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馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細胞雜交研究進展

2020-03-03 14:37:13趙小強鹿金穎陳瑜李華盛
江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年22期
關(guān)鍵詞:研究進展馬鈴薯建議

趙小強 鹿金穎 陳瑜 李華盛

摘要:馬鈴薯是最早成功進行離體培養(yǎng)并獲得體細胞雜種植株的農(nóng)作物之一。原生質(zhì)體培養(yǎng)及再生是體細胞雜交的關(guān)鍵環(huán)節(jié),體細胞雜交技術(shù)可以避免馬鈴薯因倍性水平和胚乳平衡數(shù)造成在常規(guī)育種上的難點。本文在介紹馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)影響因素和體細胞雜交技術(shù)及其在馬鈴薯遺傳育種應(yīng)用的基礎(chǔ)上,主要分析了影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的重要因素,包括基因型、外植體、預(yù)處理、分離技術(shù)和培養(yǎng)方法等,并且總結(jié)了體細胞雜交技術(shù)在馬鈴薯遺傳育種中的應(yīng)用,同時針對存在的問題提出建議與相應(yīng)對策并進行了展望。

關(guān)鍵詞:馬鈴薯;原生質(zhì)體培養(yǎng);體細胞雜交;遺傳育種;建議;研究進展

中圖分類號: S532.01 文獻標志碼: A

文章編號:1002-1302(2020)22-0006-09

作者簡介:趙小強(1985—),男,甘肅武山人,博士,工程師,從事空間植物育種研究。E-mail:wushan2002zxq@126.com。

通信作者:鹿金穎,博士,研究員,從事空間生物學(xué)研究。E-mail:lujinying2001@sina.com。

馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)屬茄科茄屬植物[1],是繼小麥、水稻和玉米之后第四大栽培作物[2]。馬鈴薯是未來保障全球人口糧食資源的重要作物,預(yù)計到2050年全球人口將增至97億[3]。我國馬鈴薯的種植面積位居世界第一,主要分布在西南山區(qū)、西北和東北等地區(qū)。同時,各航天大國進行了空間生物再生生命保障系統(tǒng)(BLSS)中候選植物物種的篩選,馬鈴薯因營養(yǎng)價值高、空間占用體積小、繁殖容易、園藝操作簡單、株高相對矮等特點被作為BLSS的候選植物物種[4]。

馬鈴薯是多倍體,在自然界中存在不同倍性的種質(zhì)資源,其中二倍體占74.4%,包括絕大多數(shù)的原始栽培種和野生種,它們是馬鈴薯抗病、抗蟲和抗逆等優(yōu)良性狀選育的重要種質(zhì)資源[5]。馬鈴薯栽培種的遺傳背景較狹窄[6],生產(chǎn)上應(yīng)用的普通馬鈴薯基本為四倍體,但野生種為二倍體,由于倍性水平和胚乳平衡數(shù)的差異[7],許多野生資源的優(yōu)質(zhì)基因難以通過傳統(tǒng)育種轉(zhuǎn)移到普通馬鈴薯上。為了充分利用野生種質(zhì)資源,拓寬栽培馬鈴薯狹窄的遺傳基礎(chǔ),研究人員付出了巨大的努力。體細胞雜交技術(shù)的利用,可以有效克服馬鈴薯栽培種和野生種因倍性差異引起的生殖隔離,將野生種的優(yōu)質(zhì)基因轉(zhuǎn)移至栽培種用來選擇改良品種[8],同時可以避免與轉(zhuǎn)基因相關(guān)的生物安全監(jiān)管問題。隨著體細胞雜交技術(shù)的發(fā)展,研究人員展開了大量馬鈴薯原生質(zhì)體融合的研究。本文綜述了馬鈴薯體原生質(zhì)培養(yǎng)、體細胞雜交的研究進展及其在遺傳育種中的研究應(yīng)用,同時針對存在的問題提出建議和意見并進行了討論和展望。

1 原生質(zhì)體的培養(yǎng)

