徐國波, 王棟, 朱勤鳳, 劉香, 廖尚高**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2.教育部民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用工程研究中心， 貴州 貴陽 550004)

頭花蓼(Polygonumcapitatum)為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)植物，是貴州省少數(shù)民族地區(qū)常用的苗藥，臨床上主要用于治療泌尿系統(tǒng)感染疾病[1-2]。植物內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物因與宿主代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)相關(guān)或功效相近，已成為尋找活性分子的重要資源[3-4]。前期課題組發(fā)現(xiàn)頭花蓼內(nèi)生菌代謝物對大腸桿菌、金黃色葡萄球、表皮葡萄球菌、銅綠假單孢菌等尿路感染菌具有抗菌活性[5-6]，認(rèn)為Diaporthesp.是頭花蓼植物中具有抗菌作用的內(nèi)生菌，但其抗菌物質(zhì)不明確，本文對Diaporthesp.代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最后對單體化合物進(jìn)行藥效評估，以期從中發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性的天然產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器 JEOL ECX 400 核磁共振波譜儀(日本電子株式會社JEOL)，Bruker Avance 600核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)，TSQ Endura三重四級桿質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技公司)，高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，LC3000制備型高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技)，OSB-2100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本 EYELA，東京理化器械株式會社)。

1.1.2試劑 薄層層析硅膠G254、柱層析硅膠(200～300目、300～400目)(青島海洋化工廠)，Sephadex LH-20(瑞士Pharmacia Biotech 公司)，環(huán)丙沙星(純度99%，北京索萊寶公司)，石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、DMSO、甲醇、冰乙酸均為分析純。

1.1.3菌種 實驗菌株為從貴州省道地藥材頭花蓼的莖中分離得到的內(nèi)生真菌，經(jīng)rDNA的ITS序列相似性鑒定為Diaporthesp.。

1.2 方法

1.2.1發(fā)酵培養(yǎng) 將Diaporthesp.菌株活化培養(yǎng)后，接種至大米固體培養(yǎng)基中，28 ℃下恒溫培養(yǎng) 30 d。

1.2.2提取與分離 取真菌固態(tài)大米發(fā)酵物10.0 kg，室溫下用乙酸乙酯浸提3次，減壓濃縮得浸膏158.1 g?？偨嘟?jīng)硅膠柱層析(石油醚 ∶丙酮，1 ∶0、10 ∶1、5 ∶1、3 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶0)梯度洗脫得7個組分：Fr1(49.0 g)、Fr2(64.3 g)、Fr3(7.2 g)、Fr4(6.4 g)、Fr5(5.5 g)、Fr6(15.6 g)和Fr7(10.1 g)，其中Fr1和Fr2主要為油脂類和麥角甾醇類物質(zhì)。Fr3經(jīng)過正相(石油醚 ∶丙酮，5 ∶1)洗脫得到5個組分(Fr3-1～Fr3-5)，F(xiàn)r3-3和Fr3-4分別經(jīng)過Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得到化合物10(10 mg)和化合物11(13 mg)；Fr4經(jīng)過正相(石油醚 ∶乙酸乙酯，10 ∶1)洗脫得到7個組分(Fr4-1～Fr4-7)，其中Fr4-2經(jīng)過正相(氯仿 ∶丙酮，30 ∶1)洗脫得到化合物4(17 mg)，F(xiàn)r4-4經(jīng)過Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇，3 ∶2)得到化合物6(5 mg)，F(xiàn)r4-5經(jīng)過正相(石油醚 ∶乙酸乙酯，5 ∶1)和Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得到化合物7(7 mg)和8(8 mg)；Fr-5經(jīng)過Sephadex LH-20(甲醇)和HPLC(20%甲醇-水)得到化合物5(4 mg)和9(5 mg)；Fr-6經(jīng)過Sephadex LH-20(甲醇)洗脫再經(jīng)過HPLC(10%甲醇-水)得到化合物1(10 mg)和化合物2(11 mg)；Fr-7經(jīng)過正相(氯仿 ∶甲醇，20 ∶1)洗脫，再經(jīng)過HPLC(10%甲醇-水)得到化合物3(7 mg)。

