李曉通，李莉華

1天津市南開醫(yī)院，天津300100；2天津市北辰醫(yī)院

Graves病(GD)又稱彌漫性毒性甲狀腺腫，是一種常見的自身免疫性疾病，患者在多種因素影響下出現(xiàn)免疫功能異常，產(chǎn)生甲狀腺刺激性抗體主要是促甲狀腺激素受體抗體(TR-Ab)，從而導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)。GD的自身免疫機制研究不斷進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)GD患者體內(nèi)存在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)的數(shù)量減少或功能缺陷，輔助性T細(xì)胞Th1、Th2平衡的紊亂[1]。白細(xì)胞介素-4(IL-4)為Th2細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，可能在疾病發(fā)展中發(fā)揮作用。維生素D對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用不斷被發(fā)掘，包括誘導(dǎo)Treg細(xì)胞來促進(jìn)免疫耐受，以及具有調(diào)控Th1/Th2的免疫平衡的作用[2]。25-羥維生素D3(25-OH-D3)為體內(nèi)維生素D儲備情況的評價指標(biāo)，25-OH-D3水平下降可能與多種自身免疫性疾病包括GD發(fā)病相關(guān)[3]，但其作用機制仍不完全清楚。本研究通過觀察GD甲亢患者血清25-OH-D3、IL-4水平及外周血Treg細(xì)胞數(shù)量的變化，探討各指標(biāo)之間相關(guān)性及補充維生素D對疾病治療的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1～12月天津市北辰醫(yī)院收治的GD甲亢患者40例[觀察組，合并維生素D缺乏(25-OH-D3<20 ng/mL)18例，不缺乏者22例]，男10例，女30例；年齡18～70(41.2±16.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組診斷符合《中國甲狀腺疾病診治指南-甲狀腺功能亢進(jìn)癥》關(guān)于GD甲亢的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)為(21.48±11.32)pmol/L，高于正常范圍(3.8～6.0 pmol/L)，游離甲狀腺素(FT4)為(47.21±20.84)pmol/L，高于正常范圍(7.86～14.41 pmol/L)，促甲狀腺素(TSH)為(0.01±0.00)uIU/mL，低于正常范圍(0.34～5.60 μIU/mL)，TR-Ab均陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除其他病因所致甲亢，排除急慢性感染、腫瘤、器官移植術(shù)后、嚴(yán)重器質(zhì)性疾病、妊娠及其他自身免疫性疾病家族史者。選擇同期20名性別、年齡相匹配的健康體檢者為對照組，男4例，女16例；年齡18～70(43.6±14.2)歲。兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。本研究已通過天津市北辰醫(yī)院倫理委員會審核，研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

觀察組均全程接受抗甲狀腺藥物甲巰咪唑治療，每次10 mg，2～3次/d，每3～4周復(fù)查甲狀腺功能至正常后逐漸減量維持治療，治療至1 年觀察結(jié)束時均已達(dá)到甲狀腺功能正常的維持階段(緩解期)。對觀察組中維生素D缺乏者同時接受補充維生素D治療，予阿法骨化醇軟膠囊0.25 μg，1次/d，共治療3個月停藥。

1.2 檢測方法 采用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血清25-OH-D3，化學(xué)發(fā)光法檢測TR-Ab，ELISA法檢測IL-4，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量，以CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細(xì)胞百分比表示。對照組及觀察組治療前均檢測上述指標(biāo)。觀察組治療1年進(jìn)入緩解期時再次檢測TR-Ab、IL-4、CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比，其中合并維生素D缺乏者于維生素D治療3個月后加測一次上述三個指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清25-OH-D3、IL-4、TR-Ab水平及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量比較 血清25-OH-D3、IL-4、TR-Ab水平及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比比較見表1。

表1 兩組血清25-OH-D3、IL-4、TR-Ab水平及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 觀察組25-OH-D3與TR-Ab、CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比、IL-4的相關(guān)性分析 觀察組25-OH-D3水平與TR-Ab呈負(fù)相關(guān)(r=-0.83、-0.73，P均<0.05)，與CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比呈正相關(guān)(r=0.56，P<0.05)。

2.3 觀察組25-OH-D3缺乏者治療前后血清TR-Ab、IL-4及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比較 治療前、維生素D補充3個月及治療1年緩解期血清TR-Ab、IL-4及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比較見表2。

2.4 觀察組25-OH-D3不缺乏者治療前后血清TR-Ab、IL-4及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比較 治療前和治療1年緩解期血清TR-Ab、IL-4及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比較見表3。

表2 觀察組25-OH-D3缺乏者治療前后血清TR-Ab、IL-4及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比較

注：與治療前比較，*P<0.05。

表3 觀察組25-OH-D3不缺乏者治療前后血清TR-Ab、IL-4及外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比比較

注：與治療前比較，*P<0.05。

3 討論

GD是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病，在遺傳、環(huán)境、免疫多種因素作用下，機體出現(xiàn)免疫應(yīng)答異常而致病，是導(dǎo)致甲亢的最常見病因。GD特征性的自身抗體為TR-Ab，可作為疾病診斷標(biāo)志。GD病理特點為濾泡上皮的增生肥大，淋巴細(xì)胞浸潤。其發(fā)病機制尚不完全清楚，但多種免疫機制包括體液免疫及細(xì)胞免疫紊亂參與其中，尤其輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)、Treg細(xì)胞的失衡，破壞甲狀腺免疫耐受，相關(guān)免疫因子異常增多刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生甲狀腺刺激性抗體是其核心機制[1,2]。