1960年Cocking首次用酶解法制備獲得了煙草大量的原生質(zhì)體[9]。10年后,Takebe等成功獲得經(jīng)煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株[10]。Lorenzini最早開展馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究,他通過游離四倍體馬鈴薯莖塊原生質(zhì)體,試驗只獲得了原生質(zhì)體來源的愈傷組織[11]。隨后,Butenko等對普通栽培種Chacoense葉片原生質(zhì)體進行培養(yǎng),試驗得到了植株,但植株染色體數(shù)目有缺失[12]。同年,Shepard等通過改進培養(yǎng)方法,獲得了商業(yè)品種布爾班克葉片原生質(zhì)體來源形態(tài)完整的再生植株[13]。馬鈴薯是最早成功進行離體培養(yǎng)并獲得體細胞雜種植株的農(nóng)作物之一[14]。目前,關(guān)于馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)的報道較多,但其采用的試驗材料和培養(yǎng)方法存在較大的差異。影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素較多,主要包括基因型、外植體、預(yù)處理、分離技術(shù)和培養(yǎng)方法等。

1.1 原生質(zhì)體的游離

1.1.1 基因型和外植體的類型

研究表明,基因型是影響茄科茄屬植物原生質(zhì)體再生的重要因素之一[15-16]。不同基因型的馬鈴薯在原生質(zhì)體培養(yǎng)時,可以觀察到從原生質(zhì)體開始培養(yǎng)到肉眼可見的愈傷組織整個階段無顯著差異,但形成的愈傷組織在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)時分化效率存在顯著差異[17],這表明不同基因型在愈傷組織分化階段對培養(yǎng)基的成分存在敏感性差異。

用來酶解馬鈴薯原生質(zhì)體的外植體較為廣泛,包括塊莖[18]、根尖[19]、芽[15,20]、葉片[21-28]、懸浮培養(yǎng)細胞[27,29-32]、實生苗子葉及下胚軸[33-34]和花粉[35-36]等。在上述材料中,葉片酶解后可獲得在生理和遺傳特性上較一致的原生質(zhì)體,同時植株的培養(yǎng)條件和苗齡等因素對原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力有較大的影響,因此無菌試管苗被選為獲得高質(zhì)量原生質(zhì)體的最佳材料。

1.1.2 外植體的預(yù)處理

提高原生質(zhì)體對不利因素的耐受力可獲得產(chǎn)量和活力較高的馬鈴薯原生質(zhì)體。研究者通常在酶解前或者在酶解過程中對材料進行預(yù)處理,通過改變細胞和細胞壁的生理狀態(tài)來提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。預(yù)處理的方法有:(1)低溫處理。李世君等將25 ℃下培養(yǎng)28 d的馬鈴薯無菌苗于4 ℃下過夜,發(fā)現(xiàn)低溫處理可以有效提高原生質(zhì)體的活力[37]。(2)抽真空處理。戴朝曦等將試驗材料剪碎后連同酶解液一起置于真空抽氣瓶中,在0.05 MPa壓力條件下抽氣10 min,由于壓力有效提高了材料原生質(zhì)體釋放的速度及原生質(zhì)體的產(chǎn)量,同時由于減少了材料在酶解液中的時間,原生質(zhì)體的活力也有大幅度提高[38]。吳旺澤等將材料在酶解前進行低溫處理并對組織和酶液進行真空滲透處理,預(yù)處理顯著提高了原生質(zhì)體游離速度和原生質(zhì)體產(chǎn)量[39]。(3)弱光短周期處理。Shepard等將材料游離原生質(zhì)體前進行弱光短光照周期處理,發(fā)現(xiàn)此處理可顯著提高馬鈴薯原生質(zhì)體產(chǎn)量[13]。(4)葉片離體培養(yǎng)。劉文萍等將馬鈴薯葉片在MS液體培養(yǎng)基4 ℃下處理或者在FM液體培養(yǎng)基中20 ℃下黑暗處理48 h后轉(zhuǎn)入CM培養(yǎng)基中4 ℃下持續(xù)24 h,此處理可顯著提高原生質(zhì)體質(zhì)量且較多細胞進行分裂[40]。(5)藥物處理。在馬鈴薯植株培養(yǎng)基中添加乙烯拮抗劑AgNO3[41]和H2S2O3[42-43]可促進馬鈴薯原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)。因此,選擇適宜的預(yù)處理方法是獲得高質(zhì)量馬鈴薯原生質(zhì)體的重要因子。

