光探針，所需設(shè)備簡單，操作簡便，成本低，效率高，在pH=9的PBS溶液中簡單地將Mn∶ZnS QDs目標(biāo)物混合在一起，就可以得到檢測(cè)結(jié)果，并且具有較高靈敏性。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，DTC 在 0.05 ～150 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)與Mn∶ZnS QDs磷光猝滅前后比值的自然對(duì)數(shù)[ln(P0/P)]呈良好的線性關(guān)系，線性方程為lnP0/P=0.01758C(DTC)+0.01351，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，檢出限為 0.009 7 μmol·L-1。同時(shí)，對(duì)實(shí)際樣品蜂蜜做了加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，回收率為92.4%～110%。由于DTC與四環(huán)素同屬于四環(huán)素類抗生素，它們具有相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，通過對(duì)四環(huán)素、土霉素和金霉素的紫外吸收光譜的掃描發(fā)現(xiàn)四種四環(huán)素類抗生素具有相似的紫外吸收光譜和吸光系數(shù)，因此，可對(duì)本研究建立的磷光探針在蜂蜜中四環(huán)素類抗生素殘留總量的定量分析做進(jìn)一步研究。另外，從本研究基于內(nèi)濾效應(yīng)的磷光猝滅機(jī)理分析可以看出，如果被測(cè)樣品溶液中含有在225～325 nm具有較強(qiáng)的紫外光吸收物質(zhì)時(shí)，即可對(duì)本磷光探針產(chǎn)生干擾，因此該探針在直接用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的測(cè)定時(shí)存在一定局限性。但是，根據(jù)被測(cè)樣品的特點(diǎn)，結(jié)合相應(yīng)分離技術(shù)，也可實(shí)現(xiàn)除蜂蜜外的其他動(dòng)物性食品和環(huán)境分析中強(qiáng)力霉素殘留的快速高靈敏檢測(cè)。