畢可海，孫玉奉，張伶俐，聶小偉，張玉清

1. 威海海洋職業(yè)學院食品工程系（威海 264300）；2. 山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院（泰安 271018）

類胡蘿卜素是一種脂溶性色素，廣泛存在于動物、藻類中的天然色素，常被應用于醫(yī)藥和食品行業(yè)[1-2]。由于類胡蘿卜素含有很長的共軛雙鍵，常吃富含類胡蘿卜素的食物能起到延緩衰老、提高免疫力、預防腫瘤等作用[3-4]。而且類胡蘿卜素還是人體維生素A的主要來源之一，可以維持正常的視覺功能及促進生長與生殖等[4]。因此，類胡蘿卜素是人體內(nèi)一種必不可少的物質(zhì)。

海帶是一種營養(yǎng)價值豐富的褐藻，是很多加工食品的原材料[5]。海帶由于富含碘、礦物質(zhì)以及能量低而具有很高藥用價值。中國是海帶生產(chǎn)大國，產(chǎn)量居世界第一[6]，但中國有關(guān)的海帶加工技術(shù)相對比較落后，致使海帶加工產(chǎn)品單一，主要集中在海帶掛面、海帶糕和海帶復合調(diào)味素等[7-8]，而對海帶深加工提取物如海帶多酚[9]、類胡蘿卜素的研究則不多。

海帶富含類胡蘿卜素，但由于類胡蘿卜素性質(zhì)不穩(wěn)定，光照、紫外線照射、高溫等都會使類胡蘿卜素降解[10]，因此類胡蘿卜素的提取并不容易。試驗采用有機溶劑浸提法從海帶中提取類胡蘿卜素，優(yōu)化類胡蘿卜素的提取條件，為從海帶中提取類胡蘿卜素及其應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶（市售，山東榮成）；抗壞血酸（上海源葉生物）；石油醚、丙酮、甲醇、無水乙醇、氯仿等（均為國產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計（普析通用）；電子天平（奧豪斯儀器（上海））；TG 16-WS離心機（湖南湘怡實驗室儀器）；KQ-500 DE超聲（昆山市超聲波儀器）。

1.3 海帶預處理

用超純水清洗海帶，洗去附著在表層的泥沙等物質(zhì)。將清洗好的海帶在50 ℃下真空干燥，粉碎，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 類胡蘿卜素的提取

稱取海帶粉末10 g置于錐形瓶中，加入一定量浸提溶劑，在一定溫度下攪拌提取一定時間后，重復提取一定次數(shù)，合并提取液，懸蒸濃縮至10 mL，離心，去除雜質(zhì)，取上清液。于448 nm處的分光光度計中測定吸光度。

1.5 類胡蘿卜素含量的測定

類胡蘿卜素提取液經(jīng)紫外-可見分光光度計全波長掃描，在400～500 nm之間選擇最大吸收波長448 nm作為類胡蘿卜素吸光度的檢測波長，計算類胡蘿卜素的提取量如式（1）[11]。

式中：A為448 nm下吸光度；V為提取溶劑用量，mL；D為提取液稀釋倍數(shù)；0.16為消光系數(shù)；W為樣品干質(zhì)量，g。

1.6 單因素試驗設計

1.6.1 不同溶劑對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

分別稱取海帶粉末10 g置于6個500 mL錐形瓶中，每個錐形瓶中分別加入200 mL不同提取溶劑，分別為甲醇、無水乙醇、氯仿、丙酮、石油醚和石油醚-丙酮（1∶1，V/V）的混合溶劑。將錐形瓶在40 ℃條件下水浴加熱并攪拌。提取50 min后，抽濾出提取液，濾渣在相同條件下再次提取，合并提取液。

1.6.2 溫度對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

稱取10 g經(jīng)預處理的海帶粉末，以200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）作為提取溶劑，設定提取溫度分別為20，30，40，50和60 ℃，提取時間50 min，提取2次，探討溫度對提取海帶中類胡蘿卜素含量的影響。

1.6.3 時間對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

稱取10 g經(jīng)預處理的海帶粉末，以200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）作為提取溶劑，設定提取時間分別為20，30，40，50，60和70 min，提取溫度40 ℃，提取2次，探討時間對提取海帶中類胡蘿卜素含量的影響。

