沈紅梅 程玉祥

摘要：RING-H2家族基因參與植物的多個生物學(xué)過程，PtrRHH94是毛果楊木質(zhì)化組織內(nèi)高豐度表達(dá)的RING-H2基因。為了探究PtrRHH94基因的功能，選擇3組PtrRHH94待編輯靶位點(diǎn)，構(gòu)建相應(yīng)的Cas9/gRNA編輯載體，將其遺傳轉(zhuǎn)化毛果楊，得到10株轉(zhuǎn)基因幼苗。DNA測序結(jié)果顯示，7株轉(zhuǎn)基因幼苗體內(nèi)的PtrRHH94位點(diǎn)被編輯突變，3株植株被鑒定為PtrRHH94敲除突變體。與野生型毛果楊幼樹相比，PtrRHH94突變體幼樹株高增加，莖節(jié)數(shù)也增多。此外，PtrRHH94突變體木材的纖維長度與野生型相比沒有顯著差異，表明PtrRHH94參與了毛果楊莖生長的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：毛果楊;PtrRHH94;突變體;Cas9/gRNA編輯載體

中圖分類號：S792.110.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）22-044-05

作者簡介：沈紅梅（1994—），女，四川廣安人，碩士研究生，主要從事林木遺傳與育種研究。E-mail：shenhm@nefu.edu.cn。

通信作者：程玉祥，博士，教授，主要從事林木遺傳與育種研究。E-mail：chengyuxiang@nefu.edu.cn。

RING基因是植物的一個超級基因家族，其編碼的氨基酸含有8個保守的半胱氨酸/組氨酸殘基（Cys-X2-Cys-X9-39-Cys-X1-3-His-X2-3-Cys/His-X2-Cys-X4-48-Cys-X2-Cys，X表示任意氨基酸），結(jié)合2個鋅原子形成帶狀結(jié)構(gòu)[1]。擬南芥、蘋果及水稻等RING超級家族包括經(jīng)典的RING型和修飾的RING型，經(jīng)典的RING型分為RING-HC（C3HC4）、RING-H2（C3H2C3）亞家族，而修飾的RING型有RING-v、RING-D、RING-G、RING-S/T等[2-4]。RING-H2類型的基因成員數(shù)最多，預(yù)示其功能的重要性和復(fù)雜性。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥經(jīng)典的RING型和修飾的RING型均有泛素連接酶E3活性[5]。據(jù)報(bào)道，RING-H2亞家族參與植物的多種生物學(xué)過程，如激素生物合成[6-8]、信號傳導(dǎo)[9]、逆境響應(yīng)及光形態(tài)建成[10-13]等。楊樹有16個RING-H2成員，能在木質(zhì)部組織內(nèi)較特異或高豐度表達(dá)[14]，但是目前這些基因的遺傳功能尚未被鑒定。

PtrRHH94是這16個RING-H2成員之一，其啟動子活性集中在毛果楊木質(zhì)化的莖節(jié)組織[14]，很可能參與其莖的生長發(fā)育。為了鑒定毛果楊PtrRHH94基因的功能，本研究擬構(gòu)建PtrRHH94基因Cas9/gRNA編輯載體，用其遺傳轉(zhuǎn)化毛果楊，獲得PtrRHH94基因位點(diǎn)被編輯突變的遺傳材料，并基于突變體初步分析PtrRHH94基因的功能。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

用1月齡毛果楊組培苗進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，將溫室栽培至3月齡的毛果楊野生型及轉(zhuǎn)基因幼樹用于PtrRHH94基因突變表型分析。

1.2主要試劑

EXTaq、pMD18-T，購自TaKaRa公司;植物基因組DNA一步法試劑盒，購自Bioteke公司;SilicaBeadDNAGelExtrctionKit，購自ThermoScientific公司;E.Z.N.APlasmidMiniKit，購自O(shè)mega公司;KOD-plus，購自Toyobo公司;BsaⅠ、高濃度T4DNA連接酶，購自NewLab公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1植物基因組DNA的提取植物基因組DNA的提取材料為各毛果楊樣品葉片，用液氮把葉片研磨成粉末，加入植物基因組DNA一步法試劑進(jìn)行提取，具體操作參照其說明書。

