王小姣，李夢雅，王世梅

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省有機(jī)固體廢棄物協(xié)同創(chuàng)新中心教育部資源節(jié)約型肥料工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095)

白刺鏈霉菌(Streptomycesalbospinus)CT205是本實(shí)驗(yàn)室分離保存的1株拮抗放線菌，其生防制劑防控黃瓜枯萎病、草莓根腐病等效果顯著[1-2]。孫敏等[3]對S.albospinusCT205發(fā)酵液中活性物質(zhì)物質(zhì)進(jìn)行了分離純化，并借助色譜分析，確定活性物質(zhì)為環(huán)己酰亞胺 (Cycloheximide)，又稱放線酮。在農(nóng)業(yè)應(yīng)用上，環(huán)己酰亞胺主要用于植物病蟲害的防控[4-6]，在醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，環(huán)己酰亞胺主要作為蛋白質(zhì)合成抑制劑，應(yīng)用于蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡機(jī)制等代謝調(diào)控方面的研究[7-9]。建立定量、快速檢測菌株CT205發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì)環(huán)己酰亞胺含量的方法，是亟需解決的問題。本研究利用高效液相色譜法(HPLC)、生物活性法及分光光度法等檢測手段分別測定菌株CT205發(fā)酵上清液及粗提物中活性物質(zhì)的含量，以期建立合適的檢測方法，為菌株CT205的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 白刺鏈霉菌(Streptomycesalbospinus)CT205；啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，本實(shí)驗(yàn)室分離保存[2]。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g(去皮)，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，去離子水定容至1 000 mL，pH值自然；②種子培養(yǎng)基: 黃豆粉30.0 g，葡萄糖45.0 g，酵母粉5.0 g，CaCO35.0 g，去離子水1 000 mL，pH值7.5；③發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉30.0 g，蔗糖20.0 g，黃豆粉8.0 g，CaCO33.0 g，蛋白胨2.0 g，NaCl 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4·7H2O 0.5 g，去離子水1 000 mL，pH 8.0。

1.1.3 試劑與儀器 環(huán)己酰亞胺標(biāo)準(zhǔn)品(北京索萊寶科技有限公司)，甲醇、乙酸乙酯(色譜純)，其他試劑均國產(chǎn)分析純試劑(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀(柱子ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6 mm×100 mm，3.6-Micron，Agilent公司)，離心機(jī) (Eppendorf-5424 R，德國 Eppendorf 公司)，酶標(biāo)儀(Spectra Max i3x，美谷分子(上海)儀器有限公司)，Greiner Bio-one 96孔板(UV-STAR Microplate 96 Well，格瑞納生物科技(上海)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株CT205液體發(fā)酵及活性物質(zhì)粗提物制備 取菌株CT205新鮮斜面，用接種環(huán)刮取1～2環(huán)CT205孢子接種于含50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，28 ℃、170 r/min培養(yǎng)48 h，鏡檢觀察菌絲形態(tài)。將新鮮的液體種子按10% (體積分?jǐn)?shù))接種量接種于含200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中，28 ℃，170 r/min 培養(yǎng)96 h，4 ℃，8 000 r/min離心10 min，取上清液備用。取100 mLV(上清液)∶V(乙酸乙酯)=1∶1混合，震蕩萃取，8 000 r/min離心5 min，取酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，3.0 mL甲醇洗脫溶解所得物質(zhì)為活性物質(zhì)粗提物。

1.2.2 環(huán)己酰亞胺標(biāo)品制備 精確稱取100.0 mg環(huán)己酰亞胺標(biāo)準(zhǔn)品，先用少量無菌去離子水溶解，然后加入無菌去離子水配置成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液。取50 mL容量瓶9只，向各瓶內(nèi)分別加入不同量的1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，去離子水定容至刻度，制備含環(huán)己酰亞胺10、20、30、40、50、60、70、80、90 μg/mL系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

1.2.3 高效液相色譜法(HPLC)測定環(huán)己酰亞胺含量 取系列濃度的環(huán)己酰亞胺標(biāo)準(zhǔn)品，使用高效液相色譜儀，在柱溫30 ℃，流動相V(MeOH)∶V(H2O)= 55∶45條件下，等度洗脫，檢測波長215 nm，進(jìn)樣量5 μL，分析時間10 min，記錄峰面積，橫坐標(biāo)X軸為環(huán)己酰亞胺濃度，縱坐標(biāo)Y軸為峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程。并在該條件下測定粗提物及發(fā)酵上清液中活性物質(zhì)的含量。

