楊佩佩 楊羽晨 張強

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科 南昌 330006

尼古丁是煙草燃燒時產(chǎn)生的有毒化學(xué)物質(zhì)之一，有很強的中樞神經(jīng)毒性和器官毒性。動物實驗表明，尼古丁暴露在體內(nèi)體外會產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，被認為是導(dǎo)致疾病的重要因素。尼古丁可通過激活氧自由基來抑制成骨細胞分化和誘導(dǎo)破骨細胞吸收參與骨重塑[1]。流行病學(xué)和臨床研究[2]發(fā)現(xiàn)，吸煙與骨量減少和骨折風(fēng)險增加之間存在一定程度的關(guān)聯(lián)。因此，探索尼古丁對破骨細胞及其誘導(dǎo)因子的影響具有重要的意義。

破骨細胞由破骨細胞前體形成，破骨細胞前體是來源于脾和肝臟的祖細胞，其相互融合形成多核破骨細胞。破骨細胞對骨質(zhì)的改建發(fā)揮著著重要的作用。本文就尼古丁對破骨細胞作用的研究進展進行綜述。

1 尼古丁對臨床牙周疾病的意義

牙周炎是一種由微生物菌斑和環(huán)境因素共同引起的多因素疾病，最終會導(dǎo)致牙周結(jié)締組織和牙槽骨的破壞，細菌是牙周炎的始動因子，但宿主對致病性感染的反應(yīng)在疾病進展中至關(guān)重要[3]。流行病學(xué)和臨床資料[4]表明，吸煙是牙周炎進展過程中的重要危險因素之一，在無牙周干預(yù)的6個月內(nèi)，吸煙人群與非吸煙人群相比，菌斑、結(jié)石以及牙齦炎癥、探診出血的風(fēng)險相對增加。研究[5]表明，吸煙與牙周炎的發(fā)展呈顯著的正相關(guān)，包括牙周袋形成，附著喪失，牙槽骨吸收，牙齒脫落。

尼古丁是煙草中的有毒化學(xué)物質(zhì)之一。Chang等[6]研究尼古丁以劑量依賴性的方式抑制人牙周韌帶成纖維細胞生長、增殖和蛋白質(zhì)合成，證實尼古丁對牙周膜成纖維細胞的細胞毒性作用，表明尼古丁對牙周膜組織具有破壞作用。Kubota等[7]通過小鼠模型研究尼古丁和煙冷凝物對結(jié)扎性牙周炎牙槽骨破壞的影響，發(fā)現(xiàn)尼古丁和煙冷凝物可加重結(jié)扎性牙周炎的牙槽骨丟失，同時伴有破骨細胞生成和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）表達的增加，并抑制牙槽骨的修復(fù)。

治療牙周病的最終目標是重建具有功能學(xué)和結(jié)構(gòu)學(xué)的牙周組織（包括牙槽骨、牙齦、牙周膜和牙骨質(zhì)），而牙槽骨的再生作為治療牙周病中至關(guān)重要的一步，其形態(tài)發(fā)生及重建主要在于成骨細胞和破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收過程。因此，研究尼古丁對破骨細胞的調(diào)控機制對口腔臨床研究至關(guān)重要。

2 尼古丁對破骨細胞的調(diào)控機制

2.1 尼古丁對RANKL相關(guān)信號通路的影響

20世紀90年代中期，核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）-RANKL-骨保護素（osteoprotegerin，OPG）系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)用于調(diào)節(jié)骨吸收。RANKL/RANK系統(tǒng)對成熟破骨細胞的形成至關(guān)重要，是T細胞介導(dǎo)的破骨細胞發(fā)生的關(guān)鍵因素。

RANKL是RANK的配體，是一種Ⅱ型同源三聚體跨膜蛋白，已公認的作用為通過成骨細胞基質(zhì)細胞誘導(dǎo)RANKL的表達從而刺激破骨細胞的形成。而且，其在淋巴結(jié)、胸腺、乳腺和肺中也有高表達，在包括脾臟和骨髓在內(nèi)的多種其他組織中有低水平表達[8]。

RANK是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體超家族的同型三聚體跨膜蛋白成員，可以表達于破骨細胞前體、成熟的破骨細胞和樹突狀細胞，也可表達于乳腺中[9]。

OPG可由成骨細胞分泌，還可由心臟、腎臟、肝臟和脾的細胞分泌。

研究[10]報告顯示，B細胞分泌的OPG可能占總量的64%，B細胞缺乏的小鼠易患骨質(zhì)疏松。成骨細胞在破骨細胞表面與RANK結(jié)合后，產(chǎn)生RANKL以及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TNF receptor associated factor，TRAF）2、5、6，連接RANK在細胞質(zhì)域內(nèi)的特異性位點，基于對TRAF2、TRAF5和TRAF6缺陷小鼠的觀察，發(fā)現(xiàn)其中只有TRAF6缺陷小鼠發(fā)生了骨硬化病，隨后，多種信號通路包括核因子（nuclear factor，NF）-κB、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinase，ERK）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）被激活。而活化的NF-κB易位進入細胞核，與活性T細胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）C1相互作用，啟動破骨基因的轉(zhuǎn)錄，形成破骨細胞[11]。OPG可以阻止RANK與RANKL的結(jié)合，因此RANKL與OPG的比例決定著RANKL的生物學(xué)功效及其對破骨細胞形成的作用。人牙周膜細胞表達并分泌OPG和RANKL，提示它們可能通過OPG/RANKL系統(tǒng)調(diào)節(jié)牙槽骨代謝[12]。

