吳叢楊慧 高連東

摘 要：針對(duì)來(lái)自醫(yī)療廢物堆放場(chǎng)地的抗性基因污染土壤，本研究利用紫外線輻射技術(shù)進(jìn)行土壤修復(fù)。其間通過(guò)試驗(yàn)研究了紫外波長(zhǎng)與照射時(shí)間、土壤中碳酸鈣含量對(duì)土壤中關(guān)注類抗性基因氨基糖苷類（aminoglycosides）、氯霉素類（chloramphenicol）、磺胺類（sulfonamides）、四環(huán)素類（tetracycline）的降解影響。結(jié)果表明，在254 nm紫外波長(zhǎng)的照射下，向土壤添加5%的石灰，設(shè)置1 min的紫外照射時(shí)間，更有利于上述四種抗性基因的降解，可有效修復(fù)該污染土壤。

關(guān)鍵詞：土壤修復(fù);抗生素抗性基因;高通量測(cè)序;降解

中圖分類號(hào)：TU991.25文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1003-5168（2020）35-0137-04

Abstract： In this study， ultraviolet radiation technology was used to dispose the soil samples from the medical waste dump site. During the experiment， the effects of ultraviolet wavelength， irradiation time， and calcium carbonate content in the soil on the degradation of resistance genes of concern namely aminoglycosides， chloramphenicol， sulfonamides， and tetracycline in the soil were studied. The results showed that 5% content of calcium carbonate was added to soil and UV irradiation time was set for 1 min at 254 nm， which was more conducive to the degradation of the concerned ARGs and was effective for soil remediation.

Keywords： soil remediation;antibiotic resistance genes;high-throughput sequencing;degradation

在全球范圍內(nèi)，抗生素濫用情況嚴(yán)重，加速了抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）在細(xì)菌間的傳播，并產(chǎn)生細(xì)菌的耐藥性，增加致死率和治病率[1]。ARGs通常位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可動(dòng)遺傳因子（Mobilegeneticelement）上，由于基因水平轉(zhuǎn)移（Horizontal Gene Transfer，HGT）作用[2]，致病菌也可從環(huán)境非病原性微生物中獲得ARGs，因此，ARGs不僅在微生物細(xì)胞中能夠長(zhǎng)久而持續(xù)地傳播，同時(shí)細(xì)菌也可以通過(guò)攝取游離DNA獲取ARGs[3]。目前已有大量研究表明，ARGs在水體和底泥等生態(tài)環(huán)境中廣泛存在[4]，同時(shí)土壤也是ARGs的庫(kù)源[5]。近些年來(lái)，土壤中ARGs及其帶來(lái)的抗生素抗性污染受到日益廣泛的關(guān)注，但對(duì)土壤中的抗性基因處置方式報(bào)道較少，而利用紫外消毒技術(shù)處理廢水中的ARGs常見(jiàn)于報(bào)道[6-7]。

醫(yī)療廢物中常含有病原微生物等有害物質(zhì)，如果處置不當(dāng)，使其進(jìn)入土壤中，可能破壞土壤微生態(tài)，并導(dǎo)致土壤菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。針對(duì)某醫(yī)療固廢堆放場(chǎng)的污染土壤，本文利用紫外線輻射技術(shù)并采用定制的紫外設(shè)備，對(duì)該抗生素污染土壤進(jìn)行修復(fù)處理，探尋針對(duì)該土壤的最佳修復(fù)模式。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)土壤采集自蘇州某醫(yī)療廢棄物堆置場(chǎng)地的抗性基因污染區(qū)域土壤，該場(chǎng)地內(nèi)原從事醫(yī)療廢物的非法處置活動(dòng)，非法堆放有一次性使用后的輸液玻璃瓶、塑料袋、注射器（針）以及輸液器（針）等醫(yī)療廢棄用品。根據(jù)前期場(chǎng)地環(huán)境調(diào)查，該堆置范圍的土壤氨基糖苷類、氯霉素類、磺胺類和四環(huán)素類等常用抗生素藥物對(duì)應(yīng)ARGs的豐度和多樣性顯著高于土壤背景值[8]。土壤理化性質(zhì)如表1所示。

土壤在現(xiàn)場(chǎng)采集后裝入密封袋，然后裝入含有藍(lán)冰的滅菌保溫箱，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室在4 ℃冷藏室保存。土壤基本理化性質(zhì)如表1所示。

