張晨霞，王國成，王超，李清，劉順航，畢開順，*

（1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧沈陽110016；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津300410；3.云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司，云南普洱665000）

普洱茶[Camellia sinensis（Linn）var.assamica（Mast.）Kitamura]是我國云南省特有的歷史名茶，也是典型的地理標(biāo)志產(chǎn)品[1]。普洱茶是以地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種曬青毛茶為原料加工制成，具有獨(dú)特品質(zhì)特征的茶葉。按其加工工藝及品質(zhì)特征，普洱茶可分為普洱生茶和普洱熟茶[2-3]。

普洱生茶是以曬青茶經(jīng)蒸壓成型、干燥、包裝等工藝加工而成，可以直接飲用，又可以通過貯藏過程中自然發(fā)酵轉(zhuǎn)化為普洱陳茶，貯藏過程對普洱生茶影響較大，研究表明貯藏時間越長，茶品質(zhì)越好，尤其是對普洱生茶品質(zhì)中的香氣成分影響最為顯著[4-5]。而不經(jīng)貯藏的普洱生茶與普洱曬青茶品質(zhì)相似，其主要香氣成分為醇類、碳?xì)漕惡屯惢衔颷6]。同時，有研究指出，普洱茶的主要香氣成分會因產(chǎn)地、同一產(chǎn)地不同產(chǎn)茶區(qū)而存在很大的差異[7-8]。目前，不同地區(qū)普洱茶差異性研究較多，同一地區(qū)不同產(chǎn)茶區(qū)普洱茶香氣成分的差異性的相關(guān)報道較少，值得進(jìn)一步的研究。

固相微萃取 （headspace solid-phase microextraction，SPME）技術(shù)是一種新型的無溶劑樣品預(yù)處理技術(shù)，該技術(shù)集取樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣為一體，具有操作簡單、樣品量少、無溶劑、萃取樣品后可直接與氣相色譜（gas chromatography，GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 聯(lián)用進(jìn)行進(jìn)樣分析等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。目前，SPME 技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品[11-13]、藥品[14]、環(huán)境[15]等領(lǐng)域樣品的分析。本研究采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合 GC-MS 對普洱市 5 個產(chǎn)茶區(qū)（思茅區(qū)、景東、景谷、景邁山、鎮(zhèn)沅）普洱生茶樣品進(jìn)行香氣成分的分析和比較，揭示不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶香氣成分的差異，以期為普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶的產(chǎn)區(qū)判別和香氣品質(zhì)的提升提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樣品：思茅區(qū)（SM）7 個、景東產(chǎn)茶區(qū)（JD）8 個、景邁山產(chǎn)茶區(qū)（JM）12 個、景谷產(chǎn)茶區(qū)（JG）8 個、鎮(zhèn)沅產(chǎn)茶區(qū)（ZY）7 個：2010～2012 年制作普洱生茶，云南天士力帝泊洱生物茶集團(tuán)有限公司提供，茶葉樣品使用前經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，并通過2.0 mm 圓孔篩；氯化鈉（分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠，使用前 120 ℃烘 2 h；C8～C32正構(gòu)烷烴混標(biāo)（500 mg/L，溶于氯仿中）：美國AccuS－tandard 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace1300-ISQ 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermo Fisher Scientific 公司；HP-5MS 石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美國 Agilent 公司；65 μm PDMS/DVB 萃取頭、固相微萃取裝置、手動進(jìn)樣手柄：美國Supelco 公司；IT-09A 型恒溫磁力攪拌器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ME-T 分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取方法

稱取粉碎普洱生茶粉2.0 g 放置于20 mL 頂空瓶中，加入2.0 g NaCl，放入轉(zhuǎn)子，加入6 mL 煮沸超純水，立即采用聚四氟乙烯封口，將頂空瓶放置于磁力攪拌器上的水浴中，在（60±2）℃、300 r/min 條件下平衡10 min，然后將65 μm PDMS/DVB 萃取頭插入頂空瓶中，推出吸附頭，（60±2）℃恒溫下吸附 60 min，吸附結(jié)束后拔出萃取頭立即插入到氣相色譜（GC）進(jìn)樣口，250 ℃解吸附4.0 min，同時啟動GC-MS 進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.3.2 儀器條件