1.6.4 料液比對海帶中類胡蘿卜含量的影響

稱取10 g經(jīng)預處理的海帶粉末，以石油醚-丙酮（1∶1，V/V）作為提取溶劑，設定海帶粉末與提取溶劑的料液比分別為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL），提取溫度40 ℃，提取時間50 min，提取2次，探討料液比對提取海帶中類胡蘿卜素含量的影響。

1.6.5 提取次數(shù)對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

稱取10 g經(jīng)預處理的海帶粉末，置于200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）提取溶劑中分別提取1次，2次，3次和4次。提取溫度40 ℃，提取時間50 min，探討提取次數(shù)對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響。

1.7 正交試驗設計

通過對有機溶劑法對類胡蘿卜素提取的單因素試驗及結(jié)果分析，選取提取溫度、提取時間、提取料液比3個因素，進行正交試驗，考查各因素條件對類胡蘿卜素提取量的影響。

1.8 超聲輔助提取對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

稱取10 g經(jīng)預處理的海帶粉末，置于200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）提取溶劑中，將提取樣品置于35 kHz超聲中輔助提取，溫度50 ℃，提取一定時間，提取2次，探討超聲輔助對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響。

1.9 抗氧化劑對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

稱取10 g經(jīng)預處理的海帶粉末，置于200 mL石油醚-丙酮（1∶1，V/V）提取溶劑中。加入1%抗壞血酸，溫度50 ℃，料液比1∶20（g/mL），提取2次，探討抗氧化劑對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

類胡蘿卜素是一種脂溶性色素，極性較強，根據(jù)相似相容原理，類胡蘿卜素可能會易溶于極性較強的溶劑中，因此試驗選用甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、石油醚和石油醚-丙酮（1∶1，V/V）混合溶劑等幾種不同溶劑作為提取溶劑。由圖1可知，不同提取溶劑對海帶中類胡蘿卜素的提取率不同。其中類胡蘿卜素在石油醚-丙酮（1∶1，V/V）混合溶劑中的提取量明顯高于其他幾種溶劑，說明石油醚-丙酮混合溶劑更適合類胡蘿卜素的提取，這與劉長付等[12]的研究結(jié)果一致。因此選用石油醚-丙酮（1∶1，V/V）混合溶劑作為類胡蘿卜素提取溶劑。

圖1 提取溶劑對類胡蘿卜素提取量的影響

2.2 溫度對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

由圖2可知，溫度對類胡蘿卜素提取量影響較大，溫度低于40 ℃時，類胡蘿卜素提取量隨著溫度升高而增大；溫度在40～50 ℃時，類胡蘿卜素提取量受溫度影響較小，趨于平緩；但溫度高于50 ℃時，類胡蘿卜素的提取量明顯降低，這可能是因為溫度高于50℃，類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響類胡蘿卜素的穩(wěn)定性，使得類胡蘿卜素的提取量降低[10,13]。因此，試驗選用類胡蘿卜素的最適提取溫度為40 ℃。

圖2 提取溫度對類胡蘿卜素提取量的影響

2.3 時間對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

由圖3可知，在20～50 min范圍內(nèi)，類胡蘿卜素提取量隨著提取時間延長而升高，提取時間50 min時提取量達到最大，但提取時間超過50 min后，類胡蘿卜素提取量開始降低。這可能是由于在提取開始時類胡蘿卜素溶出速度大于降解速度，隨著時間延長，類胡蘿卜素在提取溶劑中基本達到平衡，過長時間提取會對類胡蘿卜素起降解作用，使得胡蘿卜素提取量下降。與空氣中的氧氣接觸，類胡蘿卜素被氧化分解，降低類胡蘿卜素提取量。因此，選用類胡蘿卜素最適提取時間為50 min。

圖3 提取時間對類胡蘿卜素提取量的影響

2.4 料液比對海帶中類胡蘿卜含量的影響

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，類胡蘿卜素提取量隨著料液比增加而增大，料液比為1∶20（g/mL）時，提取量達到最大；繼續(xù)增大料液比，類胡蘿卜素提取量反而有所降低。這可能是因為，初期增大料液比，使得海帶與溶劑充分接觸，增大提取接觸面積，類胡蘿卜素提取量增加。因此，試驗選用最適料液比為1∶20（g/mL）。

