趙迎春 馮 娥 田云云

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨科，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：kh_zyc@163.com)

【提要】 骨肉瘤是骨骼最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，目前治療骨肉瘤的方法可用于約70%的患者，然而轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性骨肉瘤患者的生存率在過去30年中基本沒有改變，亟須尋找新的治療方法。腫瘤免疫治療主要通過增強機體抗腫瘤免疫功能來抑制和殺傷腫瘤細胞，在各種腫瘤中已經(jīng)顯示出良好的臨床結(jié)果，有望成為治療骨肉瘤的新策略。本文對骨肉瘤中的免疫檢查點及其抑制劑的應(yīng)用進行綜述，以期為骨肉瘤的防治研究提供思路。

骨肉瘤是骨骼最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于四肢長骨干骺端，具有易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移、病情進展快、預(yù)后差的特點[1]。在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率約為百萬分之三，易感人群為兒童和青少年[2]。目前，骨肉瘤的治療方法包括外科保肢手術(shù)治療、新輔助化療、靶向治療和免疫治療等，盡管這些治療手段能夠治療約70%的骨肉瘤患者[3]，但轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性骨肉瘤患者的生存率在過去30年中基本沒有改變，這使得骨肉瘤治療效果仍處于瓶頸期，亟須尋找新的治療方法[4]。近年來，腫瘤免疫治療備受學(xué)者們的關(guān)注。病理狀態(tài)下，癌細胞能夠發(fā)生免疫逃逸[5]。而腫瘤免疫治療主要通過增強機體抗腫瘤免疫功能，抑制和殺傷腫瘤細胞。目前，腫瘤免疫治療在多種腫瘤中顯示出良好的臨床效果，包括黑色素瘤、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌和頭頸癌[6]，然而針對骨肉瘤的研究尚少見。本文對骨肉瘤中的免疫檢查點及其抑制劑應(yīng)用于骨肉瘤治療的研究進展綜述如下。

1 骨肉瘤中的免疫檢查點

1.1 程序性死亡受體-1/程序性死亡配體-1 目前已有許多學(xué)者檢測了骨肉瘤細胞系和骨肉瘤組織中程序性死亡配體1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)的表達量，結(jié)果顯示雖然在骨肉瘤細胞系中的PD-L1表達量高低不一，但與親代細胞系相比，PD-L1表達量越高則骨肉瘤耐藥性越強[7-8]?；诖?，學(xué)者們針對PD-L1開展了許多生物學(xué)研究，包括利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)靶向骨肉瘤細胞系中PD-L1基因的研究，結(jié)果表明PD-L1可調(diào)控骨肉瘤的生長及其對多比柔星和紫杉醇的耐藥性[9-10]。研究顯示，23.7%的人類骨肉瘤組織高表達PD-L1，50%的人類骨肉瘤組織表現(xiàn)出中等表達，并且PD-L1的表達量與轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤淋巴細胞相關(guān)[11]。一項Meta分析也表明，骨肉瘤組織中PD-L1表達量比其他肉瘤組織高14%～75%，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移、患者病死率、不良預(yù)后密切相關(guān)[12]。這說明PD-L1高表達可能是骨肉瘤患者的預(yù)后不良因素。

利用抗程序性死亡受體1(programmed cell death 1,PD-1)和抗PD-L1阻斷療法治療骨肉瘤小鼠模型顯示出良好的治療效果，相較于對照組(采用生理鹽水注射)而言，經(jīng)抗PD-1抗體處理的骨肉瘤人源小鼠模型更不容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移[13]。采用由抗PD-1、抗PD-L1和抗腫瘤壞死因子受體超家族成員4(CD134)組成的三聯(lián)抗體治療的移植骨肉瘤小鼠，生存時間顯著延長，并且CT掃描和組織學(xué)隨訪結(jié)果顯示50%小鼠未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移[7]。以上研究結(jié)果提示抗PD-1和抗PD-L1阻斷療法治療骨肉瘤具有顯著的效果，這給晚期骨肉瘤患者帶來了希望。

1.2 細胞毒性T細胞相關(guān)抗原4 細胞毒性T細胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)，即CD125，是在T淋巴細胞表面上表達的蛋白質(zhì)受體，在T細胞活化期起著關(guān)鍵作用。正常情況下，為了減輕過度活化免疫應(yīng)答，當抗原呈遞細胞上的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類或Ⅱ類抗原呈遞給T細胞受體時，T細胞開始活化，并以CD28[T細胞與腫瘤細胞或抗原呈遞細胞上的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)結(jié)合]形式的共刺激信號擴增[14]。T細胞活化以后，CTLA-4可能從細胞內(nèi)區(qū)域轉(zhuǎn)運到T細胞表面，以比CD28更大的親和力結(jié)合B7-1和B7-2，進而下調(diào)免疫應(yīng)答，達到外周免疫耐受[15-16]。