GC 條件：色譜柱為HP-5MS 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣方式為手動進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度 50 ℃，以 2 ℃/min 升溫至 130 ℃，保持 2 min，然后以10 ℃/min 升溫至280 ℃，保持3 min，總運(yùn)行時間為60 min；載氣：高純氦氣，純度≥99.999%；載氣流速0.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣模式為無分流進(jìn)樣。

MS 條件：離子源為EI 源，電子能量70 eV；接口溫度為280 ℃；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；發(fā)射電流為34.6 A；掃描方式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍：35 aum～350 aum；溶劑延遲時間：3 min。

1.3.3 保留指數(shù)測定

取C8～C32混標(biāo)稀釋液，將1.3.2 中進(jìn)樣方式改為自動進(jìn)樣、進(jìn)樣量 1 μL、分流比為 10 ∶1，其余條件不變，進(jìn)行正構(gòu)烷烴的分析。根據(jù)C8～C32每個烷烴的出峰時間和所要計算化合物的出峰時間，采用下式計算各揮發(fā)性組分的保留指數(shù)（retention index，RI）：

式中：tx、tn和tn+1分別為被分析組分和碳原子數(shù)處于 n、n+1 之間的烷烴（tn＜tx＜tn+1）流出峰保留時間，min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Trace1300-ISQGC-MS 自帶譜庫（NIST 11）檢索定性分析，同時將每種化合物計算所得保留指數(shù)與文獻(xiàn)已報道的采用相同色譜柱所得保留指數(shù)進(jìn)行對比，并綜合NIST 譜庫相似度、RI 一致度高的化學(xué)結(jié)構(gòu)為最優(yōu)鑒定結(jié)果，文獻(xiàn)查詢不到保留指數(shù)的化合物以NIST 數(shù)據(jù)庫相似度為判定標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果采用峰面積歸一法進(jìn)行定量，以各組分峰面積與色譜圖總峰面積之比值表示其相對含量。不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品中香氣成分差異采用Duncan's multiple range test 分析，分析采用SPSS 17.0 軟件；偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）采用SIMCA-P 12 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶香氣組成分析

采用 65 μm PDMS/DVB 結(jié)合 GC-MS 分別對普洱市5 個產(chǎn)茶區(qū)的普洱生茶香氣組分進(jìn)行分析，每個產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶代表性香氣成分總離子流圖如圖1 所示，香氣定性和定量結(jié)果如表1 所示。

圖1 不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶代表性香氣總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of representative arome of raw Pu-erh tea samples of different producing areas

表1 普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中香氣化合物Table 1 Aroma compounds in raw Pu-erh tea samples of different producing areas of Pu'er city

續(xù)表1 普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中香氣化合物Continue table 1 Aroma compounds in raw Pu-erh tea samples of different producing areas of Pu'er city