1.2.3抗菌活性測定 參考文獻(xiàn)[6-7]的方法，采用96孔板法分別檢測各化合物對大腸桿菌(EscherichiacoliATCC25922)和金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC25923)的最低抑菌濃度(MIC)。將復(fù)蘇后的細(xì)菌接種至MH(B)培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，然后采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄏ♂尲?xì)菌濃度至(5～10)×108CFU/L備用。采用5%的DMSO無菌水溶液將各化合物溶解配置成512 mg/L的母液，用無菌蒸餾水稀釋至所需濃度。實驗中以環(huán)丙沙星作為陽性藥，5% DMSO無菌水溶液作為陰性對照。加樣后在37 ℃下培養(yǎng)18 h，最后加入終濃度為0.25% TTC作為微生物生長指標(biāo)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，讀取化合物的MIC值。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1化合物1白色粉末，1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)δ: 7.82 (1H, d,J= 1.1 Hz, H-6), 6.28 (1H, t,J= 6.9 Hz, H-1′), 4.39 (1H, m, H-3′), 3.90 (1H, m, H-4′), 3.75 (2H, m, H-5′), 2.22 (2H, m, H-2′), 1.88 (3H, brs, 5-CH3)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ: 166.6 (C-2), 152.6 (C-4), 138.3 (C-6), 111.7 (C-5), 88.9 (C-4′), 86.4 (C-1′), 72.7 (C-3′), 62.9 (C-5′), 41.3 (C-2′), 12.6 (5-Me)。ESI-MSm/z: 243.0 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報道的胸腺嘧啶核苷(thymidine)波譜數(shù)據(jù)基本一致。

2.1.2化合物2白色粉末，1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)δ： 8.05 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-6), 5.91 (1H, d,J= 3.7 Hz, H-1′), 5.65(1H, d,J= 8.2 Hz, H-5), 4.20 (1H, m, H-3′), 3.94 (1H, m, H-4′), 3.82 (2H, m, H-5′), 3.70 (1H, dd,J= 12.0 Hz, 4.0 Hz, H-2′), 3.48 (3H, s, -OCH3)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ： 166.5 (C-4), 152.4 (C-2), 142.6 (C-6), 102.6 (C-5), 88.9 (C-1′), 86.2 (C-4′), 85.1 (C-2′), 69.9 (C-3′), 61.7 (C-5′), 58.9 (2′-OCH3)。ESI-MSm/z: 257.0 [M-H]-。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道的2′-O-甲氧基尿嘧啶核苷(2′-O-methyluridine)波譜數(shù)據(jù)基本一致。

2.1.3化合物3白色粉末，1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ： 7.87 (1H, d,J=8.2 Hz, H-6), 5.77 (1H, d,J= 6.0 Hz, H-1′), 5.63 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-5), 4.02 (1H, d,J= 5.0 Hz, H-2), 3.95 (1H, d,J= 3.5 Hz, H-3′), 3.83 (1H, dd,J= 3.5 Hz, H-4′), 3.60 (1H,d,J= 12.0 Hz, H-5′a), 3.52 (1H, d,J= 12.0 Hz, H-5′b)。13C-NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ：150.9 (C-2), 163.4 (C-4), 101.9(C-5), 140.9 (C-6), 87.9 (C-1′), 70.0 (C-2′), 73.7(C-3′), 84.9 (C-4′), 60.9(C-5′)。ESI-MSm/z： 243.0 [M-H]-。以上數(shù)據(jù)與已知文獻(xiàn)[10]報道的尿嘧啶核苷(uridine)波譜數(shù)據(jù)基本一致。

