劉仁?許曉明?羅勇?馮源發(fā)?周瑞?鐘惟德

【摘要】目的 分析甘油磷酸脫氫酶1樣抗原（GPD1L）在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法 選用包含79例腎透明細(xì)胞癌及10例腎臟正常組織的組織芯片，使用免疫組織化學(xué)染色法（免疫組化）檢測(cè)GPD1L蛋白的表達(dá)情況，并運(yùn)用癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)收集包含GPD1L mRNA資料的腎透明細(xì)胞癌患者相關(guān)資料。觀察組織芯片中腎臟正常組織與腎透明細(xì)胞癌組織GPD1L蛋白的表達(dá)部位及表達(dá)強(qiáng)度，分析TCGA中腎臟正常組織與腎透明細(xì)胞癌組織GPD1L基因的表達(dá)水平差異。按基因芯片或TCGA中腎透明細(xì)胞癌GPD1L蛋白或mRNA表達(dá)情況分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，分析腎透明細(xì)胞癌患者GDP1L蛋白或mRNA表達(dá)與臨床特征及總體生存期（OS）的關(guān)系。應(yīng)用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析腎透明細(xì)胞癌患者OS的影響因素。結(jié)果 組織芯片中，GPD1L蛋白陽(yáng)性染色呈棕黃色或褐色，在腎透明癌細(xì)胞與腎臟正常組織中主要表達(dá)于腎小管上皮的細(xì)胞胞質(zhì)中，GPD1L蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織表達(dá)強(qiáng)度低于其在正常腎臟組織中的表達(dá)強(qiáng)度（P < 0.001），GPD1L蛋白低表達(dá)組中病理分級(jí)高和臨床分期晚者比例高于高表達(dá)組（P均< 0.05）。TCGA中，腎透明細(xì)胞癌組織GPD1L mRNA表達(dá)水平低于腎臟正常組織（P < 0.05），GPD1L mRNA低表達(dá)組中女性、病理分級(jí)高、臨床分期晚、有轉(zhuǎn)移、死亡者比例均高于高表達(dá)者（P均< 0.05）， GPD1L mRNA低表達(dá)組OS低于高表達(dá)組（P < 0.001）。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示，GPD1L mRNA表達(dá)水平、年齡、腫瘤轉(zhuǎn)移為腎透明細(xì)胞癌OS的影響因素（P均< 0.05）。結(jié)論 GPD1L的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌密切相關(guān)，可考慮作為臨床診斷及預(yù)后的分子標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】腎透明細(xì)胞癌;甘油磷酸脫氫酶1樣抗原;預(yù)后

Expression and clinical significance of GPD1L in clear cell renal carcinoma Liu Ren， Xu Xiaoming， Luo Yong， Feng Yuanfa， Zhou Rui， Zhong Weide. Department of Urology Surgery， Guangzhou First Peoples Hospital， Guangdong Key Laboratory of Clinical Molecular Medicine and Diagnostics， Guangzhou Medical Univ-ersity， Guangzhou 510180， China

Corresponding author， Zhong Weide， E-mail： wdezhong@ 21cn. com

【Abstract】Objective To investigate the expression and clinical significance of GPD1L （glycerol-3-phophate dehydrogenase 1 like） in clear cell renal carcinoma.? Methods Tissue microarrays including 79 cases of clear cell renal carcinoma and 10 cases of normal tissuess were selected. The expression level of GPD1L protein was detected by immunohistochemistry. Relevant data including GPD1L mRNA data of patients were collected by the TCGA database. The expression location and intensity of GPD1L protein were quantitatively analyzed between two groups. The expression level of GPD1L mRNA was statistically compared between two groups in TCGA database. According to the expression levels of GPD1L protein and mRNA in the microarray or TCGA database， all patients were assigned into the high and low expression groups. The correlation between the expression of GPD1L mRNA， clinical features and overall survival （OS） was analyzed. The influencing factors of OS were identified by univariate and multivariate Coxs proportional hazard regression analyses.? Results In the tissue microarray， GPD1L protein was positively stained as yellow brown or brown， mainly expressed in the cell cytoplasm of the renal tubular epithelium of the clear cell renal carcinoma and normal renal tissues. The expression intensity of GPD1L protein in the clear cell renal carcinoma was significantly lower than that in normal renal tissues （P < 0.001）. The proportion of patients with high grade and late clinical stage in the low expression of GPD1L protein group was significantly higher compared with that in the high expression group （both P < 0.05）. In TCGA database， the expression level of GPD1L mRNA in the clear cell renal carcinoma tissues was remarkably lower than that in the normal renal tissues （P < 0.05）. In the low expression of GPD1L mRNA group， the proportion of female patients， those with high pathological grade， high clinical stage， metastasis and death was significantly higher compared with those in the high expression group （all P < 0.05）. In addition， the OS in the low expression group was significantly shorter than that in the high expression group （P < 0.001）. Coxs proportional hazard regression analysis demonstrated that the expression level of GPD1L mRNA， age and tumor metastasis were the influencing factors of the OS of patients （all P < 0.05）. Conclusion The expression of GPD1L is intimately correlated with clear cell renal carcinoma， which can be considered as a molecular marker for clinical diagnosis and prognosis.