在普洱市5 個產(chǎn)茶區(qū)42 個普洱生茶樣品中共檢測出83 種物質(zhì)，其中醇類化合物23 種，碳?xì)漕惢衔?0 種，酯類化合物12 種，甲氧基苯類化合物8 種，酮類化合物8 種，酸類化合物4 種，酚類化合物3 種，醛類化合物3 種，含氮類化合物2 種。景東產(chǎn)茶區(qū)8 個普洱生茶樣品共檢測出74 種化合物，其中醇類化合物相對百分含量最高，達(dá)到了（52.109±4.126）%，其次相對百分含量較高的分別為酮類化合物（12.274±2.963）%、甲氧基苯類化合物（8.655±2.729）%、酯類化合物（8.580±1.910）%和碳?xì)漕惢衔铮?.725±2.898）%，含氮類化合物（2.358±1.149）%、醛類化合物（1.934±1.101）%、酚類化合物（1.202±0.844）%和酸類化合物（0.992±0.861）%相對百分含量較低；鎮(zhèn)沅產(chǎn)茶區(qū)7 個普洱生茶樣品共檢測出62 種化合物，其中醇類化合物相對百分含量最高，達(dá)到了（50.666±4.394）%，其次相對百分含量較高的分別為酮類化合物（15.013 ±1.883）%、碳?xì)漕惢衔铮?.499±3.869）%、酯類化合物（9.078 ± 1.564）%和甲氧基苯類化合 （5.463 ±1.163）%，含氮類化合物（2.351±0.417）%、醛類化合物（1.432±0.425）%、酚類化合物（1.257±0.663）%和酸類化合物（0.803±0.282）%相對百分含量較低；景邁山產(chǎn)茶區(qū)12 個普洱生茶樣品共檢測出68 種化合物，其中醇類化合物相對百分含量最高，達(dá)到了（53.509±4.683）%，其次相對百分含量較高的分別為酮類化合物（15.711±3.324）%、碳?xì)漕惢衔铮?0.038±3.098）%和酯類化合物（8.595±1.822）%，甲氧基苯類化合（2.995±1.483）%、含氮類化合物（1.855±0.673）%、醛類化合物（1.435±0.531）%、酚類化合物（1.297±0.574）%和酸類化合物（0.721±0.282）%相對百分含量較低；思茅區(qū)7 個普洱生茶樣品共檢測出63 種化合物，其中醇類化合物相對百分含量最高，達(dá)到了（54.776±10.854）%，其次相對百分含量較高的分別為酮類化合物（14.523±4.215）%、碳?xì)漕惢衔铮?.311±2.421）%、含氮類化合物（8.230±4.703）%和酯類化合物（5.163±1.278）%，醛類化合物（1.212±0.544）%、酚類化合物（0.946±0.648）%、甲氧基苯類化（0.652±0.641）%、酸類化合物（0.383±0.401）%相對百分含量較低；景谷產(chǎn)茶區(qū)8 個普洱生茶樣品共檢測出60 種化合物，其中醇類化合物相對百分含量最高，達(dá)到了（48.266±7.880）%，其次相對百分含量較高的分別為酮類化合物（21.937±4.666）%、碳?xì)漕惢衔铮?0.444±4.486）%、和酯類化合物（6.607±1.710）%，含氮類化合物（3.466±2.266）%、酚類化合物（1.847±0.523）%、醛類化合物（1.747±0.896）%、甲氧基苯類化（0.641±1.129）%、酸類化合物（0.078±0.151）%相對百分含量較低。

通過分析可見，普洱生茶的香氣組成中醇類、酮類、碳?xì)漕惡王ヮ惢衔锖烤^高，醇類化合物大多具備的花果香，其中一些醇類化合物還伴有木香（芳樟醇、芳樟醇氧化物、萜品醇、雪松醇等）對普洱生茶香氣具有較好的協(xié)調(diào)性[16]；酮類、酯類化合物大多也具備花果香，其中酮類化合物中β-紫羅蘭酮也伴有特殊的木香[17]；碳?xì)漕惢衔镏械娘柡蜔N對茶香氣貢獻(xiàn)較小，不飽和烴對茶香氣貢獻(xiàn)較大[18]；甲氧基苯類化合物是普洱生茶貯藏過程中自然陳化產(chǎn)生，是普洱茶陳香風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者[19-20]。

2.2 不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶香氣成分差異性分析

2.2.1 差異顯著性分析

為了考察不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶香氣成分的差異，試驗(yàn)采用Duncan’s multiple range test 進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析，結(jié)果如表1 所示，不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中醇類、碳?xì)漕惡腿╊惢衔锵鄬Π俜趾坎町惒伙@著（P＞0.05）；景東、鎮(zhèn)沅和景邁山3 個產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酯類化合物差異不顯著（P＞0.05），思茅區(qū)和景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酯類化合物差異也不顯著（P＞0.05），景東、鎮(zhèn)沅和景邁山產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酯類化合物與思茅區(qū)、景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酯類化合物差異顯著（P＜0.05）；景東、鎮(zhèn)沅、景邁山和思茅區(qū) 4 個產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酮類化合物差異不顯著（P＞0.05），均與景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酮類化合物存在顯著差異（P＜0.05）；景東、鎮(zhèn)沅、景邁山和思茅區(qū) 4 個產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酚類化合物差異不顯著（P＞0.05），景東、鎮(zhèn)沅、景邁山和景谷4 個產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酚類化合物差異不顯著（P＞0.05），思茅區(qū)和景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酚類化合物差異顯著（P＜0.05）；景東、鎮(zhèn)沅、景邁山和景谷4 個產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中含氮類化合物差異不顯著（P＞0.05），均與思茅區(qū)普洱生茶中含氮類化合物存在顯著差異（P＜0.05）；景東產(chǎn)茶區(qū)分別與思茅區(qū)、景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酸類化合物差異顯著（P＜0.05），鎮(zhèn)沅、景邁山與景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酸類化合物差異顯著（P＜0.05）；對于甲氧基苯類化合物，僅有思茅區(qū)和景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中的含量差異不顯著（P＞0.05），其余產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中含量之間差異均顯著（P＜0.05），甲氧基苯類化合物是普洱生茶貯藏過程中自然陳化產(chǎn)生，不同產(chǎn)茶區(qū)樣品之間差異顯著可能是因?yàn)樵掀渌M分差異所致。