1.2 試驗(yàn)方法

在不同的土壤樣品中分別加入不同濃度的碳酸鈣，混合均勻后分別采用220 nm和254 nm波長(zhǎng)的紫外設(shè)備照射土壤樣品。試驗(yàn)共設(shè)計(jì)1%和5%兩種濃度的碳酸鈣，選用220 nm和254 nm兩種紫外線波長(zhǎng)，紫外照射時(shí)間選擇1 min和2 min兩種時(shí)間進(jìn)行處理，以不添加碳酸鈣和未經(jīng)紫外照射的樣品為對(duì)照值。

1.2.1 土壤樣品的處理及制備。直接采用手工篩選方式，去除土壤樣品中的大石塊、植物根系與垃圾等，并將所有土壤人工破碎，混合均勻，過(guò)10目篩，將無(wú)法通過(guò)的大顆粒默認(rèn)為無(wú)污染或輕污染土壤，然后去除。每份土壤取3.0 kg，向不同土壤中分別添加1%、5%的碳酸鈣（分析純），混合均勻。

1.2.2 紫外設(shè)備對(duì)土壤樣品的處理。本次試驗(yàn)的紫外設(shè)備為非標(biāo)定制產(chǎn)品，具體結(jié)構(gòu)為裝有紫外燈管的密閉燈盒。盒體由不銹鋼構(gòu)成，呈長(zhǎng)方體，盒體尺寸40 cm×80 cm×20 cm。盒部頂端裝有3根可更換不同波長(zhǎng)的紫外燈管，盒部?jī)啥擞煽梢苿?dòng)木塊密封盒體，便于底部土壤取出。試驗(yàn)時(shí)，在不銹鋼密閉盒底部放置一層牛皮不銹紙，其上將專用塑料刮板攤鋪均勻，以肉眼無(wú)法觀察到明顯空白為標(biāo)準(zhǔn)。每次換樣時(shí)，均需要換用牛皮紙并將不銹鋼密閉盒清理干凈，防止樣品交叉污染。然后，將不銹鋼密封盒關(guān)閉，按照試驗(yàn)要求更換不同波段UV燈管，并控制照射時(shí)間。在照射進(jìn)行到一半時(shí)，將暫停照射，人工翻轉(zhuǎn)土壤一次。

1.2.3 處理后土壤DNA提取及基因檢測(cè)。樣品經(jīng)紫外線處理結(jié)束后，取70 g裝入50 mL密封塑料離心管，置于-20 ℃冰箱保存，并盡快送入實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。土壤樣品里的微生物采用SDS裂解法配合酚氯仿（25∶24∶1）去除殘余蛋白等雜質(zhì)進(jìn)行DNA提取，并使用Qubit 2.0 Fluorometer（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）將提取出的DNA定量，進(jìn)行電泳檢測(cè)（見(jiàn)圖1），共送檢42個(gè)樣品。接著，根據(jù)第一次DNA結(jié)果，共選出11個(gè)土壤樣品進(jìn)行測(cè)序。

DNA提取后，用Covaris超聲波破碎儀將其隨機(jī)打斷，再經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化以及PCR擴(kuò)增等步驟完成整體的文庫(kù)制備工作。構(gòu)建文庫(kù)完成后，首先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，將文庫(kù)稀釋，隨后使用Agilent 2100檢測(cè)文庫(kù)的插入片段。若插入片段大小符合預(yù)期，就使用Q-PCR法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。所構(gòu)建文庫(kù)檢測(cè)合格后，按照有效濃度和目標(biāo)數(shù)據(jù)量的需求將不同文庫(kù)的Pooling至Illumina測(cè)序芯片進(jìn)行cBot成簇，然后使用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，采用PE150雙端測(cè)序策略。測(cè)序數(shù)據(jù)出來(lái)后，通過(guò)Factqc（http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，并去除原始數(shù)據(jù)中接頭序列、含有N>5%的序列以及SQ<20且堿基大于15%的序列的數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)篩選獲得有效數(shù)據(jù)，建庫(kù)流程如圖2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品DNA提取結(jié)果