Lee等[13]研究表明，通過采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和Western blotting檢測尼古丁處理的人牙周膜細胞中成骨細胞標志物RANKL、OPG和抗氧化防御酶的表達。采用RT-PCR觀察尼古丁對RANKL、OPG等成骨細胞標志物mRNA表達的影響，結(jié)果顯示尼古丁顯著降低堿性磷酸酶、骨橋蛋白、骨鈣素mRNA在人牙周膜細胞中的表達。在尼古丁濃度為0～15 mmol·L-1的細胞中，RANKL的上調(diào)和OPG的下調(diào)均呈濃度依賴性；加入尼古丁10 mmol·L-1后，人牙周膜細胞中RANKL mRNA表達上調(diào)，OPG mRNA表達下調(diào)。由此可以說明尼古丁能激活破骨細胞調(diào)節(jié)分子RANKL和OPG，抑制牙周膜細胞中成骨細胞的分化。

2.2 尼古丁對巨噬細胞集落刺激因子的刺激

巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）主要存在于骨髓腔內(nèi)，對單核細胞的增殖、分化及維持其活性有重要作用。M-CSF可在間充質(zhì)細胞如成纖維細胞、成骨細胞及內(nèi)皮細胞中合成，也可在激活的巨噬細胞、B細胞、T細胞及多種腫瘤細胞中產(chǎn)生，可誘導(dǎo)破骨細胞發(fā)生，調(diào)節(jié)破骨細胞活性，抑制破骨細胞凋亡[14]。

革蘭陰性菌產(chǎn)生的脂多糖是其細胞壁的組成成分之一，被認為是重要的致病因素。脂多糖的功能之一是刺激破骨細胞的骨吸收[15]。研究[16]表明，牙周炎牙槽骨破壞的原因之一是菌斑中革蘭氏陰性菌脂多糖作用。Tanaka等[17]研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁或尼古丁+脂多糖的加入對破骨細胞形成產(chǎn)生影響。人骨肉瘤細胞（Saos-2細胞）在尼古丁或尼古丁+脂多糖影響下與對照組相比，可以抑制堿性磷酸酶的活性，而M-CSF的表達量與前列腺素E2呈劑量依賴性上升。相反，OPG的表達呈劑量依賴性下降。實驗結(jié)果表明，尼古丁與脂多糖的結(jié)合通過增加M-CSF和前列腺素E2的產(chǎn)生而促進破骨細胞的形成，同時減少成骨細胞OPG的產(chǎn)生。

有研究[18]顯示，在一定范圍內(nèi)，在RANKL存在的條件下，M-CSF可誘導(dǎo)抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）陽性破骨細胞成熟，并伴隨M-CSF劑量的增加，TRAP陽性破骨細胞數(shù)明顯增加。而在M-CSF存在下進行培養(yǎng)的人外周血單核細胞，可表現(xiàn)出較高水平的TRAP活性、破骨細胞相關(guān)基因的表達和骨吸收活性；在破骨細胞分化活躍的破骨細胞前體中，低濃度尼古?。?2 μg·L-1）可導(dǎo)致TRAP活性和基因表達增加，特別是在活化因子c-Src存在的情況下[19]。研究[20]發(fā)現(xiàn)，M-CSF對骨髓中的髓系祖細胞、單核吞噬細胞祖細胞、破骨細胞以及血管中單核細胞均具有調(diào)節(jié)作用。M-CSF通過與其獨特的受體結(jié)合誘導(dǎo)生物應(yīng)答，CSF-1受體中的7個酪氨酸殘基被磷酸化，從而觸發(fā)下游信號級聯(lián)，包括有絲分裂原活化蛋白激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular regulated protein kinase kinaes，MEK）/ERK和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/Akt，對破骨細胞增殖具有重要作用，而PI3K的激活對破骨細胞的存活有重要的意義[20-21]。