1.1.3 外源影響因子 影響原生質(zhì)體酶解的外源因子主要有酶制劑的類型、酶解液的滲透壓、酶解溫度、酶解時間和酶解液的pH值等。

用于游離原生質(zhì)體的酶制劑主要有纖維素酶、果膠酶和離析酶。酶制劑的不同組合及濃度是影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的重要因素,具體應(yīng)根據(jù)材料類型和酶制劑活力而選擇。對去細胞壁相對容易的材料如幼嫩葉片和下胚軸等,應(yīng)選擇相對溫和的酶和較低的濃度;而以愈傷組織細胞懸浮系為材料時,應(yīng)選用活性較高的酶。酶為生物活性物質(zhì),同一類型的酶因不同廠商甚至批次的差異會影響酶的活力,所以應(yīng)根據(jù)多次試驗確定[44]。

酶解液的滲透壓是影響原生質(zhì)體能否成功離解的另一個因素,植物細胞酶解后需適宜的滲透壓來維持細胞生長的正常狀態(tài),否則會影響細胞的生長和代謝。李韜等研究證明,以蔗糖作為滲透壓調(diào)節(jié)劑時可以減小原生質(zhì)體的損傷并提高其活力,其效果優(yōu)于選用甘露醇或葡萄糖+甘露醇[45]。孫海宏等研究證明,用0.3 mol/L甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑可獲得產(chǎn)量和活力較高的馬鈴薯葉片原生質(zhì)體[28],而一些研究者在培養(yǎng)馬鈴薯原生質(zhì)體時采用0.4~0.6 mol/L甘露醇來維持滲透壓[26]。[JP2]趙小強等在進行草地早熟禾原生質(zhì)體培養(yǎng)時采用0.4 mol/L[JP]甘露醇來維持滲透壓,并且發(fā)現(xiàn)在原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中逐步降低滲透壓的濃度有利于愈傷組織的形成[46]。

游離原生質(zhì)體酶解液的溫度為25~30 ℃。陳鵬認為,酶解溫度受所用酶的活性和材料類型的影響,馬鈴薯葉片原生質(zhì)體酶解的最佳溫度為 28 ℃[31]。孫海宏等研究證明,雖然28 ℃時可獲得最高產(chǎn)量的原生質(zhì)體,但此時原生質(zhì)體狀態(tài)差于(25±1) ℃ 時獲得的原生質(zhì)體,因此建議最佳的酶解溫度為(25±1) ℃[28]。

酶的活性與pH值也較為密切。酶解液的pH值常被調(diào)節(jié)在4.7~6.0之間。常用的Onozuka纖維素酶R-10和離析酶R-10最佳的pH值范圍分別為50~6.0和4.0~5.0[47]。

酶的類型和濃度是影響酶解原生質(zhì)體的時間和產(chǎn)量的關(guān)鍵的因素;酶解液滲透壓是影響獲得高質(zhì)量原生質(zhì)體并形成愈傷組織的重要因素;酶解溫度及pH值對馬鈴薯原生質(zhì)體的解離和質(zhì)量也有重要的影響,因此在實際操作過程中必須綜合考慮這些重要因子[48]。

1.2 原生質(zhì)體的再生

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

常用于馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)的培養(yǎng)基有MS[49]、B5[50]、KM[51]、VKM[52]和SKM[15]等培養(yǎng)基。游離獲得的原生質(zhì)體從愈傷組織形成到愈傷組織進一步分化所用培養(yǎng)基及組成與組織器官培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基類似[53-54]。馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)時,在培養(yǎng)基中加入甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和維生素C等可有效防止原生質(zhì)體再生細胞團的褐化現(xiàn)象[47];在培養(yǎng)基中添加適量的活性炭可促進原生質(zhì)體細胞的分裂[55]。進行單個原生質(zhì)體培養(yǎng)時,在培養(yǎng)基中添加1.2%馬鈴薯塊莖浸提液可顯著提高細胞分裂的頻率[45]。

