楊麗娟，于凱利，劉 巍

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

銀離子（Ag+）是一種重金屬離子。隨著在電子、攝影等工業(yè)生產(chǎn)和日常生活中的應(yīng)用越來越廣泛，Ag+現(xiàn)已廣泛地存在于人類生活的環(huán)境中。Ag+可以與羧基、巰基或氨基發(fā)生相互作用亦可以取代酶中的其他必需金屬離子使酶失活，從而使生物系統(tǒng)受到嚴(yán)重的破壞[1]。傳統(tǒng)的銀離子檢測方法包括紫外分光光度法、原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、量子探針技術(shù)等。這些方法雖然能夠做到對(duì)痕量Ag+的檢測，但仍存在一些缺點(diǎn)，比如儀器復(fù)雜、成本昂貴等。近年來基于熒光法、比色法的傳感器用于Ag+的檢測取得很大的進(jìn)展[2-4]，為檢測Ag+提供了新的發(fā)展方向，然而大多數(shù)的傳感器還是存在特異性不強(qiáng)、靈敏度低、材料復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此，開發(fā)一些簡單、靈敏的Ag+檢測方法顯得尤為重要。

基于酶輔助的分析物回收循環(huán)利用的信號(hào)放大方法是一種有效的信號(hào)放大方法。Ag+和兩個(gè)胞嘧啶可以結(jié)合形成穩(wěn)定的C-Ag+-C復(fù)合物[5]。核酸外切酶III（Exo III）對(duì)這種Ag+介導(dǎo)的DNA錯(cuò)配雙螺旋結(jié)構(gòu)具有水解作用。因此，Ag+可以從錯(cuò)配的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中釋放，隨即與新的熒光基團(tuán)標(biāo)記的ssDNA重新結(jié)合形成DNA錯(cuò)配雙螺旋結(jié)構(gòu)。該過程的多次循環(huán)即可實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的增強(qiáng)和放大。

本文基于GO對(duì)標(biāo)記在ssDNA上的熒光基團(tuán)具有強(qiáng)大的熒光猝滅能力和Exo III輔助的分析物Ag+循環(huán)回收利用作用，構(gòu)建了一種具有特異性識(shí)別且能高效快速檢測Ag+的熒光傳感系統(tǒng)，為Ag+的檢測提供一種新的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及儀器

氧化石墨烯（厚0.55～1.2nm，尺寸0.5～3μm，純度＞99%）購于成都中科時(shí)代納米科技有限公司；FAM-ssDNA（5’-FAM-CCC CCC CCC CCC CCC-3’）購于上海生工生物工程股份有限公司；Exo III購買于NEB（北京）有限公司。

RF-6000熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；MS204S分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）。

1.2 氧化石墨烯（graphene oxide，GO）溶液的配制

將10mg GO粉末用去離子水在10mL容量瓶中定容，超聲2h，離心（12000r/min）除去未剝離的氧化石墨，取上清液即得均勻的GO懸浮液（1mg/mL）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將2μL FAM-ssDN溶液（10μM）加入到一定體積的Tris-HCl緩沖溶液中（20mM，pH=7.4，含MgCl25mM和NaCl 50mM）；加入1μL 2×10-4M Ag+溶液和4μL 1mg/mL的GO混懸液至400μL；隨后放入37℃的水浴鍋中孵育80min以形成C-Ag+-C復(fù)合物；加入40U的Exo III在37℃水浴鍋中繼續(xù)孵育20min；最后80℃孵育10min使Exo III失活。以494nm為激發(fā)波長，在510nm～650nm范圍內(nèi)掃描熒光發(fā)射譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光傳感器的工作原理

GO與染料熒光素（FAM）標(biāo)記的DNA寡核苷酸的相互作用形成了穩(wěn)定的FAM-ssDNA/GO復(fù)合物，F(xiàn)AM的熒光被GO猝滅。沒有Ag+存在時(shí)，F(xiàn)AM-ssDNA繼續(xù)被吸附在GO表面從而使熒光基團(tuán)無法釋放，沒有熒光信號(hào)。當(dāng)Ag+存在時(shí)，Ag+與FAM-ssDNA反應(yīng)結(jié)合，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或Ag+介導(dǎo)的DNA錯(cuò)配雙螺旋結(jié)構(gòu)（FAM-ssDNA），從GO表面解吸附，熒光信號(hào)恢復(fù)。加入Exo III之后，發(fā)卡結(jié)構(gòu)和/或FAMssDNA被Exo III消化分解，F(xiàn)AM和Ag+同時(shí)得到釋放，熒光信號(hào)恢復(fù)。當(dāng)釋放的Ag+再次與GO表面的其他FAM-ssDNA結(jié)合時(shí)，加入的Exo III還可以進(jìn)一步酶解釋放熒光基團(tuán)和Ag+，這樣熒光信號(hào)就得以循環(huán)放大，從而可以實(shí)現(xiàn)微量Ag+的定量檢測。