【Key words】Renal clear cell carcinoma;GPD1L;Prognosis

腎細(xì)胞癌起源于腎臟表皮，90%的腎癌都屬于腎細(xì)胞癌。這種惡性腫瘤包括了超過(guò)10種組織和分子亞型，對(duì)后續(xù)的診斷和治療都造成了很大的困擾。腎透明細(xì)胞癌是腎細(xì)胞癌中最常見(jiàn)的類型，接近75%的腎細(xì)胞癌都是腎透明細(xì)胞癌，而且也是致死率最高的腎細(xì)胞癌種類[1]。雖然腎細(xì)胞癌的臨床治療研究在近年已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但是腎細(xì)胞癌的自然病史和預(yù)后都呈現(xiàn)多樣性，有的發(fā)展緩慢，有的可表現(xiàn)出高度的侵襲性[2]。臨床醫(yī)師需要通過(guò)早期診斷為患者提供最佳的個(gè)體化治療方案，所以尋找特異度高、靈敏度強(qiáng)的分子生物學(xué)指標(biāo)勢(shì)在必行。這既可以避免眾多醫(yī)療資源的浪費(fèi)，又可以客觀評(píng)估腫瘤的潛在轉(zhuǎn)移侵襲性和預(yù)后，對(duì)于腎透明細(xì)胞癌的個(gè)體化治療有著重要的意義[3]。

甘油三磷酸脫氫酶1樣抗原（GPD1L）的編碼蛋白是一種蛋白酶，催化甘油三磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岣视屯?。GPD1L編碼蛋白存在于與質(zhì)膜相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)中，在該處結(jié)合鈉通道、電壓門(mén)控、V型、α亞單位（SCN5a）。該基因的缺陷可導(dǎo)致布魯加達(dá)綜合征2型（BRS2）和嬰兒猝死綜合征（SIDS）[4]。近年來(lái)，非編碼RNA尤其是微小RNA（miR）和腫瘤之間的研究發(fā)展迅速，多項(xiàng)研究顯示miR-210可以靶向抑制GPD1L從而促進(jìn)了腫瘤在缺氧環(huán)境中的生長(zhǎng)，而同時(shí)miR-210又是缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）的下游靶點(diǎn)，在多種腫瘤生長(zhǎng)發(fā)展中起著重要作用[5]。業(yè)已證實(shí)，GPD1L在頭頸癌、肝細(xì)胞癌等腫瘤中扮演重要角色[6-7]。但是，GPD1L在腎細(xì)胞癌尤其是透明細(xì)胞癌中的作用還沒(méi)有相關(guān)的文章報(bào)道。組織芯片是將許多不同個(gè)體組織標(biāo)本以規(guī)則陣列方式排布于同一載體上，這樣可以在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行同一指標(biāo)的組織學(xué)研究，一次性實(shí)驗(yàn)即可獲得大量的結(jié)果。癌癥基因組圖譜（TCGA）公共數(shù)據(jù)庫(kù)是通過(guò)采用高通量基因組測(cè)序、基因芯片運(yùn)用多維數(shù)據(jù)整合分析方法將幾乎人類所有惡性腫瘤基因表達(dá)水平圖譜繪制出來(lái)的數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的研究可以為惡性腫瘤的診斷、分類標(biāo)準(zhǔn)和治療方法提供新的策略。本次采用的組織芯片包括79例腎透明細(xì)胞癌樣本及10例正常腎臟組織樣本，并利用TCGA中腎透明細(xì)胞癌的mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)分析，旨在研究GPD1L在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義。