1.2.4 生物活性法測定環(huán)己酰亞胺含量 ①指示菌啤酒酵母菌懸液制備：將酵母菌接種于PDA液體培養(yǎng)基(不加瓊脂)中，28 ℃、170 r/min 培養(yǎng)48 h，顯微計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為108個/mL，備用。②雙層平板制備：取直徑150 mm，高30 mm的培養(yǎng)皿，下層倒入50 mL 2%的水瓊脂保證底部平整，取2 mL的酵母菌(108個/mL)加入100 mL PDA培養(yǎng)基(55～60 ℃)混勻，倒入底層平板上，制備雙層平板。在雙層平板上等距離均勻放置無菌牛津杯，分別加入200 μL系列濃度的標(biāo)品溶液，無菌去離子水作為空白對照，28 ℃培養(yǎng)，5次重復(fù)試驗(yàn)。③抑菌圈測量記錄：待雙層平板上出現(xiàn)抑菌圈后，測量抑菌圈直徑大小，以不同濃度環(huán)己酰亞胺為橫坐標(biāo)，抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程。并用此法測定粗提物及發(fā)酵上清液中活性物質(zhì)的含量。

1.2.5 分光光度法測定環(huán)己酰亞胺含量 取1.2.2中制備的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，分別取200 μL加入96孔板中，在酶標(biāo)儀λ=215 nm處測得各稀釋液的吸光度(A)，以不同濃度環(huán)己酰亞胺為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程。并用此法測定粗提物及發(fā)酵上清液中活性物質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC測定環(huán)己酰亞胺含量方法的建立

環(huán)己酰亞胺經(jīng)紫外掃描在λ=215 nm處有最大吸收峰[3](圖1)，1 mg/mL環(huán)己酰亞胺標(biāo)樣HPLC圖譜見圖2，在215 nm波長下可分離得到4個峰，多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在相同的HPLC條件下，環(huán)己酰亞胺均出現(xiàn)相同的4個峰，由表1可見2.417 min出現(xiàn)的最大吸收峰，峰面積占98.23%，1.053、2.034 min出現(xiàn)的2個小峰可能是溶劑峰，可以確定環(huán)己酰亞胺的出峰時間為2.417 min。從表2可以看出，環(huán)己酰亞胺系列稀釋液的出峰時間均在2.41 min左右，0～90 μg/mL環(huán)己酰亞胺的峰面積與濃度建立的回歸方程：Y= 4.083 6 x+ 16.513，R2= 0.999 2，二者間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(圖3)。說明HPLC法測定環(huán)己酰亞胺的可行性。

圖1 環(huán)己酰亞胺紫外吸收光譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectra of Cycloheximide

圖2 1 mg/mL環(huán)己酰亞胺標(biāo)樣HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrogram of 1 mg/mL Cycloheximide standard sample

表1 HPLC檢測環(huán)己酰亞胺標(biāo)品出峰情況

表2 HPLC檢測系列濃度環(huán)己酰亞胺的峰面積值

圖3 HPLC測定環(huán)己酰亞胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The determination of Cycloheximide content standard curve by HPLC method

在相同條件下，菌株CT205發(fā)酵上清液經(jīng)HPLC檢測，在2.413 min出現(xiàn)吸收峰(與標(biāo)樣的出峰時間2.417 min相差0.04 min)，峰面積314.1 mAU*s。粗提物經(jīng)HPLC檢測，在2.396 min出現(xiàn)吸收峰(與標(biāo)樣的出峰時間2.417 min相差0.021 min)，峰面積6 369.4 mAU*s。將數(shù)值分別帶入回歸方程，計算上清液活性物質(zhì)的含量為72.87 μg/mL，粗提物中活性物質(zhì)的含量為1 555.70 μg/mL。

2.2 生物活性法測定環(huán)己酰亞胺含量方法的建立

生物活性測定法檢測抗生素含量能反映真實(shí)的生物學(xué)效應(yīng)。由表3和圖4可見，當(dāng)環(huán)己酰亞胺標(biāo)樣質(zhì)量濃度在0～90 μg/mL時與酵母菌拮抗圈直徑呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)線性穩(wěn)定，建立環(huán)己酰亞胺標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.029 3x+1.755 6，R2=0.993 7。

表3 不同系列濃度環(huán)己酰亞胺對應(yīng)的拮抗圈直徑

圖4 生物活性法檢測環(huán)己酰亞胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of Cycloheximide by bioactivity method

利用生物活性法檢測菌株CT205發(fā)酵上清液及粗提物中活性物質(zhì)的含量，粗提物用無菌水稀釋20倍，量取對酵母菌的拮抗圈直徑，分別帶入回歸方程，計算出上清液活性物質(zhì)的平均含量為66.15 μg/mL，粗提物中活性物質(zhì)的含量為1 259.00 μg/mL。

2.3 分光光度法測定環(huán)己酰亞胺含量方法的建立

環(huán)己酰亞胺的最大紫外吸收峰在λ=215 nm處，由表4和圖5可以看出，0～90 μg/mL系列濃度的環(huán)己酰亞胺與其在215 nm的吸光度(A)有較好的線性關(guān)系，建立的回歸方程為Y=0.004 8x+0.000 5，R2=0.996 5。取菌株CT205發(fā)酵上清液及粗提物進(jìn)行紫外掃描，在215 nm處均沒有典型吸收峰出現(xiàn)，CT205發(fā)酵上清液紫外吸收圖譜見圖6。