2.2 C-Ag+-C結(jié)構(gòu)的表征

如圖1所示，F(xiàn)AM-ssDNA的熒光探針（50nM）的熒光信號(hào)在含有10μg/mL GO的Tris-HCl緩沖溶液中反應(yīng)20min后幾乎被完全猝滅（曲線a），這表明GO可以有效地吸附FAM-ssDNA。圖1中曲線b熒光信號(hào)增強(qiáng)是因?yàn)镕AM-ssDNA通過C-Ag+-C形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)和/或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（FAMdsDNA），阻止了熒光基團(tuán)與GO之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)換。在有500nmol/LAg+存在時(shí)（曲線b）熒光發(fā)射強(qiáng)度較沒有Ag+存在時(shí)（曲線a）明顯增強(qiáng)。在這里，定義熒光恢復(fù)率為F/F0。F0為FAM-ssDNA和GO溶液的熒光強(qiáng)度值（曲線a在518nm處），F(xiàn)為加入Ag+（曲線b在518nm處）或Exo III（曲線c在518nm處）的溶液的熒光強(qiáng)度值。加入Ag+（曲線b）之后，體系的熒光恢復(fù)率為2.14。隨著Exo III的加入，體系的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增加，熒光恢復(fù)率為6.16。（曲線c與曲線a在518nm處）。

圖1 50nmol/L FAM-ssDNA在不同條件下的熒光發(fā)射光譜圖

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 GO濃度優(yōu)化

如果GO濃度太低，溶液中會(huì)有過多游離的FAM-ssDNA，導(dǎo)致背景噪音過高（F0值）。而如果GO濃度太高，過量的GO會(huì)帶來更多的非特異性吸附，導(dǎo)致熒光信號(hào)過低（F值）。因此，需要尋找合適的GO濃度。按1.3的實(shí)驗(yàn)方法，向體系中加入不同體積的GO混懸液，使GO濃度分別為0、5、10、15、20μg/mL，與FAM-ssDNA溶液混合，然后加入Ag+和Exo III。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光恢復(fù)率隨著GO濃度的增加逐漸增加，在GO濃度達(dá)到10μg/mL時(shí)，熒光恢復(fù)率達(dá)到最大值。當(dāng)GO的濃度大于10μg/mL時(shí)，熒光恢復(fù)率逐漸降低。因此，GO的最適濃度為10μg/mL。

2.3.2 Exo III最佳濃度的選擇

按1.3的實(shí)驗(yàn)方法，分別加入10、20、40、50、60U 的Exo III，測定體系的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體系的熒光強(qiáng)度隨著Exo III濃度的增加而增加。但當(dāng)其濃度達(dá)到40U的時(shí)候，體系的熒光強(qiáng)度值達(dá)到最大，此后隨酶濃度的增加體系熒光強(qiáng)度反而下降。因此，該體系加入Exo III的最佳濃度為40U。

2.3.3 酶消化時(shí)間的選擇

按1.3的實(shí)驗(yàn)方法，將Exo III的消化時(shí)間分別設(shè)為10、20、30、40、50、60min，如果以消化時(shí)間為橫坐標(biāo)，體系熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，描繪體系熒光強(qiáng)度隨消化時(shí)間的變化曲線的話，可以明顯看出前20min內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度隨消化時(shí)間顯著增加，但之后增加不再明顯。所以，Exo III的最佳消化時(shí)間選擇為20min。

2.4 熒光傳感器的靈敏度

圖2為加入不同濃度Ag2+后的熒光發(fā)射光譜圖。可以看出，隨著Ag+濃度從0增加到700nmol/L，體系的熒光強(qiáng)度值逐漸增加。在500nmol/L Ag+的條件下，該體系的熒光恢復(fù)率（F/F0）為5.76。圖2為該熒光體系中Ag+濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系。圖3的內(nèi)插圖顯示，Ag+濃度在50nmol/L至500nmol/L范圍內(nèi)，熒光恢復(fù)率與Ag+濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，F(xiàn)/F0=3.03lg[Ag+]-2.35（R2=0.992）。

2.5 選擇性檢測

通過檢測在相同條件下加入其他金屬離子（如Cu2+、Fe2+、K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Pb2+、Hg2+）時(shí) 熒 光 強(qiáng) 度 的 差異來評(píng)價(jià)該檢測方法的選擇性。圖4展示了不同溶液（包含500nmol/L的Ag+或10μmol/L的其他金屬離子）之間的熒光強(qiáng)度差異。可以看出，Ag+可以使體系表現(xiàn)出相當(dāng)大的熒光強(qiáng)度差異響應(yīng)值，但換成其他高濃度金屬離子時(shí)，熒光強(qiáng)度的差異并沒有明顯的變化。該結(jié)果表明，檢測方法對(duì)Ag+具有較高的選擇性。

3 結(jié)束語

本文設(shè)計(jì)了一種操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)的 DNA熒光探針，構(gòu)建了一種基于氧化石墨烯（GO）和酶輔助循環(huán)信號(hào)放大作用的高靈敏的Ag+檢測方法。C-Ag+-C結(jié)構(gòu)可以使熒光基團(tuán)從GO表面釋放，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的恢復(fù)。Exo III將錯(cuò)配的雙螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行剪切，進(jìn)一步恢復(fù)和增強(qiáng)熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)表明，在最優(yōu)的條件下，Ag+濃度（50～500nmol/L）的對(duì)數(shù)與熒光恢復(fù)率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，并且熒光探針對(duì)Ag+具有特異性的識(shí)別作用。

圖2 不同濃度Ag+的體系熒光發(fā)射光譜圖。

圖3 熒光恢復(fù)率與Ag+濃度的曲線關(guān)系

圖4 不同金屬離子溶液的熒光強(qiáng)度差異。