羅德艷，馮俊，彭濤，唐一萍

南充市中心醫(yī)院，四川南充 637000

喉癌是臨床常見頭頸部惡性腫瘤，其最主要病理學類型為喉鱗癌，占90%以上。喉鱗癌近年來發(fā)病率升高，但在醫(yī)療水平提升及新的高效抗癌藥物應用情況下患者整體預后未顯著改善，而腫瘤增殖、侵襲、轉移等生物學特性是其重要原因[1]。因此，探尋惡性腫瘤的治療靶點尤為必要。腫瘤壞死因子α誘導蛋白3(A20)是鋅指結構蛋白，可調節(jié)免疫應答、基因轉錄、細胞受體功能等。研究[2～4]表明，A20基因在乳腺癌、膽管癌、急性淋巴細胞白血病等惡性腫瘤中均存在相對異常高表達，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，沉默A20基因能夠抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲等生物學行為。但目前尚未明確A20基因在喉鱗癌中的生物學功能。2019年1～6月，本研究則應用RNA干擾技術，特異性沉默人喉鱗癌Hep-2細胞中A20基因表達，觀察A20基因對喉鱗癌Hep-2細胞增殖、周期、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、儀器及試劑 ①細胞：Hep-2細胞由華西醫(yī)學實驗中心惠贈。②主要儀器：熒光定量PCR儀(美國Stratagene)；電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、酶標儀(美國Bio-Rad)；倒置光學顯微鏡(日本Olympus)；紫外分光光度儀、CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)。③主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone)；Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑(美國Invitrogen)；胰蛋白酶(美國Sigma)；總RNA提取、逆轉錄試劑盒(北京艾德萊生物科技)；A20 siRNA及陰性對照siRNA(NC siRNA)(上海吉瑪制藥技術公司)；BCA蛋白測定試劑(北京賽馳生物科技公司)；A20多克隆抗體、β-actin單克隆抗體(美國sigma)；辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(美國Bioworld)；細胞蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術公司)；A20基因引物、內參引物(蘇州金唯智生物科技有限公司合成)；Transwell小室(美國Corning)。

1.2 Hep-2細胞培養(yǎng)、分組及轉染 Hep-2細胞采用RPMI1640培養(yǎng)基(含胎牛血清10%)在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)、傳代；取對數生長期Hep-2細胞，接種至6孔板，待細胞融合達80%～90%時進行分組，實驗共分為A20 siRNA組、NC siRNA組、對照組，A20 siRNA組、NC siRNA組應用Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑分別轉染A20 siRNA、NC siRNA，轉染操作嚴格按照試劑盒說明書操作，對照組不做任何處理。

1.3 Hep-2細胞A20 mRNA、蛋白檢測方法 ①A20 mRNA：采用熒光定量PCR法。收集轉染后48 h的3組細胞，提取細胞總RNA，紫外分光光度儀測定RNA含量，總RNA逆轉錄，合成cDNA；后行PCR擴增，以β-actin為內參。PCR反應條件：預變性94 ℃、10 min，變性94 ℃、30 s，退火60 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，40個循環(huán)。用2-ΔΔCt公式計算A20mRNA的相對表達量，實驗重復3次，取3次實驗的平均值。②A20蛋白：采用Western blotting法。收集轉染后48 h的3組細胞，分別提取細胞總蛋白，裂解細胞提取蛋白，BCA檢測蛋白，取20 μL總蛋白經SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜，封閉2 h，加一抗A20稀釋(工作濃度1∶300)，4 ℃孵育過夜。TTBS洗脫后，加二抗(工作1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h。增強化學發(fā)光顯色法實施條帶顯色，以β-actin蛋白為內參，實驗重復3次，取3次實驗的平均值。

1.4 Hep-2細胞增殖能力觀察方法 ①光密度值(OD值)：采用CCK8實驗。收集3組細胞，將細胞消化離心，以3 000個細胞/孔、200 μL/孔體積，將細胞接種在96孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。在轉染后24、48、72 h，各孔避光加入CCK8細胞增殖試劑10 μL。培養(yǎng)4 h后，酶標儀檢測OD值，實驗重復3次，取3次實驗的平均值。②克隆數：采用平板克隆形成實驗。將轉染48 h的3組細胞分別接種至6孔板(每孔200個)，每類細胞設置3個復孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周；后PBS洗滌、多聚甲醛4%固定20 min；吸除甲醛，結晶紫染色15 min，洗除染液，顯微鏡計數克隆數，實驗重復3次，取3次實驗的平均值。

1.5 Hep-2細胞周期觀察方法 采用流式細胞術。收集轉染48 h的3組細胞，PBS洗滌、離心，加75%預冷乙醇固定，4 ℃過夜；PBS洗滌，加碘化丙啶、RNase各50 μg/mL，避光4 ℃染色20 min。每樣本收集10 000個熒光信號，MuticycleAV軟件分析細胞周期，計算G0/G1期、S期、G2/M期細胞占總細胞的百分比，實驗重復3次，取3次實驗的平均值。

1.6 Hep-2細胞侵襲能力觀察方法 采用Transwell侵襲實驗。細胞轉染后48 h，采用無血清培養(yǎng)基分別對3組細胞進行培養(yǎng)12 h。胰酶消化，制備細胞懸液，調整細胞濃度為2×106個/mL；在Transwell小室上室中加不同的細胞懸液100 μL，每組均設3個復孔；下室中各孔加入600 μL含FBS 20%的RPMI1640培養(yǎng)基，孵育12 h。取出小室，吸除培養(yǎng)液，將未穿過ECMatrix膜的細胞除去，對小室染色，顯微鏡觀察，隨機選取5個高倍視野計數穿過ECMatrix膜的細胞數，實驗重復3次，取3次實驗的平均值。