1.3.2PCR擴(kuò)增20μLPCR反應(yīng)體系：13.5μL去離子水，2.0μLdNTP，2.0μL10×Buffer，0.5μLTaqDNA聚合酶，各0.5μL上下游引物，1.0μL模板。擴(kuò)增條件：95℃5min;95℃30s，58～60℃30s，72℃1.5min，35個循環(huán);72℃5min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3PtrRHH94基因編輯載體的構(gòu)建在擴(kuò)增靶位點(diǎn)序列片段gRNAT1、gRNAT2和gRNAT3時(shí)，以稀釋100倍的PCBC-DT1T2質(zhì)粒為模板，DT1-BsF、DT2-BsR、DT1-F0和DT2-R0為引物，PCR擴(kuò)增后，將產(chǎn)物用瓊脂糖電泳區(qū)分，切下目的條帶的膠，膠內(nèi)回收的DNA片段經(jīng)BsaⅠ酶切、T4DNA連接酶連接到植物基因編輯載體pHSE401[15]上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，篩選出含有pHSE401-gRNAT1/T2/T3的單菌落，經(jīng)測序鑒定后，將陽性質(zhì)粒導(dǎo)入GV3101農(nóng)桿菌，用于毛果楊的轉(zhuǎn)化。

1.3.4毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[16]，選擇1月齡毛果楊幼苗，切取第2～3節(jié)莖段，長度約為1cm，用農(nóng)桿菌侵染后黑暗共培養(yǎng)48h，用無菌水清洗莖段后，移至含有10mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上。將抗性芽（25d）移至含有5mg/L潮霉素的生根培養(yǎng)基上。提取轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA作為模板，用zCas9-R/F、gRNAT1/T2/T3特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

1.3.5轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)PtrRHH94基因靶位點(diǎn)的編輯鑒定以轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA為模板，用覆蓋靶位點(diǎn)的PtrRHH94-R/F引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物膠回收后連接到pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌。將篩選的陽性克隆進(jìn)行DNA測序，再與野生型PtrRHH94基因序列進(jìn)行對比，得到靶位點(diǎn)被編輯的情況。

1.3.6木材纖維長度的測量取樣品幼樹第20節(jié)莖段，剝?nèi)淦?，浸泡在解離液（10%硝酸+10%鉻酸）中，60℃水浴7h，使纖維、導(dǎo)管細(xì)胞從木材組織上解離下來，用1%酸性品紅染色后，在光學(xué)顯微鏡下測量纖維長度，每個樣品共統(tǒng)計(jì)200個纖維細(xì)胞。

1.3.7數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法對株高、莖節(jié)數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，表示差異顯著。用GraphpadPrism5.0軟件對纖維長度分布情況進(jìn)行制圖。

1.3.8本研究所用引物本研究所用引物情況見表1。

2結(jié)果與分析

2.1pHSE401-PtrRHH94基因編輯載體的構(gòu)建

PtrRHH94基因的突變通過Cas9/gRNA基因編輯技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，在PtrRHH94基因外顯子上設(shè)計(jì)并選出3個特異靶位點(diǎn)序列T1～T3（圖1-a）。以pCBC-DT1T2質(zhì)粒為模板，分別PCR擴(kuò)增出帶有特異靶位點(diǎn)序列的gRNAT1、gRNAT2和gRNAT3片段（圖1-b）。分別割膠回收各片段，用BsaⅠ酶切后連接到pHSE401植物基因編輯載體上（圖1-c）。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，提取陽性菌落質(zhì)粒，進(jìn)行電泳檢測（圖1-d），測定插入片段的DNA序列，得到Cas9/gRNAT1/T2/T3-PtrRHH94編輯載體。將構(gòu)建的載體導(dǎo)入GV3101農(nóng)桿菌，用于隨后的毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化。

2.2Cas9/gRNA-PtrRHH94轉(zhuǎn)化毛果楊及分子鑒定

以1月齡的毛果楊無菌苗為轉(zhuǎn)化受體，經(jīng)過侵染、抗性愈傷形成、抗性愈傷組織分化出芽、抗性芽生根的過程，轉(zhuǎn)入Cas9/gRNAT1/T2/T3-PtrRHH94基因（圖2-a～圖2-f）。盆栽后共得到10個轉(zhuǎn)基因抗性株系。以提取的抗性植株基因組DNA為模板，用zCas9引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。結(jié)果表明，未被轉(zhuǎn)化的野生型（陰性對照）沒有擴(kuò)增出zCas9片段條帶，而10株抗性植株均擴(kuò)增出目標(biāo)帶（圖2-g）。用gRNAT1/T2/T3引物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)抗性植株均擴(kuò)增出了目標(biāo)條帶（圖2-h）。以上結(jié)果顯示，這10株毛果楊抗性植株中均轉(zhuǎn)入了Cas9/gRNAT1/T2/T3-PtrRHH94基因。