原生質(zhì)體培養(yǎng)在形成大量的愈傷組織之前應(yīng)置于黑暗或者弱光下培養(yǎng),這是因為強光會造成原生質(zhì)體葉綠素分解而導(dǎo)致細胞死亡。在(24±1) ℃黑暗條件下培養(yǎng)的馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)1 d后,在顯微鏡下可觀察到其體積增大并伴隨細胞壁的再生,培養(yǎng)3~5 d后細胞發(fā)生第1次和第2次分裂,但在(28±1) ℃條件下培養(yǎng)時,原生質(zhì)體能再生出細胞壁但不能進一步分裂[56]。因此,基于不同的試驗材料,選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的核心技術(shù)。

1.2.2 原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法

原生質(zhì)體培養(yǎng)方法主要有固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)以及由固液培養(yǎng)方法衍生出的一系列培養(yǎng)方法。各種培養(yǎng)方法在馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)中均有使用,其中液體淺層培養(yǎng)法是最常用且效果最佳的培養(yǎng)基,其次是海藻酸鈉薄層固液雙層培養(yǎng)法[31]。馬鈴薯在進行原生質(zhì)體培養(yǎng)時,當(dāng)觀察到有愈傷組織形成時即可迅速轉(zhuǎn)移至除去維持滲透壓的固體培養(yǎng)基中進一步進行繼代培養(yǎng),繼代1~2次后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)。

2 體細胞雜交

體細胞技術(shù)可以克服有性雜交不親和性的障礙,實現(xiàn)在近緣的種內(nèi)或種間,遠緣的屬間甚至科之間形成雜種細胞,擴大遺傳變異的重組范圍,創(chuàng)造出常規(guī)育種技術(shù)不能獲得的新品種(系),并且原生質(zhì)體融合不涉及DNA的體外重組,無潛在的安全性問題。1980年,Butenko等首次對普通四倍體栽培種與二倍體野生種S.chacoense進行細胞融合,獲得了抗Y病毒(PVY)的體細胞雜種植株[57]。隨后研究人員進行了較多馬鈴薯融合研究,產(chǎn)生了幾百個馬鈴薯體細胞雜種,Tiwari等對近40年馬鈴薯體細胞雜交做了匯總[58]。

2.1 原生質(zhì)體的融合方法

馬鈴薯原生質(zhì)體融合常用的方法有電融合法和聚乙二醇法(polyethlene glycol,PEG)。在研究初期,PEG化學(xué)誘導(dǎo)方法被廣泛使用,但隨著電融合方法的不斷改進完善,利用電融合方法獲得馬鈴薯雜種植株的報道越來越多。這可能是和PEG法相比較,電融合法具有操作簡單,參數(shù)易于控制,并且不會對細胞產(chǎn)生毒害作用等優(yōu)點。在糧食作物中,馬鈴薯是最先使用電融合技術(shù)進行細胞融合的作物[59]。

2.2 雜種細胞的篩選與鑒定

原生質(zhì)體融合后的產(chǎn)物包括自身融合的同核體、異源融合的異核體和未發(fā)生融合的雙親本的原生質(zhì)體,而異核體是要選擇進一步培養(yǎng)的細胞,因此,要采用特定的方法對雜種細胞進行篩選和鑒定。

2.2.1 雜種細胞的篩選 雜種細胞篩選常用的方法有物理選擇法、互補選擇法和生長差異選擇法。

物理選擇法是根據(jù)親本天然顏色不同,選擇具有雙親顏色的異核體,如王清等利用子葉原生質(zhì)體葉綠體含量多但下胚軸原生質(zhì)體含量少為標記,對馬鈴薯雜種細胞進行挑選[60]。

互補選擇法是通過轉(zhuǎn)抗性標記植株、雙突變體和營養(yǎng)缺陷型突變體對異核體進行選擇。Teruo利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將卡那霉素抗性和潮霉素抗性轉(zhuǎn)移至2個供試品種,融合后利用同時含有卡那霉素和潮霉素的培養(yǎng)基進行篩選,最終獲得雜種植株[61]。

生長差異選擇法是在篩選培養(yǎng)基上只適合雜種細胞正常生長而其他細胞不能正常生長的篩選方法。

2.2.2 體細胞雜種植株的鑒定 通過培養(yǎng)獲得雜種細胞再生植株后,為了檢測是否為目標融合體須要對植株進行鑒定。目前,篩選鑒定主要從形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)和生化及分子生物學(xué)等方面進行鑒定。

