孫振彬，趙廷寶

1. 菏澤市牡丹人民醫(yī)院骨科，菏澤 274000

2.山東省腫瘤醫(yī)院骨科，濟(jì)南 250117

1969 年，Olney［1］提出谷氨酸可使幼鼠視網(wǎng)膜和下丘腦神經(jīng)元變性，并認(rèn)為谷氨酸具有神經(jīng)興奮性毒性。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中谷氨酸水平增高不但可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，同時也可介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［2-3］。促神經(jīng)再生因子復(fù)合劑N6 是趙廷寶教授結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究和臨床工作經(jīng)驗(yàn)研發(fā)的一種促神經(jīng)再生的藥物復(fù)合制劑，主要包括神經(jīng)節(jié)苷脂（單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉）、甲潑尼龍（甲潑尼龍琥珀酸鈉）和神經(jīng)營養(yǎng)因子等［4］。動物實(shí)驗(yàn)證明促神經(jīng)再生因子復(fù)合劑N6 對脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡具有明顯的抑制作用［5-6］，但其能否在谷氨酸誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元損傷中發(fā)揮保護(hù)作用目前尚不清楚。本研究采用體外純化培養(yǎng)的大鼠脊髓神經(jīng)元建立谷氨酸損傷模型，觀察促神經(jīng)再生因子復(fù)合劑N6 對谷氨酸所致神經(jīng)元凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料

妊娠13 d 的Wistar 大鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK-軍2007-004）；促神經(jīng)再生因子復(fù)合劑N6 由山東省腫瘤醫(yī)院骨科趙廷寶教授提供；Neurobasal 培養(yǎng)基、高糖DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、馬血清、N2、B27 購自美國Gibco 公司；多聚賴氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、Hoechst33342 購自美國Sigma 公司；特異性兔抗大鼠MAP-2 購自德國Milipore 公司；FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TUNEL 試劑盒購自美國Promega 公司；CCK-8 試劑盒購自日本Dojindo 公司。CO2培養(yǎng)箱為日本SANYO 公司產(chǎn)品；Olympus BX50 熒光倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 細(xì)胞分離及培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)［7］的操作方法，斷頸處死孕鼠，用75%乙醇消毒腹部皮膚，剖腹取出胎鼠。將胎鼠置于超凈臺中，在解剖鏡下快速取出脊髓，除去硬膜，置于解剖液中（葡萄糖3.0 g/L，蔗糖7.5 g/L，HEPES 2.35 g/L，NaCl 8.0 g/L，KCl 0.4 g/L，Na2HPO40.095 g，KH2PO40.03 g/L，pH 調(diào)至7.25，過濾后4℃儲存）。將脊髓剪成約1 mm3的小塊，加適量0.125%胰蛋白酶，置于培養(yǎng)箱中，37℃消化25 min，加入含血清的接種液（79% DMEM，10%馬血清，10%胎牛血清，1%谷氨酰胺）終止消化，洗滌2 次。再次加入接種液，用Pasteur吸管輕輕吹打4 ～ 6次，靜置片刻，取細(xì)胞懸液，重復(fù)上述步驟3次?；旌霞?xì)胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，一部分以每皿接種2 mL接種于涂有多聚賴氨酸的35 mm培養(yǎng)皿中，一部分以每孔100 μL接種于涂有多聚賴氨酸的96 孔板中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后全換液為無血清培養(yǎng)基（96% Neurobasal，1% N2，2% B27，1%谷氨酰胺），以后每3 d半量換液1次。

