王民樂，羅 瑞，劉 源，閆 麗，方曉春，范慶杰，郭久林**

（1.承德市農(nóng)林科學(xué)院，河北 承德 067000；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

羊肚菌（Morchella spp.）隸屬子囊菌亞門（Ascomycota） 盤菌綱 （Discomycetes） 盤菌目 （Pezizales） 羊肚菌科（Morchellaceae） 羊肚菌屬（Morchella），因其菌蓋呈現(xiàn)為密集的蜂窩狀，外觀極似羊肚而得名[1]。羊肚菌是珍稀食用菌，其氣味獨(dú)特、鮮香味美，具有極高的保健與藥用功能，深受國內(nèi)外消費(fèi)者青睞[2]。隨著人工羊肚菌栽培在外源營養(yǎng)袋補(bǔ)料技術(shù)上的探索與突破，2011年羊肚菌實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)，栽培面積迅猛增長[3]。近幾年，經(jīng)科研人員對羊肚菌品種的篩選與優(yōu)化，六妹羊肚菌（Morchella sextelata） 成為我國羊肚菌產(chǎn)業(yè)的主栽品種[4]。據(jù)研究報道，食用菌菌絲生長及子實(shí)體形成與碳源、氮源和碳氮比密切相關(guān)[5]。通過對比六妹羊肚菌在不同碳氮源、碳氮比培養(yǎng)基中的菌絲特性，旨在探尋六妹羊肚菌菌絲生長所需的最佳碳源、氮源及碳氮比，為羊肚菌菌種生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，為羊肚菌栽培營養(yǎng)供給提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

六妹羊肚菌菌株，購自平泉希才應(yīng)用菌科技發(fā)展有限公司。

1.2 供試培養(yǎng)基

碳源培養(yǎng)基[6]：碳源20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。

氮源培養(yǎng)基[6]：葡萄糖20 g、氮源2 g、磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。

C/N培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、酵母浸粉含量見1.3.3、磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同碳源對菌絲的影響

供試碳源有8種，分別為單糖（果糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖），雙糖（乳糖、麥芽糖、蔗糖），多糖（可溶性淀粉）。

供試培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后，注至直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，冷卻凝固。取直徑為6 mm的羊肚菌菌塊接種于8種不同碳源培養(yǎng)基中央位置，每個處理重復(fù)5次，置于25℃恒培養(yǎng)箱中，進(jìn)行避光培養(yǎng)。待菌絲萌發(fā)后，采用十字劃線法標(biāo)記菌落直徑，觀察菌絲形態(tài)，待任意一培養(yǎng)皿中菌絲長滿，停止劃線。菌絲生長速度（V，mm·h-1）的計算公式為：

式中：R為菌落半徑（mm）；T為生長時間（h）。

1.3.2 不同氮源對菌絲的影響

供試氮源有9種，分別為無機(jī)氮（尿素、硝酸鉀、磷酸氫二銨），氨基酸（甘氨酸、苯丙氨酸），有機(jī)氮（蛋白胨、麥芽浸粉、酵母浸粉、牛肉浸粉）。按1.3.1方法培養(yǎng)菌絲，測定其生理特性。

1.3.3 不同碳氮比對菌絲的影響

設(shè)供試培養(yǎng)基碳氮比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1、55∶1、60∶1，酵母浸粉添加量（X，g）計算公式為：

式中：TC為總碳含量（g）；E為碳氮比。

以20 g可溶性淀粉為基準(zhǔn)，對應(yīng)酵母浸粉添加量 為 11.03 g、7.36 g、5.52 g、4.41 g、3.69 g、3.15 g、2.76 g、2.45 g、2.21 g、2.00 g、1.84 g。按比例配制培養(yǎng)基，按1.3.1方法培養(yǎng)菌絲，測定其生理特性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對菌絲的影響

六妹羊肚菌菌絲在不同碳源培養(yǎng)基中生長情況見表1、圖1。

由表1、圖1可知，可溶性淀粉培養(yǎng)基中菌絲生長速度最快，其次為蔗糖和麥芽糖，三者間差異不顯著，但可溶性淀粉與其余5種碳源培養(yǎng)基間存在顯著差異。在不同碳源培養(yǎng)基上菌絲生長速度為可溶性淀粉＞蔗糖＞麥芽糖＞半乳糖＞乳糖＞葡萄糖＞阿拉伯糖＞果糖。菌絲長勢，可溶性淀粉培養(yǎng)基中菌絲濃密，菌落邊緣整齊，長勢最佳；蔗糖、半乳糖、葡萄糖次之；麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、果糖培養(yǎng)基中菌絲長勢最弱。綜合菌絲生長速度、長勢分析，可溶性淀粉為最適宜六妹羊肚菌菌絲生長的培養(yǎng)基碳源。

2.2 不同氮源對菌絲的影響

六妹羊肚菌菌絲在不同氮源培養(yǎng)基中生長情況見表2、圖2。

表2 不同氮源對六妹羊肚菌菌絲生長的影響Tab.2 Effect of different nitrogen sources on the mycelial growth of Morchella sextelata

