梁佩芳

（開封大學(xué)醫(yī)學(xué)部,河南開封475001）

Gla 在肽類與蛋白質(zhì)合成中起著非常重要的作用。若要合成含有Gla 的多肽及蛋白質(zhì)，Gla 是必不可少的。但是Gla 為非天然氨基酸，含有手性中心，且用于固相合成芋螺睡眠肽類似物的γ,γ′-二叔丁基-L-Nα-9-芴甲氧羰基-γ-羧基谷氨酸（Fmoc-Gla(OtBu)2-OH）含有多個保護(hù)基，故難以合成。近年來，國內(nèi)外對Fmoc-Gla(OtBu)2-OH 的合成方法做了大量的研究，推出了許多合成路線。根據(jù)起始原料的不同有四條合成路線，現(xiàn)綜述如下。

1 以安息香酸為原料合成目標(biāo)產(chǎn)物

1995 年，Schuerman MA 提出用廉價的安息香為原料合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH[1]，合成路線如下：

圖1 以安息香為原料合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH

合成路線：以安息香為原料，先將安息香轉(zhuǎn)化為安息香肟（3），再通過鈀碳催化劑催化氫化還原，生成L型（4a）和D型（4b）的氨基醇外消旋體，通過加入天然氨基酸——L-谷氨酸進(jìn)行拆分，得到L-氨基醇（4a）中間體，中間體加入溴乙酸乙酯反應(yīng)生成縮醛，芐氧羰基（Cbz）保護(hù)氨基，得到（5）。經(jīng)歷開環(huán)（6），氯化鈀催化氫化脫保護(hù)得到（7），芴甲氧羰基（Fmoc）保護(hù)氨基得到最終產(chǎn)物（1）。反應(yīng)總產(chǎn)率為8.44%。

該方法的優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)起始原料安息香價格便宜，供應(yīng)充足；分旋光試劑為天然氨基酸——L-谷氨酸，便宜易得；純化方法簡單，路線中所有純化步驟僅需重結(jié)晶純化；不需柱層析純化。缺點(diǎn)：用谷氨酸作為分旋光試劑，可能導(dǎo)致產(chǎn)物光學(xué)純度低，需要多次分離，且產(chǎn)生大量的D 型中間體（目前沒有合適的用途），導(dǎo)致產(chǎn)率下降；催化氫化所用氯化鈀催化劑價格昂貴，且長時間的加壓氫化對工業(yè)設(shè)備有較高要求；由于多數(shù)步驟反應(yīng)產(chǎn)率較低，導(dǎo)致總產(chǎn)率較低。

2 以Z-對苯磺?；?絲氨酸甲酯為原料合成目標(biāo)產(chǎn)物

1997 年，Somla S 提出以Z-對苯磺?；?絲氨酸甲酯（Z-Ser(Tos)-OMe）為原料，合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH[3]。2006 年，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院戴秋云研究員課題組的肖彩又對其路線進(jìn)行優(yōu)化[4]，合成路線如下:

圖2 以Z-Ser(Tos)-OMe為原料合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH

合成路線：丙二酸二叔丁酯與正丁基鋰反應(yīng)，生成帶有碳負(fù)離子的中間體，再與Z-Ser(Tos)-OMe 反應(yīng)，生成中間體（9），（9）在堿性條件下水解得到外消旋體（10），在（10）的乙酸乙酯溶液中加入奎寧，低溫放置一段時間，D型異構(gòu)體結(jié)合奎寧沉淀，蒸干溶液，得到L型異構(gòu)體（11），（11）用鈀碳催化劑催化氫化脫去Cbz保護(hù)基，再經(jīng)過Fmoc保護(hù)氨基得到最終產(chǎn)物（1）。

該方法的優(yōu)點(diǎn)：合成路線短，僅需5 步反應(yīng)便能得到目標(biāo)產(chǎn)物，且除了第一步反應(yīng)，其余反應(yīng)均相對簡單，各步反應(yīng)時間短，路線周期短，適合實(shí)驗室少量合成Fmoc-Gla(OtBu)2-COOH。缺點(diǎn)：相比于其他方法，原料Z-Ser(Tos)-OMe的價格相對昂貴；選用奎寧為分旋光試劑可能導(dǎo)致產(chǎn)物光學(xué)純度低，且需要多次分離，分離后的D型中間體目前沒有合適的用途。

3 以D-絲氨酸為原料合成目標(biāo)產(chǎn)物

2006 年，Jiang S 提出以D-絲氨酸（D-Ser）為原料，先合成重要中間體Garner 醛[5]，再合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH[6]，合成路線如下：

圖3 以D-Ser為原料合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH

合成路線：以D-Ser 為原料，加入無水甲醇和乙酰氯，酯化生成（13），再與氯甲酸芐酯（Cbz-Cl）反應(yīng)，Cbz保護(hù)氨基，生成（14），環(huán)化，硼氫化鈉還原酯基為羥基，氧化羥基為醛基，生成重要的中間體——Garner 醛（17），丙二酸二叔丁酯與正丁基鋰反應(yīng)，生成碳負(fù)離子中間體，再與Garner 醛反應(yīng)生成（18），溴化鉍催化縮醛的開環(huán)反應(yīng)，得到（19），重鉻酸吡啶鎓（PDC）將羥基氧化為酸，得到（20），再經(jīng)過鈀碳催化氫化還原，脫掉Cbz保護(hù)基，F(xiàn)moc保護(hù)氨基得到最終產(chǎn)物（1）。