1.2.2 神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)至第5 天時進(jìn)行鑒定。神經(jīng)元細(xì)胞具有標(biāo)志性的微管相關(guān)蛋白2（MAP-2），培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞可通過兔抗鼠MAP-2 多克隆抗體間接免疫熒光染色鑒定。染色方法：分別加入一抗（兔抗鼠MAP-2 抗體）和二抗（FITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG）孵育神經(jīng)元細(xì)胞，用Hoechst33342復(fù)染細(xì)胞核。陰性對照用PBS代替一抗。熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將脊髓神經(jīng)元分為3 組：對照組、谷氨酸損傷組和谷氨酸損傷+N6 處理組。谷氨酸損傷模型的建立參照文獻(xiàn)［8］，細(xì)胞培養(yǎng)至第5 天時取出培養(yǎng)皿，吸出培養(yǎng)基并保留，加入50 μmol/L 的谷氨酸溶液（將谷氨酸溶解于1×PBS 中配制成谷氨酸母液，濃度為10 mmol/L，過濾后使用。用時取適量母液加入DMEM 培養(yǎng)基中，終濃度為50 μmol/L，DMEM 提前4 h 置于培養(yǎng)箱中孵育，以平衡溫度及pH 值，避免其對細(xì)胞的影響），在37℃下作用10 min；吸去谷氨酸溶液，用DMEM 洗滌1 次，加入原來的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。對照組以DMEM 代替谷氨酸溶液，其他同谷氨酸組。谷氨酸損傷+N6 處理組于谷氨酸暴露2 h 前在培養(yǎng)基中加入N6，終濃度為10 μL/mL，谷氨酸暴露后繼續(xù)用原來含有N6 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，18 h 后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。每組設(shè)4個平行皿，結(jié)果取平均值。

1.4 TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞

細(xì)胞處理完成后取出培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛（溶解于1×PBS 中，pH 7.4），4℃放置25 min，用PBS 浸洗2 次、每次5 min；加入0.2% TritonX-100 室溫通透5 min，用PBS 浸洗2 次、每次5 min；加入適量平衡液，室溫放置10 min，棄去平衡液；加入適量rTdT酶緩沖液（平衡緩沖液45 μL+核苷混合物5 μL + rTdT 酶1 μL），37℃避光孵育60 min，2×SSC 緩沖液浸泡15 min，PBS 浸洗3 次、每次5 min；最后用Hoechst 復(fù)染細(xì)胞核，Moviol 封片劑封片。陰性對照用PBS代替rTdT酶，其他相同。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)取10 個高倍視野，由未參與實(shí)驗(yàn)并熟悉本實(shí)驗(yàn)原理的人員進(jìn)行計數(shù)和統(tǒng)計。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

于谷氨酸暴露18 h 后，取出96 孔板，各實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)均換成新鮮的無血清培養(yǎng)基，每組設(shè)4個平行孔，并設(shè)4個未種植細(xì)胞的孔作為本底，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，將96 孔板放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的光密度值，用各組光密度值減去相應(yīng)的本底作為細(xì)胞活力結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；以P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原代純化培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元的生長情況及純度鑒定

相差顯微鏡下觀察可見，細(xì)胞接種15 ～ 30 min開始貼壁，4 h 時活細(xì)胞幾乎全部貼壁，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，可見到明顯的光暈，部分細(xì)胞開始有突起生長（圖1a）；48 h 時，細(xì)胞胞體明顯增大，突起數(shù)增多、伸長（圖1b）；第4 天時，神經(jīng)元突起明顯增多并交織成網(wǎng)，細(xì)胞以雙極、三極多見，偶見單極型，光暈更加明顯，有明顯的立體感，高倍視野下可見細(xì)胞胞核（圖1c）；第5 天時，采用MAP-2 免疫熒光標(biāo)記神經(jīng)元，結(jié)果95%的細(xì)胞呈陽性，證明神經(jīng)元的純度較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠（圖1d、e）。

圖1 原代純化培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元的生長情況及純度鑒定Fig. 1 Growth and purity identification of primary purified cultured spinal cord neurons

2.2 各組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)變化

對照組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)無明顯變化（圖2a）。谷氨酸損傷組大部分神經(jīng)元細(xì)胞胞體變圓、腫脹、失去原有形態(tài)，部分細(xì)胞崩解，突起淡化、減少、甚至消失，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒樣改變，胞核固縮并偏離于細(xì)胞邊緣（圖2b）。谷氨酸損傷+N6 處理組發(fā)生上述改變的細(xì)胞明顯減少（圖2c）。