維生素D是一種重要的調(diào)節(jié)骨代謝維生素，1,25-(OH)2-D3是其活性形式，體內(nèi)維生素D水平的評價主要是25-OH-D3。同時維生素D具有免疫調(diào)節(jié)功能，在自身免疫性甲狀腺疾病包括GD中同樣有重要作用。多個研究[5～7]發(fā)現(xiàn)，GD甲亢患者存在維生素D水平下降，但與自身抗體TR-Ab水平之間的相關(guān)性仍不統(tǒng)一。有研究認(rèn)為，維生素D水平下降是GD發(fā)病或停藥復(fù)發(fā)的危險因素[8,9]。同樣在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)GD甲亢患者較健康對照組25-OH-D3水平明顯下降，存在維生素D缺乏，同時25-OH-D3水平與TR-Ab水平負(fù)相關(guān)，與Yasuda等[7]的研究結(jié)果相一致，提示它可能參與GD的發(fā)病，尤其與自身抗體生成相關(guān)。但同時我們看到，無論有無維生素缺乏，GD甲亢患者在抗甲狀腺藥物治療甲亢得到緩解后維持階段，其自身抗體均較前有明顯下降，提示抗甲狀腺治療本身對抗體滴度的影響，而維生素D治療是否有進(jìn)一步的獲益還需設(shè)計不同治療對照組研究證實。

Treg細(xì)胞屬于CD4+T淋巴細(xì)胞家族，分為不同亞型，其中CD4+CD25+Treg細(xì)胞在維持外周免疫耐受中發(fā)揮重要作用。Foxp3是轉(zhuǎn)錄因子叉頭樣/翼狀螺旋家族的成員，主要表達(dá)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞，是其發(fā)育和功能的重要分子。既往研究報道，在GD中存在Treg細(xì)胞減少和/或功能缺陷[10,11]。本研究中GD甲亢患者也存在CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量減少，并且25-OH-D3水平與CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，這可能與維生素D的免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)。維生素D有調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子的分泌和抗原遞呈細(xì)胞的分化等作用，還可調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的活性和數(shù)量[12,13]。動物研究中維生素D缺乏小鼠Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少，Treg基因敲除小鼠模仿維生素D缺乏狀態(tài)，其甲亢癥狀明顯加重[14]。這提示維生素D與Treg細(xì)胞共同參與GD甲亢發(fā)病，并可能有密切相互聯(lián)系。但遺憾的是，在本研究中維生素缺乏組維生素D補充治療及甲亢完全緩解后Treg細(xì)胞比例均無明顯變化，未能看到維生素D補充治療對Treg細(xì)胞缺乏狀態(tài)的改善。但由于本研究樣本數(shù)量較小存在一定局限性，其間的聯(lián)系性仍需進(jìn)一步研究。

IL-4是Th2細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子之一，有加強體液免疫反應(yīng)、促進(jìn)抗體生成的作用。以往研究發(fā)現(xiàn)GD甲亢患者中存在Th1/Th2失衡向Th2偏移，促進(jìn)TR-Ab產(chǎn)生[15]。本研究發(fā)現(xiàn)GD甲亢患者治療前IL-4水平明顯升高，再次說明Th2細(xì)胞以及IL-4在GD甲亢的發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用。維生素D水平與之負(fù)相關(guān)，也為維生素D的可能作用機制提供了又一線索。并且本研究中，盡管GD甲亢合并維生素D缺乏組在維生素D補充治療3個月后IL-4水平?jīng)]有明顯變化，但在緩解期IL-4水平較前有明顯下降，與之不同的是GD甲亢維生素D正常組僅僅接受抗甲狀腺藥物治療而無維生素D補充治療，當(dāng)緩解期甲亢好轉(zhuǎn)時IL-4水平與治療前比無明顯變化，這說明單純抗甲狀腺藥物治療緩解甲狀腺功能異常沒有改善IL-4的升高，Th2細(xì)胞免疫異常無好轉(zhuǎn)，而GD甲亢合并維生素D缺乏組的改善可能來源于維生素D補充治療，提示維生素D可能在疾病中對IL-4水平有調(diào)節(jié)作用。但本研究為間接推測，還需更多的病例對照臨床實驗研究證實，維生素D具體作用通路也需探討。并且目前有研究關(guān)注到維生素D補充治療對于降低GD復(fù)發(fā)風(fēng)險及心血管風(fēng)險的益處[16，17]，未來需進(jìn)一步評價維生素D補充在GD甲亢治療中的獲益與風(fēng)險。

總之，GD甲亢患者血清25-OH-D3水平下降，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞減少，細(xì)胞因子IL-4水平的升高，25-OH-D3水平與TR-Ab、IL-4水平負(fù)相關(guān)，與CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)量呈正相關(guān)，通過對缺乏維生素D患者補充治療，可使其IL-4水平有下降，可能對患者免疫功能調(diào)節(jié)具有一定作用。