圖4 提取料液比對類胡蘿卜素提取量的影響

2.5 提取次數(shù)對對海帶中類胡蘿卜提取量的影響

由圖5可知，類胡蘿卜素提取量隨著提取次數(shù)增加而增大，但后2次的提取量變化不明顯。多次提取會增加溶劑使用量和提取時間。從節(jié)約成本和時間的角度考慮，將提取次數(shù)定為2次。

圖5 提取次數(shù)對類胡蘿卜提取量的影響

2.6 正交試驗分析

由表2可知，溫度、時間、料液比對提取類胡蘿卜素的影響順序為：溫度＞料液比＞時間。說明提取溫度是關(guān)鍵控制因素，對于提取類胡蘿卜素的影響最大，影響較小的是料液比，最小的是提取時間。通過試驗分析，類胡蘿卜素的提取最優(yōu)條件為：提取溫度50 ℃、提取時間50 min、料液比1∶20（g/mL）。

將通過試驗分析的A2B2C2與通過正交試驗分析的A3B2C2進行試驗比較，發(fā)現(xiàn)在提取溫度40 ℃、提取時間50 min、料液比1∶20（g/mL）時，提取量為0.411 mg/g，而提取溫度50 ℃、提取時間50 min、料液比1∶20時，提取量為0.427 mg/g。因此，選取提取溫度50 ℃、提取時間50 min、料液比1∶20（g/mL）為最優(yōu)提取條件。

2.7 超聲輔助對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

類胡蘿卜素為細胞內(nèi)產(chǎn)物，由于細胞壁的存在采用有機溶劑浸提法不能充分使類胡蘿卜素溶出，導致提取率下降。近年來超聲波提取技術(shù)由于提取率高，能有效縮短提取時間等優(yōu)點備受關(guān)注。超聲波通過溶劑中小氣泡的形成和破碎會破碎細胞組織，從而達到較高提取效率[14]。采用1.8的試驗條件進行提取，由圖6可知，超聲輔助提取可明顯縮短提取時間并提高類胡蘿卜素提取量，類胡蘿卜素提取量在25 min時可達0.476 mg/g，增加了11.48%。這可能是因為超聲作用可能會破壞海帶的細胞壁從而有助于類胡蘿卜素的溶出，從而提高類胡蘿卜素提取量。

表1 正交試驗設計

表2 正交試驗結(jié)果分析

圖6 超聲輔助提取對類胡蘿卜素提取量的影響

2.8 抗氧化劑對海帶中類胡蘿卜素提取量的影響

圖7 抗壞血酸對類胡蘿卜素提取量的影響

由于類胡蘿卜素的性質(zhì)不穩(wěn)定，極易被氧化，因此嘗試在提取過程中添加抗氧化劑，探討對類胡蘿卜素提取量的影響。由圖7可知，抗壞血酸的加入可以明顯提高類胡蘿卜素提取量，對比于不添加抗壞血酸的提取方法來說，提取量增加15.46%，達0.493 mg/g。這可能是因為類胡蘿卜素找中含有的不飽和雙鍵在提取過程中容易被氧化，使得類胡蘿卜素提取量降低；添加抗壞血酸可使類胡蘿卜素防止被氧化，所以類胡蘿卜素可以被充分提取。

3 結(jié)論

試驗討論不同提取溶劑、溫度、時間、料液比、提取次數(shù)、超聲輔助及抗氧化劑對類胡蘿卜素提取量的影響。通過試驗確定提取海帶中類胡蘿卜素最適條件為：提取溶劑采用石油醚-丙酮（1∶1，V/V）混合溶劑、溫度50 ℃、時間50 min、料液比1∶20（g/mL）、提取2次，類胡蘿卜素提取量可達0.427 mg/g。通過研究超聲輔助提取，發(fā)現(xiàn)超聲輔助可增大類胡蘿卜素的提取量，達0.476 mg/g。通過添加抗壞血酸，可更充分提取出海帶中的類胡蘿卜素，可達0.493 mg/g。海帶是一種較為理想的類胡蘿卜素提取原料，通過超聲輔助或是加入抗氧化劑提取類胡蘿卜素提取效率高、綠色環(huán)保、方便快捷。