2.1.4化合物4白色固體，1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz)δ：9.79 (1H, s, -CHO), 7.75 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-2, 6), 6.92 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3, 5)。13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz)δ：115.82 (C-3, 5), 128.42 (C-1), 132.09 (C-2, 6), 163.30 (C-4), 190.95 (-CHO)。ESI-MSm/z：121.0 [M-H]-。以上數(shù)據(jù)與已知文獻(xiàn)[11]報道的對羥基苯甲醛(4-hydroxybenzaldehyde)波譜數(shù)據(jù)基本一致。

2.1.5化合物5無色油狀，1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ： 11.76 (1H, s, OH-C3),7.23 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-6), 6.70 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-5′), 6.63 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-3′), 6.35 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-4), 2.69 (3H, s, H-7′)。13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ：25.3 (C-7′), 97.2 (C-2), 100.9 (C-4), 101.6 (C-3′), 104.5 (C-6), 108.9 (C-1′), 117.6(C-5′), 138.1(C-1), 152.7(C-2′), 158.5(C-4′), 164.1(C-7), 164.8(C-5), 165.9(C-3)。ESI-MSm/z：256.9 [M-H]-。以上數(shù)據(jù)與已知文獻(xiàn)[12]報道的alternariol波譜數(shù)據(jù)基本一致。

2.1.6化合物6無色油狀，1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ：7.54 (1H, dd,J= 7.5, 8.4 Hz, H-7), 7.05 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-8), 6.90 (1H, dd,J= 8.4, 0.8 Hz, H-6), 4.52 (2H, m, H-2, H-3), 1.43 (3H, d,J= 6.3 Hz, CH3-2)。13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ：170.4 (C-4), 163.0 (C-5), 144.3 (C-8a), 137.9 (C-7), 117.9 (C-6), 108.2 (C-4a), 81.8 (C-2), 69.6 (C-3), 18.3 (C-2a)。ESI-MSm/z: 193.0 [M-H]-。以上數(shù)據(jù)與已知文獻(xiàn)[13]報道的2-甲基-3,5-羥基色酮波譜數(shù)據(jù)基本一致。

2.1.7化合物7黃色固體，1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ： 7.41 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-6), 5.60 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-5)。13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 167.5 (C-1), 143.7 (C-5), 101.9 (C-6)。ESI-MSm/z：111.2 [M-H]-。以上數(shù)據(jù)與已知文獻(xiàn)[13]報道的尿嘧啶(uracil)波譜數(shù)據(jù)基本一致。

2.1.8化合物8白色固體，1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ：1.35 (3H, d,J= 6.2 Hz, H-9), 2.81 (2H, m, H-4), 3.78 (3H, s, H-10), 4.46 (1H, m, H-3), 6.79 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-5), 6.95 (1H, d,J= 8.5, H-7), 7.42 (1H, dd,J= 8.5, 7.6 Hz, H-6)。13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ：20.9 (C-9), 36.7 (C-4), 56.5 (C-10), 76.3 (C-3), 112.3 (C-7), 114.2 (C-8a), 120.7(C-5), 136.5 (C-6), 143.9 (C-4a), 162.7 (C-8), 165.6 (C-1)。ESI-MSm/z： 193.1 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與已知文獻(xiàn)[14]報道的(-)-(3R)-mellein methyl ether波譜數(shù)據(jù)基本一致。

2.1.9化合物9白色粉末，1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)δ： 6.32 (1H, s, H-4), 6.26 (2H, brs, H-5, H-7), 4.17 (1H, m, H-2′), 3.97 (1H, m, H-4′), 2.59 (1H, dd,J= 14.5, 4.9Hz, H-1′), 2.54 (1H, dd,J= 14.5, 8.0 Hz, H-1′), 1.54 (2H, m, H2-3′), 1.15 (3H, d,J= 6.0 Hz, CH3-5′)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ：24.53 (C-5′), 43.11 (C-1′), 47.13 (C-3′), 65.32 (C-4′), 67.12 (C-2′), 100.00 (C-9), 102.7 (C-7), 103.8 (C-5), 107.3 (C-4), 141.4 (C-10), 156.3 (C-3), 164.9 (C-8), 167.4(C-6), 168.0 (C-1)。ESI-MSm/z：279.1 [M-H]-。以上數(shù)據(jù)與已知文獻(xiàn)[15]報道的3-(2R,4S-dihydroxypentyl)-6,8-dihydroxyisocoumarin波譜數(shù)據(jù)基本一致。