2.2.2 PLS-DA 分析

以普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)的42 個普洱生茶中所檢測到的香氣成分相對百分含量為變量進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），建立PLS-DA 模型對普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品進(jìn)行區(qū)分和差異研究，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)42 個普洱生茶樣品PLS-DA 分析得分散點(diǎn)圖Fig.2 PLS-DA score scatter plot of 42 raw Pu-erh tea samples of different producing areas of Pu'er city

不同產(chǎn)茶區(qū)的普洱生茶樣品呈現(xiàn)明顯的分離趨勢，景邁山與鎮(zhèn)沅產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品差異性相對較小，與思茅區(qū)普洱生茶樣品差異較大。根據(jù)不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品離散度來看，思茅區(qū)和景東產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品間離散度較大，說明樣品間差異稍大，景邁山和鎮(zhèn)沅產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品間離散度相對較小，說明樣品間差異相對較小。為了進(jìn)一步探究對不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶區(qū)分起重要作用的香氣成分，試驗(yàn)采用42 個普洱生茶樣品中所檢測到的香氣成分進(jìn)行PLSDA 變量重要性因子（VIP）分布分析，VIP 值可以量化PLS-DA 分析中的每個變量對分類的貢獻(xiàn)度[21]，VIP 值越大，變量在不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶之間的差異越顯著，相應(yīng)結(jié)果見表2。

變量重要性因子分布分析結(jié)果顯示，共有33 種香氣成分對不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品區(qū)分起主要作用（VIP ＞ 1），其中 4-乙基-1，2-二甲氧基苯（VIP =1.962）、3，4-二甲氧基甲苯（VIP=1.954）、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯（VIP=1.873）、1，2，3-三甲氧基苯（VIP=1.691）、乙酸香葉酯（VIP=1.582）、香葉基丙酮（VIP=1.519）、咖啡堿（VIP = 1.499）、β-紫羅蘭酮（VIP =1.489）、Z-2-辛烯-1-醇（VIP = 1.458）、棕櫚酸甲酯（VIP=1.456）、1-辛烯-3-醇（VIP = 1.361）、二氫獼猴桃內(nèi)酯（VIP=1.358）、苯乙醇（VIP=1.357）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（VIP=1.314）、α-紫穗槐烯（VIP=1.313），起主要作用的主要為甲氧基苯類、酮類、酯類和醇類物質(zhì)，其中甲氧基苯類物質(zhì)對區(qū)分不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶貢獻(xiàn)度最大，這可能是因?yàn)椴煌a(chǎn)茶區(qū)茶葉原料差異導(dǎo)致普洱生茶儲藏過程中甲氧基苯類化合物生成物質(zhì)、生成量的不同，其主要機(jī)理有待于深入研究。

表2 變量重要性因子（VIP）值大于1.0 的香氣化合物Table 2 Aroma compound list with VIP value larger than 1.0

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME 結(jié)合GC-MS 分別對普洱市5 個產(chǎn)茶區(qū)的普洱生茶香氣組分進(jìn)行分析，42 個普洱生茶樣品中共檢測出83 種香氣成分，香氣組分以醇類化合物為主，其次為碳?xì)漕?、酯類、甲氧基苯類和酮類化合物。其中不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中醇類、碳?xì)漕惡腿╊惢衔锵鄬Π俜趾坎町惥伙@著（P＞0.05），甲氧基苯類化合物含量差異顯著性（P＜0.05）比例較大，酯類、酮類、酚類、酸類和含氮類化合物含量差異顯著性比例較小。以83 種香氣組分相對百分含量為變量進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），不同產(chǎn)茶區(qū)的普洱生茶樣品呈現(xiàn)明顯的分離趨勢，變量重要性因子（VIP）分析，33 種香氣成分對不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品區(qū)分起主要作用（VIP ＞1），33 種香氣成分中甲氧基苯類、酮類、酯類和醇類物質(zhì)占比最大。本研究可為普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶香氣差異及貯藏過程中香氣形成規(guī)律的深入研究提供理論支撐。