2 結果

2.1 各組細胞A20 mRNA、蛋白表達比較 A20 mRNA、蛋白表達比較見表1。

表1 各組A20 mRNA、蛋白表達比較

注：與對照組比較，①P<0.05；與NC siRNA組比較，②P<0.05。

2.2 各組細胞OD值及克隆數比較 各組細胞不同時點OD值比較見表2。A20 siRNA組、NC siRNA組、對照組細胞克隆數分別為(123.58±15.69)、(229.65±31.58)、(231.65±32.47)個，A20 siRNA組與NC siRNA組、對照組比較，P均<0.05。

表2 各組細胞不同時點OD值比較

注：與對照組比較，①P<0.05；與NC siRNA組比較，②P<0.05。

2.3 各組細胞G0/G1期、S期、G2/M期比例比較 細胞G0/G1期、S期、G2/M期比例比較見表3。

表3 各組細胞G0/G1期、S期、G2/M期比例比較

注：與對照組比較，①P<0.05；與NC siRNA組比較，②P<0.05。

2.4 各組細胞穿膜細胞數比較 A20 siRNA組、NC siRNA和對照組穿膜細胞數分別為(31.25±4.82)、(84.00±9.95)、(86.35±10.02)個，A20 siRNA組與NC siRNA組、對照組比較，P均<0.05。

3 討論

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內發(fā)病率位居頭頸部惡性腫瘤第2位，位居所有惡性腫瘤第11位，主要的病理類型為鱗狀細胞癌[5]。近年來，我國喉癌的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，尤其是在中國的東北部地區(qū)[6]。雖然外科手術、放化療等傳統(tǒng)治療方式已取得顯著進展，但由于喉癌的低治愈率和治療后對患者喉功能和生活質量的影響原因[7,8]，因此尚無令人滿意的治療方法，臨床上亟需新的喉癌治療策略[9]。目前，喉癌的發(fā)病機制尚不完全清楚，吸煙、飲酒、空氣污染、職業(yè)因素等均為其發(fā)病危險因素。研究證實，在喉癌的發(fā)生進展中存在許多癌基因或抑癌基因的異常激活或失活，但至今尚未發(fā)現影響喉癌發(fā)生進展的關鍵基因[10]。

A20基因是細胞凋亡通路的重要抑制基因，是由TNF介導的NF-κB活化誘導的蛋白質，能夠調節(jié)NF-κB。目前研究表明，A20基因是多類惡性腫瘤(膠質瘤、淋巴瘤、胰腺癌等)的易感基因[11～14]。而A20基因在不同腫瘤中可能具備各異的生物學功能，如在胰腺癌組織中表達較正常組織低；在淋巴瘤中A20失活，在膠質瘤中表達較正常組織高等[15～17]。Hadisaputri等[18]發(fā)現，siRNA抑制A20基因后食管鱗癌細胞增殖侵襲明顯減少，A20基因可能作為食管鱗癌生存率低的獨立預后指標。另有資料顯示，在肝癌組織中A20基因表達升高與預后關系密切，降低A20基因表達能夠誘導腫瘤細胞凋亡，抑制細胞增殖[19,20]。近年也有學者針對耐藥問題展開研究，發(fā)現A20基因異常表達可造成細胞抗凋亡，致使細胞凋亡水平下降，進而導致癌細胞對藥物敏感性降低，產生耐藥[21]。上述文獻說明，A20基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉歸、藥物抵抗均有聯(lián)系。作用考慮與A20基因既能夠通過對靶細胞蛋白的泛素化修飾以調節(jié)機體炎癥反應、免疫應答，又可對TNF-ɑ介導的細胞凋亡實施去泛素化修飾以發(fā)揮負調控效用有關。RNA干擾技術涉及轉錄后基因沉默，是一種有效的代替基因敲除工具，目前已憑借其高效性、高特異性等特征而作為新實驗方式應用于腫瘤細胞信號通路及特定基因功能的研究中[22,23]。本研究顯示，A20 siRNA組A20基因mRNA和蛋白表達水平低于NC siRNA組、對照組。說明構建A20 siRNA表達載體能夠特異性封閉A20蛋白，且蛋白水平下降與mRNA下降是平行的。CCK8實驗顯示，A20 siRNA組OD值、克隆數低于NC siRNA組、對照組；流式細胞術提示，細胞周期G0/G1比例明顯上升，S期和G2/M期比例明顯下降，提示轉染A20 siRNA后Hep-2細胞增殖水平受到顯著抑制，A20 siRNA可使喉鱗癌Hep-2細胞周期阻滯于G0/G1期，特異性抑制細胞分裂。Transwell侵襲實驗顯示，A20 siRNA組穿膜細胞數低于NC siRNA組及對照組。說明轉染A20 siRNA后細胞侵襲能力出現下降。

總之，沉默A20基因后可顯著抑制喉鱗癌Hep-2細胞的增殖和侵襲能力，縮短細胞周期，這有望成為喉鱗癌的潛在治療靶點，但相關機制還有待進一步分析明確。