2.1.10化合物10黃色油狀，1H-NMR (Acetone-d6, 400 MHz)δ： 7.03 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-2′, H-6′), 6.71 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-3′, H-5′), 4.13 (2H, t,J= 7.1 Hz, H2-1), 2.78 (2H, t,J= 7.1 Hz, H2-2), 1.92 (3H, s, Me)。13C-NMR (Acetone-d6, 100 MHz)δ： 20.9 (Me), 34.8 (C-2), 65.8 (C-1), 116.2 (C-3′,4′), 129.6 (C-1′), 130.8 (C-2′,6′), 156.8 (C-4′), 171.3 (C=O)。ESI-MSm/z： 179.1 [M-H]-。以上數(shù)據(jù)與已知文獻(xiàn)[16]報道的 2-(4-hydroxyphenyl)ethylacetate波譜數(shù)據(jù)基本一致。

2.1.11化合物11白色片狀晶體，1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)δ： 7.01 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-4, H-8), 6.73 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-5, H-7), 3.69 (2H, t,J= 7.1 Hz, H2-1), 2.71 (2H, t,J= 7.1 Hz, H2-2)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ: 39.5 (C-2), 64.7 (C-1), 116.3 (C-5, C-7), 131.0 (C-4, C-8), 131.2 (C-3), 156.7 (C-6)。ESI-MSm/z：139.0 [M+H]+。以上數(shù)據(jù)與已知文獻(xiàn)[17]報道的對羥基苯乙醇[4-(2-hydroxyethyl)phenol]波譜數(shù)據(jù)基本一致。

2.2 抗菌活性

對已分離得到的11個化合物分別采用96孔板二倍稀釋法對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗菌活性測試，結(jié)果顯示，化合物5對大腸桿菌MIC為16 mg/L，對金黃色葡萄球菌MIC為32 mg/L；化合物6、8、9僅對大腸桿菌具有抑制作用，MIC均為32 mg/L(陽性藥環(huán)丙沙星對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為4 mg/L)。其余化合物的MIC均>32 mg/L。

3 討論

頭花蓼屬于蓼科蓼屬多年生草本植物，是貴州省地道藥材，臨床上主要用于泌尿系統(tǒng)感染[18]?，F(xiàn)代研究表明，頭花蓼及其制劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球、淋球菌、幽門螺旋桿菌以及多重耐藥菌等具有非常突出的抗菌活性[19-23]。鑒于植物內(nèi)生菌直接參與宿主次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)宿主次生代謝產(chǎn)物的形成[24-25]，內(nèi)生菌本身也能產(chǎn)生豐富的活性次生代謝產(chǎn)物[26-27]，因此頭花蓼內(nèi)生菌次生代謝物可能是尋找抗菌活性小分子的重要資源。

Diaporthe屬真菌為植物中廣泛存在的內(nèi)生菌[28]，前期篩選發(fā)現(xiàn)，從頭花蓼中獲得的內(nèi)生菌Diaporthesp.與頭花蓼一樣，也具有較好的抗菌作用。本研究從該內(nèi)生真菌中分離得到11個代謝產(chǎn)物，其中7個化合物(1～3或7～10)為Diaporthe屬的首次報道。進(jìn)一步的抗菌活性測試證實，其中的4個化合物(5、6、8、9)具有顯著的抗菌活性，是Diaporthesp.內(nèi)生菌的抗菌活性物質(zhì)。這些發(fā)現(xiàn)不僅豐富了真菌Diaporthe屬的化合物庫，說明具有抗菌作用的苗藥頭花蓼中的內(nèi)生菌也能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，為苗藥頭花蓼內(nèi)生真菌的開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。