對(duì)送檢的42個(gè)樣品進(jìn)行了DNA片段浸提，不同處理?xiàng)l件下，樣品DNA片段浸提效果表現(xiàn)出3種現(xiàn)象，為可浸提的DNA片段充分（易浸提）、可浸提的DNA片段很少（難浸提）、無(wú)法浸提有效DNA（無(wú)法浸提）。不同處理?xiàng)l件下的浸提結(jié)果如表2所示。

由表2可知，無(wú)法浸提的DNA片段樣品率在紫外波長(zhǎng)254 nm時(shí)為37.5%，220 nm時(shí)為12.5%。這說(shuō)明254 nm條件下DNA片段的降解比較充分。

2.2 土壤宏基因組提取與高通量測(cè)序

在DNA預(yù)試驗(yàn)的前提下，主要針對(duì)254 nm紫外波長(zhǎng)處置后的土壤樣品，選擇了11個(gè)樣品進(jìn)行進(jìn)一步的宏基因組提取與高通量測(cè)序，測(cè)序質(zhì)量良好，有效率大于99.7%，Q20>95.5 %，Q30>87.9%，結(jié)果如表3所示。

2.3 ARGS在11個(gè)土壤樣本中的分布組成

各樣本中不同類型的ARGs豐度圖如圖3所示。本次試驗(yàn)主要關(guān)注4種抗性基因，包括氨基糖苷類（aminoglycosides）、氯霉素類（chloramphenicol）、磺胺類（sulfonamides）和四環(huán)素類（tetracycline）。11個(gè)樣本抗生素抗性基因熱圖展示了不同類型抗生素抗性基因豐度，其單位為“抗生素抗性基因拷貝數(shù)/16S rRNA gene拷貝數(shù)”。

2.4 ARGS多樣性分析

ARGS多樣性分析結(jié)果顯示，送檢樣品中所關(guān)注的上述氨基糖苷類等4種抗性基因除部分樣品外，大多數(shù)有檢出。從表4可看出，對(duì)于ARGs aminoglycoside和chloramphenicol來(lái)說(shuō)，紫外照射有效降低了土壤的抗性基因豐度，總體來(lái)說(shuō)，1 min的降低程度優(yōu)于2 min。送檢土壤樣品關(guān)注類ARGs亞型豐度的單位為“ARGs 拷貝數(shù)/16S rRNA基因拷貝數(shù)”。對(duì)于ARGs sulfonamide來(lái)說(shuō)，紫外照射時(shí)間在2 min時(shí)，抗性基因豐度有所降低。對(duì)于ARGs tetracycline來(lái)說(shuō)，1 min和2 min均有所降低，但2 min的數(shù)據(jù)降低趨勢(shì)更為明顯?？傮w來(lái)說(shuō)，紫外照射有效地降低了所關(guān)注的4種抗性基因的豐度，從降低的抗性基因種類數(shù)來(lái)說(shuō)，1 min的時(shí)間優(yōu)于2 min。

當(dāng)無(wú)紫外照射時(shí)，1%的碳酸鈣濃度抑制了ARGs aminoglycoside的豐度，而在1 min時(shí)，抗性基因豐度隨著碳酸鈣濃度的上升而增加，在2 min時(shí)，1%和5%的碳酸鈣濃度均有抑制作用;對(duì)于ARGs chloramphenicol來(lái)說(shuō)，碳酸鈣濃度的影響較小;對(duì)于ARG ssulfonamide來(lái)說(shuō)，隨著碳酸鈣濃度的增加，抗性基因豐度下降;對(duì)于tetracycline來(lái)說(shuō)，碳酸鈣的增加，抗性基因豐度有降低現(xiàn)象，但不是很明顯。總體來(lái)說(shuō)，在紫外照射條件下，碳酸鈣濃度影響了抗性基因豐度，有降低現(xiàn)象，尤其在5%時(shí)，效果更為明顯。

3 結(jié)論

紫外燈在254 nm波長(zhǎng)下對(duì)土壤進(jìn)行照射是降解土壤抗生素抗性基因豐度的有效手段之一。綜合考慮來(lái)說(shuō)，添加5%的石灰且使用1 min的紫外照射時(shí)間，更有利于土壤中氨基糖苷類（aminoglycosides）、氯霉素類（chloramphenicol）、磺胺類（sulfonamides）、四環(huán)素類（tetracycline）等類型抗生素的降解，該技術(shù)對(duì)抗性基因污染土壤的修復(fù)有實(shí)際指導(dǎo)意義。

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