形態(tài)學(xué)特征大多由多基因控制,但經(jīng)常會發(fā)生一些異常的改變,所以僅憑形態(tài)學(xué)特征具有一定的缺陷,故選用其他方法鑒定。

生物化學(xué)方法鑒定是通過分析同工酶對體細胞雜種進行鑒定。同工酶常采用過氧化物酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶,雜種的同工酶譜帶常表現(xiàn)為融合雙親譜帶之和,有時部分親本帶會丟失,有時雜種甚至出現(xiàn)新的譜帶。司懷軍等對融合而來的馬鈴薯雜種植株進行過氧化物同工酶譜分析,結(jié)果雜種植株過氧化物同工酶表現(xiàn)為雙親酶譜譜帶總和[62]。

分子生物學(xué)方法鑒定是一種對雜種高效鑒定的方法。常用的分子標記技術(shù)為隨機擴增DNA多態(tài)性(RAPD)、簡單重復(fù)序列(SSR)、限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性(RFLP)和擴增片斷長度多態(tài)性(AFLP)等。Szczerbakowa等利用RAPD技術(shù)分析S. nigrum(+) S. tuberosum雜種植株,雜種植株表現(xiàn)出具有雙親特征條帶[63]。李鳳云等利用RAPD技術(shù)分析抗晚疫病的馬鈴薯二倍體野生種S. chacoense與感晚疫病的四倍體材料DY4-5-10雜種植株,有8個引物擴增出兩親本的差異帶,在101個再生植株中94個為雜種[64]。Fock等利用SSR分子標記技術(shù)對S. stenotomum (+) S. tuberosum雜種植株進行了分析鑒定并獲得雜種植株[24];李朋等對青枯病抗性的體細胞雜種與栽培種雜交產(chǎn)的后代利用SSR分子標記分析鑒定,最終獲得3個標記可以明確鑒定抗感基因型[65]。Liu等利用特定親本SSR標記對不對稱雜交后代的基因組成進行了標記[66]。Helgeson等利用細胞融合技術(shù)將S. tuberosum (+) S. bulbocastanum融合,獲得的植株經(jīng)RAPD和RFLP鑒定,從而獲得了雜種植株[67]。Rakosy-Tican等通過對雜種后代利用SSR和AFLP標記,認為雜種植株對稱或者不對稱雜交的比例取決于馬鈴薯的品種[68]。Tiwari 等利用AFLP和MSAP分子標記法對S. tuberosum (+) S. etuberosum雜種植株進行遺傳和表觀變化分析,結(jié)果表明,雜種植株和其母本相比較,再生植株在組織培養(yǎng)過程中的表觀遺傳變異最?。?%~6%)[69]。此外,分子標記技術(shù)還可對細胞質(zhì)基因組(葉綠體和線粒體基因組)來源進行鑒定,Chandel等對S.tuberosum (+) S. cardiophyllum雜種后代通過RAPD、內(nèi)部簡單重復(fù)序列多態(tài)性(ISSR)、SSR、AFLP分子鑒定和細胞質(zhì)基因組進行鑒定,確定了抗晚疫病的雜種植株[70]。Fock等對10個馬鈴薯S. tuberosum (+) S. phureja體細胞雜種植株用細胞質(zhì)特異SSR引物進行鑒定,其中8株具有S. phureja葉綠體DNA,其余2株具有S. tuberosum葉綠體DNA[71]。蔡興奎等用葉綠體SSR引物篩選鑒定了馬鈴薯栽培種S. tuberosum和二倍體野生種S. chacoense雜種葉綠體的組成,觀察到體細胞雜種中同時具有單親本類型和雙親本的重組類型[72]。

在上述幾類鑒定方法中,因分子標記法僅需少量材料即可對雜種植株的核基因組和胞質(zhì)基因組[73-74]進行快速分析鑒定,因此被科研工作者廣泛采用。近年來,基于綠色熒光蛋白標記的方法可被用來鑒定雜種植株[75]。因此,選擇一種快速、簡單、低成本且可靠的方法來鑒定雜種植株顯得尤為重要。