該方法的優(yōu)點(diǎn)：使用D-Ser為原料，價格便宜；合成路線中不涉及手性碳原子的翻轉(zhuǎn)，不會產(chǎn)生D 型中間體，產(chǎn)物光學(xué)純度高，文獻(xiàn)記載對映體過量值（enantio?meric excess 簡稱ee 值）可達(dá)99%；Garner 醛作為重要中間體，其合成方法較完善；合成步驟的每一步產(chǎn)率均較高，因此總產(chǎn)率高達(dá)52%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他幾條路線產(chǎn)率。缺點(diǎn)：此合成路線周期長，其中一些步驟反應(yīng)時間長，使得整個路線周期較長；路線中多處使用乙醚、甲苯溶劑，不利于工業(yè)生產(chǎn)；反應(yīng)路線中有些步驟使用混合溶劑，不利于溶劑回收；反應(yīng)中使用大量PDC 生成鉻離子，會對環(huán)境造成污染。

4 以硫代水楊酸為原料合成目標(biāo)產(chǎn)物

2011 年，Smith DJ 提出以硫代水楊酸為原料，合成Fmoc-Gla(OtBu)2-COOH[2]，合成路線如下：

圖4 以硫代水楊酸為原料合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH

合成路線：以硫代水楊酸為原料，首先原料與碘甲烷反應(yīng)，對巰基進(jìn)行保護(hù)，再用氫化鋰鋁將羧基還原，得到中間體（24），（24）與稀鹽酸反應(yīng)，得到鹵代物（25），（25）和脯氨酸、對甲基苯磺酰氯（MsCl）反應(yīng)得到（27），（27）為外消旋體，其D 型和L 型異構(gòu)體分別與Cu2+結(jié)合后，生成顏色和極性均不相同的（28），此時可用柱層析的方法將二者分離，得到L 型中間體（29），加入稀鹽酸脫去脯氨酸，乙二胺四乙酸（EDTA）脫去中間體中的金屬離子，F(xiàn)moc保護(hù)氨基得到最終產(chǎn)物（1）。反應(yīng)總產(chǎn)率為7.5%。

該方法的優(yōu)點(diǎn)：創(chuàng)新性地使用二價金屬離子——Cu2+，分別與D 型和L 型的反應(yīng)中間體結(jié)合，進(jìn)行分離，避免了因使用天然氨基酸、麻黃堿、金雞納生物堿等分離，導(dǎo)致產(chǎn)物光學(xué)純度低的缺點(diǎn)；原料硫代水楊酸價格便宜，供應(yīng)充足。缺點(diǎn)：此合成路線長，產(chǎn)率低；中間體（28）的D 型化合物目前沒有合適的用途，導(dǎo)致產(chǎn)率下降；化合物（26）（27）（28）（30）（1）均需柱層析法進(jìn)行純化，不利于工業(yè)生產(chǎn)。

5 結(jié)論

文中四種合成Fmoc-Gla(OtBu)2-OH 的路線各有利弊。從工業(yè)生產(chǎn)的角度考慮，前三種路線均有明顯的缺點(diǎn)，不適合工業(yè)生產(chǎn)。以安息香為原料的路線產(chǎn)率低，成本高，難以得到光學(xué)純度高的產(chǎn)物，對設(shè)備的要求較高；以硫代水楊酸為原料的路線難以純化，需要多次柱層析分離；以Z-對苯磺酰基-絲氨酸甲酯為原料的路線成本高，且難以得到光學(xué)純度高的產(chǎn)物。而第四條路線——以D-絲氨酸為原料雖然路線長，周期長，但相對另外三條路線，由于不需要分離旋光異構(gòu)體，因而產(chǎn)率高，產(chǎn)物光學(xué)純度高，純化方便，成本低，比較適合工業(yè)生產(chǎn)。各條路線比較如表1所示。

表1 四種合成路線比較

以D-Ser為原料的合成路線相比其他三條路線，具有優(yōu)勢，但仍然存在缺點(diǎn)，如在路線中使用混合溶劑會導(dǎo)致溶劑難以重復(fù)利用，柱層析純化不利于批量生產(chǎn)，原料及催化劑的量未經(jīng)實(shí)驗探索可能導(dǎo)致浪費(fèi)或產(chǎn)率下降等。這些缺點(diǎn)使得該路線無法用于工業(yè)生產(chǎn)中，必須進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，優(yōu)化混合溶劑為單一溶劑，優(yōu)化柱層析純化為重結(jié)晶純化，優(yōu)化反應(yīng)物配比。只有進(jìn)行這些優(yōu)化，才能節(jié)省成本，提高產(chǎn)率，才能使Fmoc-Gla(OtBu)2-OH工業(yè)化生產(chǎn)得以進(jìn)行。