2.3 尼古丁對膽堿能抗炎通路的影響

TNF-α不僅是種促炎因子，還是損傷后天然免疫反應(yīng)的重要組成部分，參與了骨吸收的正常調(diào)節(jié)過程。

有研究[22]顯示，敲除TNF-α受體基因的小鼠軟骨內(nèi)組織吸收延遲2～3周，提示TNF-α介導(dǎo)的軟骨細胞凋亡以及控制破骨細胞軟骨內(nèi)組織重塑的促吸收細胞因子的表達。Chen等[23]認為，α7煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）是最重要的炎癥治療靶點，其主要表達于免疫細胞（包括單核細胞、巨噬細胞、T和B淋巴細胞、樹突狀細胞）的細胞膜和成纖維細胞樣滑膜。總之，α7nAChR通過與煙堿激動劑（尼古丁、乙酰膽堿等）聯(lián)合作用于免疫細胞，通過觸發(fā)各種信號機制（其中包括JAK2-STAT3和NF-κB信號通路）相互作用，達到抗炎作用。吸煙釋放的尼古丁可能與α7nAChR結(jié)合，激活抗炎途徑，JAK2-STAT3信號通路被激活，NF-κB信號通路被抑制。因此，TNF-α的產(chǎn)量將大大減少，從而導(dǎo)致骨折愈合時間延長。

蒙超龍等[24]通過觀察不同濃度TNF-α對人牙周膜干細胞的增殖及成骨向分化的影響，提示在牙周炎癥微環(huán)境中，不同含量的TNF-α可對人牙周膜干細胞的增殖活性及分化產(chǎn)生不同的影響，低濃度的TNF-α可促進人牙周膜干細胞中成骨向分化相關(guān)基因（如OPN、BSP）的表達，而高濃度的TNF-α可使人牙周膜干細胞中上述各成骨向分化相關(guān)基因的表達水平均較對照組明顯下調(diào)。TNF-α通過TNFR1和TNFR2這2個細胞表面受體（也稱為TNFRP55和TNFRP75）誘導(dǎo)大量的生物反應(yīng)，TNFR1和TNFR2都能傳遞細胞內(nèi)的信號，刺激NF-κB的細胞質(zhì)抑制劑IKB的分解。活化的NF-κB隨后被轉(zhuǎn)移到細胞核中，在細胞核內(nèi)誘導(dǎo)多個TNF-α反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[25]。

據(jù)報道，TNF-α可通過激活成熟的破骨細胞，或通過刺激破骨細胞前體的增殖和分化，或間接通過對成骨細胞的主要作用，在體外和體內(nèi)促進骨吸收。Azuma等[26]研究結(jié)果顯示TNF-α可強烈誘導(dǎo)MDBM細胞（M-CSF依賴性骨髓巨噬細胞）分化為成熟破骨細胞，同時在TNF-α處理下，也可形成TRAP陽性多核細胞。

2.4 尼古丁對其他骨吸收細胞因子及骨組織形態(tài)計量學(xué)的影響

骨細胞因子是在骨骼單位內(nèi)介導(dǎo)細胞與細胞間相互作用中起關(guān)鍵作用的可溶性因子，在骨代謝單位的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，促進骨吸收的細胞因子有白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6等[27]。Hapidin等[28]研究發(fā)現(xiàn)，用尼古丁處理Sprague-Dawley雄鼠4個月后，血清IL-1、IL-6和可替寧水平較預(yù)處理前顯著升高，提示尼古丁可促進骨吸收，而骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)顯示尼古丁組未達到正常骨結(jié)構(gòu)。破骨細胞表面、侵蝕表面和單標記表面（骨吸收指標）升高所顯示的破骨細胞骨吸收過度，骨小梁微結(jié)構(gòu)惡化，導(dǎo)致骨吸收。且尼古丁處理組骨小梁相對體積、骨小梁厚度、雙向熒光標記表面和礦化沉積率（骨形成指標）均低于對照組。結(jié)果說明，尼古丁暴露導(dǎo)致氧化應(yīng)激，導(dǎo)致自由基產(chǎn)生增加，抗氧化水平降低。尼古丁誘導(dǎo)破骨細胞分化，促進細胞因子IL-1和IL-6的促進骨吸收作用，由于破骨細胞被自由基激活，而且破骨細胞本身也能產(chǎn)生自由基吸收骨。

3 小結(jié)

破骨細胞形成于一個錯綜復(fù)雜細胞串擾的網(wǎng)絡(luò)，涉及了許多信號分子，主要包括激活因子M-CSF和RANKL，以及一些其他的促進骨吸收的細胞因子IL-1、IL-6等，酪氨酸激酶c-Src也是破骨細胞活化網(wǎng)絡(luò)中的一個重要中介物。一旦被激活，破骨細胞開始將H+運輸?shù)郊毎獾墓潜砻妫g骨表面羥磷灰石晶體，同時可以分泌溶解酶（尤其是組織蛋白酶K），降解骨基質(zhì)的有機成

分[29]。

吸煙與骨質(zhì)疏松癥和牙槽骨喪失等多種骨骼疾病密切相關(guān)，而尼古丁作為煙草中有毒化學(xué)物質(zhì)之一，可以通過多種通路調(diào)控成骨細胞和破骨細胞的分化和礦化，表明尼古丁在調(diào)節(jié)骨代謝中具有特殊作用。而且尼古丁可影響牙周膜細胞中堿性磷酸酶、骨橋蛋白、骨鈣素mRNA的表達，與牙周炎的發(fā)展呈顯著的正相關(guān)，因此對于牙周炎患者進行有效的戒煙干預(yù)措施，對牙周病的治療及提高治療效果具有積極作用。