3 體細胞雜交技術(shù)在馬鈴薯遺傳改良中的應(yīng)用

3.1 獲得抗病新種質(zhì)

體細胞雜交技術(shù)可有效克服馬鈴薯野生種與栽培種的生殖障礙,通過此技術(shù)可以將野生種抗真菌基因、抗細菌基因、抗病毒基因和優(yōu)良農(nóng)藝性狀基因等轉(zhuǎn)移至普通栽培種中,從而提高栽培品種的整體特性。

3.1.1 抗真菌新種質(zhì)的獲得

栽培種容易感染的真菌病害有晚疫病、早疫病和黃萎病等病害。[JP2]Helgeson等利用細胞融合技術(shù)獲得S. tuberosum (+)[JP] S. bulbocastanum的雜種植株,經(jīng)鑒定雜種植株具有抗晚疫病的特性[67]。Luthra等通過對馬鈴薯種間S. tuberosum (+) S. cardiophyllum融合雜種植株cph-hybrids分析,雜種植株對晚疫病表現(xiàn)出良好的抗性,同時干物質(zhì)的含量和品質(zhì)均高于親本[76]。Smyda-Dajmund利用細胞融合技術(shù)獲得S. michoacanum (+) S. tuberosum的雜種植株后再與S. michoacanum回交,最終獲得抗晚疫病的雜種馬鈴薯植株[77]。Luthra等對S. tuberosum (+) S. pinnatisectum 雜種植株在大田進行分析,雜種植株較對照對晚疫病表現(xiàn)出明顯的抗性,并且品質(zhì)性狀也優(yōu)于對照[78]。龍葵(S. nigrum)和馬鈴薯(S. tuberosum)經(jīng)細胞融合后,獲得倍性變異幅度較大的雜種植株,經(jīng)鑒定,雜種整株對晚疫病的抗性與S. nigrum相當(dāng),并且部分雜種植株離體葉片抗性高于S. nigrum[63]。Tek等利用體細胞雜交技術(shù)獲得S. tuberosum (+) S. brevidens雜種植株,部分雜種植株對馬鈴薯早疫病具有良好的抗性[25]。Jadari等利用電融合技術(shù)獲得S.tuberosum (+) S. torvum雜種植株,所得雜種植株均對黃萎病產(chǎn)生抗性,說明大麗輪枝菌病原菌(Verticillium dahliae)抗性轉(zhuǎn)移至馬鈴薯,從而抑制了馬鈴薯黃萎病的發(fā)生[79]。

3.1.2 抗細菌新種質(zhì)的獲得 栽培種在種植時容易感染軟腐病、青枯病和環(huán)腐病等細菌性病害。Austin等利用S. tuberosum (+) S. brevidens可育的體細胞雜種與馬鈴薯四倍體栽培種回交,獲得抗軟腐病的馬鈴薯[80]。McGrath等對S. tuberosum (+) S. brevidens細胞融合的雜種株系分析,發(fā)現(xiàn)抗軟腐病的基因穩(wěn)定導(dǎo)入馬鈴薯雜種植株中[81]。Fock等利用電融合技術(shù)對栽培種S. tuberosum和野生種S. stenotomum進行細胞的融合,獲得抗青枯病與S. stenotomum相當(dāng)?shù)碾s種植株[24]。Ahn等通過分析由S. brevidens (+) S. tuberosum細胞融合而來的雜種株系,觀察到雜種株系抗青枯病的能力要強于親本,為進一步獲得新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)[82]。2003年,蔡興奎利用中薯無性系3#和8#與野生種S. chacoense融合,在我國首次創(chuàng)造出具有青枯病抗性的體細胞雜種[22],3年之后他們對這些雜合體進行倍性檢測,觀察到融合后的六倍體后代穩(wěn)定保持[83];2016年,他們課題組通過不對稱融合技術(shù)又獲得抗青枯病的雜種植株[66],這為培育抗青枯病的新品種(系)奠定了堅實的技術(shù)。Laurila等通過細胞融合技術(shù)獲得了S. tuberosum (+) S. acaule雜種植株,雜種植株根據(jù)核基因來源于S. acaule所占比例,呈現(xiàn)出對環(huán)腐病不同程度的抗性[84]。Tek等利用體細胞雜交技術(shù)獲得S. tuberosum和S. brevidens體細胞雜種植株,經(jīng)檢測部分雜種品系表現(xiàn)出對馬鈴薯軟腐病良好的抗性[25]。Yu等通過電融合獲得S. melongena (+) S. tuberosum的雜種后代,后代表現(xiàn)出抗青枯病,說明抗青枯病的特性從茄子成功轉(zhuǎn)移至馬鈴薯,這為培育抗青枯病馬鈴薯奠定了基礎(chǔ)[85]。