由表2、圖2可看出，酵母浸粉、硝酸鉀培養(yǎng)基中菌絲生長速度最快，麥芽浸粉、牛肉浸粉、磷酸氫二銨、甘氨酸、蛋白胨次之，其相互之間無顯著差異；苯丙氨酸培養(yǎng)基中菌絲生長速度較慢，與酵母浸粉、硝酸鉀間差異顯著；尿素培養(yǎng)基中菌絲沒有萌發(fā)生長。酵母浸粉培養(yǎng)基中菌絲濃密，菌落邊緣整齊，長勢最佳，硝酸鉀、牛肉浸粉、磷酸氫二銨、蛋白胨、苯丙氨酸次之，麥芽浸粉、甘氨酸培養(yǎng)基中菌絲長勢較弱。綜合菌絲生長速度、長勢分析，酵母浸粉為最適宜六妹羊肚菌菌絲生長的培養(yǎng)基氮源。

2.3 不同碳氮比對菌絲的影響

六妹羊肚菌在不同碳氮比培養(yǎng)基中菌絲體生長情況見表3、圖3、圖4。

表3 不同碳氮比對六妹羊肚菌菌絲長勢的影響Tab.3 Effect of different carbon-nitrogen ratio on the mycelial vigour of Morchella sextelata

由表3、圖3、圖4可知，碳氮比在10∶1、25∶1時菌絲生長速度最快，與 30∶1、40∶1、45∶1、50∶1之間菌絲生長速度存在顯著性差異。碳氮比在10∶1～25∶1之間比 30∶1～60∶1 之間菌絲生長速度快，碳氮比升高，菌絲生長速度總體呈下降趨勢。碳氮比在15∶1、20∶1時菌絲密，菌落邊緣整齊，長勢最佳，隨碳氮比升高，菌絲長勢逐漸減弱。綜合菌絲生長速度、長勢，在以可溶性淀粉、酵母浸粉為培養(yǎng)基碳氮源，其碳氮比在10∶1～25∶1之間最適宜六妹羊肚菌菌絲生長。

3 結(jié)果與討論

供試菌株能利用多種碳源物質(zhì)，但對不同碳源同化吸收有差異，總體呈現(xiàn)多糖優(yōu)于雙糖，雙糖優(yōu)于單糖的趨勢，最佳碳源培養(yǎng)基為可溶性淀粉。謝占玲等[7]、朱永真等[8]、張曉宇等[9]研究結(jié)論均為可溶性淀粉為羊肚菌最佳碳源，與試驗(yàn)結(jié)果一致。趙春燕等[10]研究結(jié)論為羊肚菌Sn-l菌株最佳碳源為葡萄糖；陶熱等[11]研究結(jié)論為小羊肚菌最佳碳源為果糖；高婷婷等[12]研究結(jié)論顯示，源于吉林省的兩種羊肚菌菌株最佳碳源分別為葡萄糖和可溶性淀粉；謝放等[13]研究結(jié)論顯示，7株羊肚菌最佳碳源不一致?？赡苁怯捎诠┰嚲瓴煌?，遺傳特性與基因表達(dá)上的差異導(dǎo)致了研究結(jié)果的差異。

供試菌株可利用有機(jī)氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮多種氮源，對不同氮源同化吸收存在差異，結(jié)果顯示，供試菌株最佳氮源為酵母浸粉，但無法在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中生長。龔燕川等[14]研究結(jié)論顯示，梯棱羊肚菌M83和M101菌株的最佳氮源為蛋白胨；張曉宇等[9]研究結(jié)論是羊肚菌Y2最佳氮源為硝酸鉀；劉娜等[15]研究認(rèn)為菌株F011、W16H2、301和Q的最佳氮源為蛋白胨和酵母膏，菌株85為酵母膏；謝占玲等[7]結(jié)論顯示，5株不同羊肚菌最佳氮源分別為硫酸銨、蛋白胨、酵母膏、硝酸鉀、硝酸鈉。試驗(yàn)中供試菌株無法有效利用尿素，這與李青等[16]、謝放等[13]、董雪[17]研究結(jié)果一致，但朱永真等[8]、任桂梅等[18]則認(rèn)為尿素可作為羊肚菌的最優(yōu)氮源。在羊肚菌最佳氮源篩選方面，各研究結(jié)果存在差異較大，可能與供試菌株和研究方法的不同所致，但尿素能否被羊肚菌直接有效利用有待進(jìn)一步研究探討。

碳氮比是食用菌菌種制作與栽培生產(chǎn)上的重要參考指標(biāo)，菌絲生長階段的碳氮比研究對子實(shí)體生長有一定指導(dǎo)作用。董雪[16]研究認(rèn)為黑脈羊肚菌菌絲生長的適宜碳氮比為20∶1～30∶1，最佳碳氮比為25∶1；張曉宇等[9]認(rèn)為羊肚菌Y2最佳碳氮比為25∶1；陶熱等[11]研究結(jié)果顯示，小羊肚菌菌絲生長的最適碳氮比為20∶1；試驗(yàn)結(jié)果顯示供試菌株菌絲生長最適碳氮比為10∶1～25∶1。說明羊肚菌菌絲生長需要較多的氮源，在菌種制作和生產(chǎn)中，碳氮比控制在20∶1～25∶1為宜，控制生產(chǎn)成本的同時，還能保證菌種質(zhì)量，降低污染率。