2.3 各組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞活力的改變

TUNEL 檢測結(jié)果顯示，對照組凋亡細(xì)胞較少見（圖3a），凋亡細(xì)胞比例為（6.80±2.70）%；谷氨酸損傷組凋亡細(xì)胞明顯增多（圖3b），凋亡細(xì)胞比例為（44.20±5.39）%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）；谷氨酸損傷+N6 處理組凋亡細(xì)胞較谷氨酸損傷組明顯減少（圖3c），凋亡細(xì)胞比例為（22.30±2.90）%，與谷氨酸損傷組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

CCK-8 檢測結(jié)果顯示，谷氨酸損傷組細(xì)胞活力（光密度值 0.29±0.07）明顯低于對照組（光密度值0.61±0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）；谷氨酸損傷+N6 處理組細(xì)胞活力（光密度值0.47±0.04）較谷氨酸損傷組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

圖2 各組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的變化Fig. 2 Morphological changes of neurons in each group

圖3 TUNEL 法標(biāo)記凋亡細(xì)胞（凋亡細(xì)胞呈綠色熒光）Fig. 3 TUNEL method indicated apoptotic cells（apoptotic cells show green fluorescence）

3 討 論

生理水平的谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，它主要存在于神經(jīng)末梢谷氨酸囊泡中，在細(xì)胞去極化時釋放到突觸間隙，作用于突觸后膜的谷氨酸受體，完成興奮性的傳遞及其他生理作用。病理狀態(tài)下，過量的谷氨酸在腦和脊髓缺血缺氧性損傷、阿爾茨海默病、亨廷頓病、脊髓側(cè)索硬化癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中表現(xiàn)出神經(jīng)毒性作用［9-10］。谷氨酸離子型NMDA受體在興奮性損傷過程中起重要作用，NMDA受體在腦和脊髓組織中均廣泛存在［11-12］，病理情況下突觸間隙谷氨酸大量增加，過度激活NMDA 受體，Ca2+大量內(nèi)流并在細(xì)胞內(nèi)蓄積，激活蛋白酶、磷脂酶及一氧化氮合酶等，通過這些酶的直接作用或其毒性產(chǎn)物（自由基、一氧化氮等）導(dǎo)致線粒體損傷、神經(jīng)纖維蛋白分解、膜磷脂破壞，最終引起細(xì)胞死亡或凋亡［2］。谷氨酸還可通過AMPA受體亞基GluR2引起脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡［3］。本研究應(yīng)用體外純化培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中加入外源性谷氨酸，不僅可引起脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的腫脹、代謝障礙，還可誘導(dǎo)細(xì)胞的遲發(fā)性凋亡，與既往報道［2，13］結(jié)果一致。

有研究證明，促神經(jīng)再生因子復(fù)合劑N6對脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡具有明顯的抑制作用［5-6］，并能夠明顯降低脊髓損傷后脂質(zhì)過氧化物的表達(dá)［14-15］。此外，促神經(jīng)再生因子復(fù)合劑N6 還能增加損傷脊髓GRP78 的表達(dá)，減少CHOP 的表達(dá)，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，從而保護(hù)受損脊髓［16］。動物實(shí)驗(yàn)已證明促神經(jīng)再生因子復(fù)合劑N6 具有生物安全性，初步顯示了臨床應(yīng)用的可能［17］。

本研究采用TUNEL法檢測了脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況，并采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力的變化，發(fā)現(xiàn)谷氨酸可介導(dǎo)體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，而促神經(jīng)再生因子復(fù)合劑N6具有抑制谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡的作用。本研究進(jìn)一步為促神經(jīng)再生因子復(fù)合劑N6用于治療脊髓損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。急性脊髓損傷后血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)多種蛋白組織發(fā)生了變化［18］，N6 在體內(nèi)作用時影響了哪些蛋白質(zhì)的表達(dá)、具體機(jī)制如何，仍有待進(jìn)一步研究。

致謝：本實(shí)驗(yàn)得到了軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院三所一室劉少君教授的大力支持，在此表示感謝！

（注：本文所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、圖片及結(jié)果分析均來自于作者的碩士畢業(yè)論文［19］。）