2.3靶基因PtrRHH94編輯突變分析

對10株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PtrRHH94基因靶位點(diǎn)編輯情況鑒定，在跨T1、T2、T3靶位點(diǎn)2端設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目標(biāo)片段DNA，測序后與野生型進(jìn)行對比。結(jié)果顯示，7個株系的PtrRHH94基因均被編輯，其中PtrRHH94-T1-1#、PtrRHH94-T2-2#和PtrRHH94-T3-2#植株為雙等位編輯（圖3-a），這3個株系中PtrRHH94的部分堿基插入或刪除后，導(dǎo)致PtrRHH94編碼區(qū)提前產(chǎn)生終止密碼子，推測其氨基酸遠(yuǎn)短于野生型PtrRHH94（圖3-b），顯示這3個株系為PtrRHH94基因敲除突變體。

2.4PtrRHH94基因敲除突變體的表型分析

對PtrRHH94-T1-1#、-T2-2#和-T3-2#敲除突變體進(jìn)行無性擴(kuò)繁后，與野生型毛果楊一起盆栽于溫室中，進(jìn)行表型分析與比較。與野生型植株（同為3月樹齡）相比，3個不同株系的PtrRHH94突變體植株株高均顯著于高于野生型植株（圖4-a、圖4-b）。為了探究PtrRHH94突變體植株變高的原因，統(tǒng)計(jì)植株莖節(jié)數(shù)，結(jié)果顯示，3月樹齡野生型植株的莖節(jié)數(shù)平均約23節(jié)，而3個不同株系突變體的莖節(jié)數(shù)均達(dá)到25節(jié)（圖4-c）。為了探究植株變高是否與纖維細(xì)胞變長相關(guān)，分別統(tǒng)計(jì)野生型、PtrRHH94突變體木材200個纖維細(xì)胞的長度。結(jié)果顯示，兩者在不同長度纖維的分布與長度上均沒有顯著差異（圖4-d），表明PtrRHH94突變體株變高與木質(zhì)部組織細(xì)胞長度無顯著相關(guān)性。

3結(jié)論與討論

RING-H2亞家族參與了植物的多種生物學(xué)過程，然而在樹木中，關(guān)于其功能的報(bào)道甚少。楊樹存在多個木質(zhì)部特異或高豐度表達(dá)RING-H2的成員[14]，這些基因很可能參與樹木木材形成（林木最主要的性狀）。本研究中，筆者以PtrRHH94基因?yàn)閷ο?，基于Cas9/gRNA基因編輯技術(shù)創(chuàng)制了多株毛果楊PtrRHH94基因突變體。不同株P(guān)trRHH94突變體展示的表型是相同的，表明靶基因被Cas9/gRNA高效率地產(chǎn)生雙等位編輯突變，形成了遺傳學(xué)意義的基因敲除突變體。這個結(jié)果也顯示，Cas9/gRNA基因編輯技術(shù)應(yīng)用于毛果楊這個基因組最先被解讀的模式樹[17]是行之有效的。

PtrRHH94敲除突變體出現(xiàn)幼樹株高增加現(xiàn)象，表明PtrRHH94參與毛果楊莖生長。進(jìn)一步探知突變體木材不同長度纖維分布及其長度與野生型的均沒有顯著差異，且葉片等其他器官也未發(fā)現(xiàn)變大，僅突變體幼樹的莖節(jié)數(shù)增多。據(jù)此推測，PtrRHH94參與毛果楊莖生長，很可能是通過調(diào)控莖的生長發(fā)育進(jìn)程。植物RING-H2基因被報(bào)道具有泛素連接酶E3活性[5]，PtrRHH94是否通過泛素化參與毛果楊莖生長發(fā)育有待被鑒定。植物泛素化途徑介入的功能常常是起負(fù)調(diào)控作用[18-19]，PtrRHH94敲除產(chǎn)生幼樹變高也是負(fù)調(diào)控的特征。鑒于此，今后找出被PtrRHH94泛素化的靶蛋白，可為探明其參與毛果楊莖生長的分子作用模式提供參考。

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