3.1.3 抗病毒病新種質(zhì)的獲得

野生種S. brevidens對馬鈴薯卷葉病(PLRV)、X病毒(PVX)和Y病毒(PVY)都具有顯著的抗性,利用細胞融合技術(shù)將該品種的抗病毒性轉(zhuǎn)移到不同馬鈴薯品種中,獲得抗病毒病的株系。Rokka等通過培養(yǎng)體細胞雜種S. tuberosum (+) S. brevidens三倍體植株花藥獲得單倍體,該單倍體植株對PLRV具有良好的抗性[86]。Gillen等通過對S. etuberosum (+) S. tuberosum雜種后代分析,雜種植株表現(xiàn)出對PLRV具有較強的抗性[87]。Nouri-Ellouz等利用電融合技術(shù)獲得馬鈴薯2個二倍體雜種植株,在大棚接種馬鈴薯Y病毒,一些雜種植株的癥狀延遲出現(xiàn)并且感染率降低,其中1株表現(xiàn)完全抗馬鈴薯Y病毒[88]。Nouri-Ellouz等通過細胞融合獲得的馬鈴薯體細胞雜種S. berthaultii (+) S. tuberosum對土傳真菌和馬鈴薯Y病毒表現(xiàn)出部分抗性[89]。

3.2 獲得抗蟲新種質(zhì)

馬鈴薯在生長過程中,易遭受蚜蟲、甲蟲和線蟲等蟲害的危害。Novy等通過對S. etuberosum (+) S. tuberosum雜種后代在大田中研究,發(fā)現(xiàn)大田中馬鈴薯桃蚜的生殖力及成蟲大小均減小,同時后代表現(xiàn)出對馬鈴薯桃蚜、PLRV和PVY具有多重抗性[90]。Thieme等通過電融合獲得S. cardiophyllum (+) S. tuberosum的雜種植株,經(jīng)鑒定野生種的cph基因成功轉(zhuǎn)移至商業(yè)品種中,雜種植株表現(xiàn)出對馬鈴薯甲蟲的抗性,同時對PVY也表現(xiàn)出一定的抗性[91]。Jeffrey等將融合獲得的S. tuberosum (+) S. bulbocastanum雜種植株再與栽培種回交,在篩選出的63個品系中有9個品系表現(xiàn)出對綠桃蚜蟲的抗性,有5個品系表現(xiàn)出對馬鈴薯蚜蟲的抗性[92]。Cooper-Bland等對馬鈴薯的2個二倍體進行電融合,獲得的雜種植株對馬鈴薯胞囊線蟲表現(xiàn)出一定的抗性[93]。

3.3 獲得抗霜凍新種質(zhì)

馬鈴薯易受冷、熱和霜等不同類型的非生物脅迫,還面臨著全球變暖導(dǎo)致水的限制。馬鈴薯栽培品種不耐低溫,在-3.5 ℃時很快死亡,而野生種S. commersonii能在-4.5 ℃條件下存活,最低耐-11.5 ℃[94],Cardi等利用體細胞雜交技術(shù)獲得了S. tuberosum (+) S. commersonii雜種植株,雜種植株表現(xiàn)出抗霜凍性高于親本S. tuberosum的特性[95]。Nyman等也利用體細胞雜交技術(shù)獲得了S. tuberosum (+) S. commersonii的體細胞雜種,雜種植株具有抗霜凍特性,說明野生種抗凍基因已轉(zhuǎn)移到栽培種上[96]。

3.4 獲得雄性不育新種質(zhì)