從圖6可以看出，CT205發(fā)酵上清液在215 nm處沒有典型吸收峰，說明發(fā)酵上清液中雜質(zhì)較多、活性物質(zhì)的含量較低。同樣，測定粗提取物紫外吸收圖譜，發(fā)現(xiàn)粗提取物在紫外吸收區(qū)域亦無典型吸收峰。因此，不能直接用分光光度法測定發(fā)酵上清液與粗提取物中活性物質(zhì)的含量。

表4 不同濃度的環(huán)己酰亞胺對應(yīng)的吸光度(A215)

圖5 紫外分光光度法測定環(huán)己酰亞胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard curve of Cycloheximide measured by UV spectrophotometry

圖6 CT205發(fā)酵上清液紫外吸收圖譜Fig.6 Ultraviolet absorption spectrum of fermentation supernatant from strain CT205

2.4 HPLC和生物活性法檢測環(huán)己酰亞胺含量方法比較

取離心得到的菌株CT206發(fā)酵上清液用HPLC和生物活性法檢測環(huán)己酰亞胺含量，由表5可以看出上清液HPLC及生物法檢測到環(huán)己酰亞胺的含量分別為72.87、66.15 μg/mL。兩種測定方法得到的結(jié)果存在一定的誤差，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HPLC測定結(jié)果與生物標(biāo)線法測定結(jié)果誤差為+6.72 μg/mL。理論上HPLC測定方法較生物標(biāo)線法準(zhǔn)確性高，靈敏度也高，但無法消除儀器設(shè)備的客觀影響，多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相同的樣品在不同時間段測定，樣品出峰時間存在一定偏差，如標(biāo)品出峰時間2.417 min，樣品2.413 min，甚至2.396 min，但誤差均在實(shí)驗(yàn)允許時間誤差間(±0.1 min)，因此測定樣品時，一般先測定標(biāo)品，再測定樣品。兩種測定方法平行6次檢測發(fā)酵液中環(huán)己酰亞胺含量，兩種測定方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD順序依次為RSD生物活性法>RSDHPLC法，說明HPLC測定結(jié)果具有更好的重現(xiàn)性、更高的可信度。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)t檢驗(yàn)法發(fā)現(xiàn)兩種測定方法實(shí)際測定同一樣品時環(huán)己酰亞胺的含量間存在顯著差異，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的測定方法。

表5 HPLC及生物活性法測定CT205菌株發(fā)酵液中環(huán)己酰亞胺含量方法比較Table 5 Comparison of HPLC and bioactivity method for the determination of Cycloheximide in the fermentation

3 討 論

放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，其代謝產(chǎn)物中具有抗生活性的物質(zhì)多達(dá)10 000余種，是新型抗生素開發(fā)的寶貴資源庫[10]。環(huán)己酰亞胺又名放線酮，是一種戊二酰類化合物，早在1948年由德國化學(xué)家Ford和 Leach從灰色鏈霉菌(S.griseus)中分離并鑒定出結(jié)構(gòu)[11]，后期也有學(xué)者在不同鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到[12-13]。環(huán)己酰亞胺作為廣譜抗生素在體外可以抑制大多數(shù)真核生物蛋白的合成，在防治農(nóng)作物真菌病害上應(yīng)用廣泛[14-15]?？股氐臋z測方法主要有生物法、色譜法、化學(xué)法[16-18]等。不同抗生素因其特有的特性官能團(tuán)，實(shí)際使用的檢測方法也千差萬別，同種抗生素可由不同生物產(chǎn)生，產(chǎn)量也存在差異，選擇適當(dāng)檢測手段，可以加快研究進(jìn)展。

本研究用三種方法檢測了菌株CT205發(fā)酵上清液及粗提物中活性物質(zhì)環(huán)己酰亞胺含量，三種方法檢測環(huán)己酰亞胺標(biāo)樣均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，其中HPLC法相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，較生物活性法與分光光度法具有更好地檢測吻合度。HPLC法具有靈敏度高，分離性能好，檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)際分析樣品時，需要有高效液相色譜儀(HPLC)，需要提前準(zhǔn)備流動相、平衡柱壓，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后沖洗柱子等，操作步驟繁瑣。生物活性測定法，選用酵母菌作為指示菌，其生長繁殖迅速，可一次性檢測多個樣品，抑菌圈能反映真實(shí)的生物學(xué)效應(yīng)，不需特殊設(shè)備，操作簡便，但不同實(shí)驗(yàn)人員操作存在差異，與HPLC測定結(jié)果相比精確度不高。分光光度法操作簡單，檢測快速，但是不適合用在特定波長沒有典型吸收峰，含有雜質(zhì)較多的樣品。

從方便實(shí)用的角度看，生物活性法適用于比較多批次菌株CT205發(fā)酵液中活性物質(zhì)含量及評估，如菌株的誘變篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化等，準(zhǔn)確度要求不高；HPLC法精確度高，可以精準(zhǔn)測定發(fā)酵液及粗提物中活性物質(zhì)含量，用于準(zhǔn)確定量測定；分光光度法僅適用純度較高的樣品測定。