材料與方法

一、材 料

組織芯片購(gòu)自西安艾麗娜生物科技有限公司（BC07115a）。每張芯片包含79例腎透明細(xì)胞癌標(biāo)本和10例正常腎臟組織標(biāo)本，所有病例均為接受腎癌切除手術(shù)治療，手術(shù)前均未接受放射治療或化學(xué)治療。所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)HE染色并由病理科醫(yī)師明確診斷。每例標(biāo)本均附有相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，如年齡、性別、病理分級(jí)、腫瘤分期，見(jiàn)表1。

二、數(shù)據(jù)下載

TCGA腎透明細(xì)胞癌數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)包含553例腎透明細(xì)胞癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁腎臟正常組織的大樣本基因測(cè)序庫(kù)，本研究納入其中有GDP1L基因檢測(cè)結(jié)果及詳細(xì)臨床資料的530例腎透明細(xì)胞癌及對(duì)應(yīng)癌旁腎臟正常組織進(jìn)行分析，具體的臨床信息和分子特征來(lái)源于TCGA網(wǎng)站（http：// cancergenome.nih.gov/），見(jiàn)表1。

三、GPD1L蛋白表達(dá)強(qiáng)度檢測(cè)

使用邁新生物技術(shù)UltraSensitiveTM SP IHC 試劑盒對(duì)組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色（免疫組化），60 ℃烘烤組織芯片40 min，使用二甲苯、無(wú)水酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精梯度脫蠟，過(guò)氧化氫溶液封閉15 min，減低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，之后使用0. 01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，待組織芯片自然冷卻至室溫，血清封閉。一抗GPD1L（1∶100，愛(ài)博泰克生物，貨號(hào)A14392）4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育60 min，三抗室溫孵育15 min，二氨聯(lián)苯胺試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。免疫組化評(píng)分由兩位病理?？漆t(yī)師獨(dú)立完成，芯片染色結(jié)果根據(jù)著色強(qiáng)度和著色范圍進(jìn)行評(píng)估。染色強(qiáng)度根據(jù)鏡下所見(jiàn)的腎小管上皮細(xì)胞的顏色深度分為0、1、2、3共4個(gè)等級(jí)，染色范圍分為0（無(wú)著色）、1 （0% ～ 10%）、2 （10% ～ 50%）、3（51% ～ 75%）、4（76% ～ 100%）共5個(gè)等級(jí)，最終得分為染色強(qiáng)度與染色范圍的乘積。

四、研究方法

觀察組織芯片中腎臟正常組織與腎透明細(xì)胞癌組織GPD1L蛋白的表達(dá)部位及表達(dá)強(qiáng)度，分析TCGA中腎透明細(xì)胞癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁腎臟正常組織GPD1L基因的表達(dá)水平差異。按基因芯片中腎透明細(xì)胞癌GPD1L蛋白表達(dá)強(qiáng)度分為高表達(dá)（免疫組化得分> 6分）組與低表達(dá)（免疫組化得分 ≤6分）組，按TCGA中腎透明細(xì)胞癌GDP1L mRNA表達(dá)水平分為高表達(dá)（mRNA表達(dá)水平>均值）組與低表達(dá)（mRNA表達(dá)水平≤均值）組，分析腎透明細(xì)胞癌患者GDP1L表達(dá)與臨床特征的關(guān)系。觀察TCGA中腎透明細(xì)胞癌患者的預(yù)后，使用總體生存期（OS）作為研究的終點(diǎn)，OS是指從確診腎透明細(xì)胞癌至患者死亡或最后一次隨訪之間的時(shí)間，繪制腎透明細(xì)胞癌患者的生存曲線，分析GDP1L對(duì)預(yù)測(cè)腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的意義。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 24.0處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%） 表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。應(yīng)用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響因素。P < 0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、組織芯片中腎透明細(xì)胞癌GPD1L蛋白的表達(dá)部位及表達(dá)強(qiáng)度分析

組織芯片中，GPD1L蛋白陽(yáng)性染色呈棕黃色或褐色，在腎透明細(xì)胞癌與腎臟正常組織中主要表達(dá)于腎小管上皮的細(xì)胞胞質(zhì)中，見(jiàn)圖1A。免疫組化組織芯片分析顯示，GPD1L蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織表達(dá)強(qiáng)度為（3.32±2.65）分，在腎臟正常組織中表達(dá)強(qiáng)度為（9.87±1.33）分，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 12.705，P < 0.001），見(jiàn)圖1B。