在預(yù)防馬鈴薯病害的過程中,發(fā)現(xiàn)種子可以避免一些病害的傳播,因此可以利用細胞融合技術(shù)培育新的雄性不育系,以應(yīng)用于實生種子生產(chǎn)。Perl等融合了碘乙酰胺處理的馬鈴薯和γ輻射的原生質(zhì)體(含有S. stoloniferum胞質(zhì)),雜種植株呈現(xiàn)出雄性不育的特性,從而阻斷了通過實生種子傳播的病害[97]。

3.5 獲得耐鹽新種質(zhì)

Trabelsi等利用PEG融合法獲得了S. tuberosum (+) S. verne 雜種植株,通過耐鹽性試驗檢測,雜種植株對鹽的耐受性增強[98]。Bidani等通過分析S. tuberosum (+) S. berthaultii的3個雜種株系STBa、STBc和STBd,結(jié)果證明雜交種系耐鹽性要高于親本BF15[99],同時STBc和STBd株系表現(xiàn)出較強的耐鹽性,而STBa株系的耐鹽性處于中間狀態(tài)[100]。

4 問題及展望

4.1 建立不同試驗材料高效原生質(zhì)體培養(yǎng)體系

由于馬鈴薯遺傳背景的復(fù)雜性,商業(yè)栽培種大多為四倍體,而原始栽培種和野生種大多為二倍體;同時,由于基因型的差異很難建立一套應(yīng)用于所有馬鈴薯品種的高效原生質(zhì)體培養(yǎng)體系。因此,要在具體工作中建立不同試驗材料高效原生質(zhì)體培養(yǎng)再生體系。

4.2 融合方法的創(chuàng)新

傳統(tǒng)的細胞融合方法主要是電融合和聚乙二醇融合[101]。而在微重力環(huán)境條件下,微重力可以改變細胞融合液體的存在狀態(tài),從而有效提高細胞融合效率?!吧裰菟奶枴憋w船中通過電融合獲得煙草融合細胞,[JP2]其融合細胞再生愈傷組織的頻率是地面對照的3倍多[102]。因此,可以在模擬微重力條件下探究不同的融合方法對馬鈴薯原生質(zhì)體融合效率的研究,為獲得更多的馬鈴薯雜種植株奠定基礎(chǔ)。

4.3 種質(zhì)資源的創(chuàng)新

馬鈴薯易受冷、熱和霜等不同類型的非生物脅迫,并且栽培種均不耐低溫霜凍且馬鈴薯栽培種種內(nèi)幾乎沒有遺傳變異[103],同時還面臨著全球氣溫升高導(dǎo)致缺水的影響。在降水不規(guī)律、水資源短缺的地區(qū),馬鈴薯種植可能會面臨嚴峻的考驗。干旱脅迫已經(jīng)在一定程度上對馬鈴薯作物造成了嚴重且持續(xù)的負面影響[104-105]。Beddington研究發(fā)現(xiàn),將近40%的馬鈴薯損失是由病蟲害引起的。作為保障全球人口糧食資源的重要作物,利用細胞融合技術(shù)培育抗生物和非生物耐脅迫馬鈴薯新品種迫在眉睫[106]。

4.4 中國空間站種植品種的選育

BLSS是為航天員生命活動提供物質(zhì)保障的獨立、完整和復(fù)雜的系統(tǒng),高等植物是該系統(tǒng)中最為關(guān)鍵的生物部件,它通過自身的光合作用和蒸騰作用為航天員提供食物、飲用水和氧氣。因生長環(huán)境的制約,各航天大國結(jié)合本國的特點進行了BLSS中候選植物物種的篩選,馬鈴薯因生產(chǎn)力高、營養(yǎng)價值高、園藝操作簡單和株高相對矮等特點被各國作為BLSS的候選植物物種[4]。中國空間站將于2022年前后建成,結(jié)合BLSS系統(tǒng)對植物物種的需求,為了滿足中國空間站馬鈴薯的順利種植,利用體細胞雜交技術(shù)培育早熟、生長周期短、植株矮、產(chǎn)量相對較高、抗病蟲害、逆性強和營養(yǎng)價值高的馬鈴薯新品勢在必行。同時,收集具有這些特性的馬鈴薯種質(zhì)建立中國空間站馬鈴薯種質(zhì)資源庫也顯得尤為重要。

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