二、組織芯片中腎透明細(xì)胞癌GPD1L蛋白表達(dá)強(qiáng)度與腎透明細(xì)胞癌患者臨床特征的分析

腎透明細(xì)胞癌組織芯片中，GPD1L高表達(dá)23例、低表達(dá)56例。低表達(dá)組中病理分級(jí)高和臨床分期晚者比例高于高表達(dá)組（P均< 0.05），見(jiàn)表2。

三、TCGA中GPD1L mRNA表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者臨床特征及預(yù)后的分析

TCGA中，腎透明細(xì)胞癌組織GPD1L mRNA表達(dá)水平低于腎臟正常組織（t = 21.293，P < 0.05），

見(jiàn)圖2A。GPD1L mRNA高表達(dá)265例、低表達(dá)265例。低表達(dá)者中女性、病理分級(jí)高、臨床分期晚、有轉(zhuǎn)移、死亡者比例均高于高表達(dá)者（P均< 0.05），見(jiàn)表2。GPD1L mRNA低表達(dá)組OS低于高表達(dá)組（P < 0.001），見(jiàn)圖2B。

四、TCGA中影響腎透明細(xì)胞癌患者OS的單因素及多因素分析

對(duì)TCGA腎透明細(xì)胞癌患者的單因素分析顯示，GPD1L mRNA低表達(dá)、年齡大、臨床分期晚、病理分級(jí)高、出現(xiàn)轉(zhuǎn)移者OS較短（P均< 0.05）;多因素分析顯示，GPD1L mRNA表達(dá)水平、年齡、腫瘤轉(zhuǎn)移是腎透明細(xì)胞癌患者OS的影響因素（P均< 0.05），見(jiàn)表3。

討論

在所有的腎細(xì)胞癌組織亞型中，腎透明細(xì)胞癌超過(guò)了80%，而且腎透明細(xì)胞癌是致死率、侵襲率、轉(zhuǎn)移率最高的組織亞型，對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)治療和放射治療的抵抗也最強(qiáng)[8]。雖然近年腎透明細(xì)胞癌的治療研究取得了很大的進(jìn)展，新的手術(shù)方式、分子靶向藥物的應(yīng)用提高了患者的預(yù)后[9]。但是目前仍缺乏對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者早期診斷和預(yù)后的有效評(píng)估指標(biāo)，導(dǎo)致后續(xù)無(wú)法進(jìn)行有針對(duì)性的個(gè)體化治療，或是診斷過(guò)晚或病情進(jìn)展迅速而耽誤治療時(shí)機(jī)，或是治療過(guò)度而浪費(fèi)了大量金錢和精力。尋找反映疾病進(jìn)展過(guò)程中生理狀態(tài)和細(xì)胞變化的新生物標(biāo)志物對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者進(jìn)行個(gè)體化治療和預(yù)測(cè)預(yù)后有重要意義。

GPD1L是編碼催化甘油三磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岣视屯年P(guān)鍵酶。已經(jīng)有報(bào)道GPD1L作為miR-210的直接靶點(diǎn)，在腫瘤形成缺氧環(huán)境過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，并已在肝癌、頭頸癌等有相關(guān)的研究[10]。目前，GPD1L在腎細(xì)胞癌尤其是腎透明細(xì)胞癌中的作用尚缺乏相關(guān)的研究。本研究中，與腎臟正常組織相比，GPD1L在腎透明細(xì)胞癌組織中的蛋白水平下降，這表明GPD1L可能抑制了腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展。此外，GPD1L蛋白的低表達(dá)與高病理分期、臨床轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此導(dǎo)致腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后較差。免疫組化檢測(cè)到的GPD1L蛋白表達(dá)與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中mRNA低表達(dá)均為腎透明細(xì)胞癌患者OS的影響因素。

腎透明細(xì)胞癌被認(rèn)為是一種代謝相關(guān)的腫瘤疾病，缺氧的微環(huán)境在其發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用，而其中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）扮演著重要的角色[11]。miR-210作為HIF-1α的下游，直接抑制著GPD1L的表達(dá);而根據(jù)本研究結(jié)果，GPD1L可考慮作為腎透明細(xì)胞癌預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)，這提示miR-210可以作為腎透明細(xì)胞癌的重要靶點(diǎn)，2017年Costales研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種可以直接抑制miR-210的小分子藥物可提高GPD1L的表達(dá)[12]。對(duì)于其是否可以應(yīng)用在腎透明細(xì)胞癌的治療中，還需要日后進(jìn)一步的研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-09-18）

（本文編輯：林燕薇）