CTLA-4抑制信號非常復(fù)雜，它們還可以抑制T細胞內(nèi)白細胞介素-2轉(zhuǎn)錄、抑制含有Src同源結(jié)構(gòu)域的酪氨酸磷酸酶表達，以及抑制B7-1和B7-2的反式內(nèi)吞作用[15]。CTLA-4也在調(diào)節(jié)性T淋巴細胞上表達，控制效應(yīng)T淋巴細胞的功能并促進免疫耐受。研究表明，阻斷CTLA-4受體會增加CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞的活化并減弱T淋巴細胞活性[16]。Leach等[17]的研究表明，在結(jié)腸癌或纖維肉瘤的小鼠模型中，抗CTLA-4抗體與腫瘤溶解物負載的樹突狀細胞相結(jié)合，可增強CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞的活化并降低T淋巴細胞表達，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和延長小鼠存活時間。目前為止，抗CTLA-4阻斷療法已成功用于治療晚期黑色素瘤和其他腫瘤，如非小細胞肺癌、腎細胞癌和前列腺癌[6]。另外有研究顯示，人單克隆IgG1抗CTLA-4抗體(也稱為伊匹單抗)能夠顯著延長轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的中位總生存期[18]?；诖送黄菩缘难芯拷Y(jié)果，學(xué)者們正在探索CTLA-4對其他實體瘤的潛在作用，包括骨肉瘤。一項使用伊匹單抗治療兒童晚期實體腫瘤的Ⅰ期臨床試驗表明，33例患兒中有6例病情進展穩(wěn)定，其中8例骨肉瘤患兒中有2例發(fā)生免疫相關(guān)不良事件，但其預(yù)后尚可；然而，發(fā)生免疫相關(guān)不良事件的患兒其總生存期長于沒有發(fā)生免疫相關(guān)不良事件的患兒[19]。

1.3 B7同源物3 B7同源物3(B7 homology 3，B7-H3)，即CD276，是B7-CD28家族的抑制蛋白，在抑制T細胞活化、增殖和產(chǎn)生細胞因子中起重要作用。B7-H3在其他免疫細胞中也有表達，包括抗原提呈細胞、自然殺傷細胞和B淋巴細胞。多種腫瘤均存在B7-H3過表達現(xiàn)象，如黑素瘤、非小細胞肺癌、骨肉瘤和橫紋肌肉瘤[20-21]。有學(xué)者報告[22]，91.8%的骨肉瘤組織中表達B7-H3，其表達量顯著高于鄰近的健康組織、骨軟骨瘤和纖維異常增生組織；另外，B7-H3表達水平與浸潤腫瘤的淋巴細胞數(shù)量呈負相關(guān)，可促進骨肉瘤細胞侵襲，且高表達B7-H3的骨肉瘤患者存活和復(fù)發(fā)時間短于低表達的患者。

鑒于以上研究成果，目前開展了許多針對抗B7-H3抗體功效的研究。Enoblituzumab是一種人源IgG1單克隆拮抗劑B7-H3抗體，已被用于治療B7-H3表達陽性的難治性腫瘤患者，如黑色素瘤和晚期實體腫瘤，結(jié)果顯示患者病情穩(wěn)定(至少12周)且2%～69%的腫瘤體積縮小，具有良好的耐受性且沒有劑量依賴性毒性[22]。MGD-009是一種人源雙重親和力和重新靶向蛋白，可與T細胞上的CD3及其靶細胞上的B7-H3結(jié)合，其已進入Ⅰ期臨床試驗，該藥主要針對間皮瘤、黑色素瘤、小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌或軟組織肉瘤患者[7]。

1.4 自然殺傷細胞激活受體組2成員D及其相關(guān)配體 自然殺傷細胞激活受體組2成員D(natural killer cell group 2 member D，NKG2D)及其配體(natural killer cell group 2 member D ligand，NKG2DL)在先天免疫中起關(guān)鍵作用。從功能上講，NKG2D是屬于CD94/NKG2家族的共刺激跨膜蛋白受體，存在于CD8+T淋巴細胞、γδ T細胞和活化的巨噬細胞中。NKG2DL主要在感染和惡性轉(zhuǎn)化情況下表達上調(diào)，很少在正常細胞中表達。在細胞水平上，NKG2D/NKG2DL的結(jié)合，通過磷脂酰肌醇-3激酶和生長因子受體結(jié)合蛋白2-鳥嘌呤核苷酸交換因子1途徑，觸發(fā)自然殺傷細胞活化，導(dǎo)致細胞毒性顆粒釋放，最終導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡，屬于一種保護機制，而晚期癌細胞可以通過下調(diào)或脫落NKG2DL來逃避免疫監(jiān)視[24]。NKG2DL表達、其下游通路和自然殺傷細胞的細胞毒性有望成為癌癥研究的新領(lǐng)域。

研究顯示，在22個骨肉瘤細胞系中，NKG2DL呈中等至高水平表達，其中14個原發(fā)性骨肉瘤細胞系都對由自然殺傷細胞介導(dǎo)的NKG2D/NKG2DL相互作用誘導(dǎo)的細胞毒性敏感，然而NKG2DL的高表達與敏感性增加無相關(guān)性；該研究還表明，螺內(nèi)酯可上調(diào)原發(fā)性骨肉瘤細胞系中NKG2DL的表達，并顯著增強腫瘤細胞對自然殺傷細胞介導(dǎo)的NKG2D/NKG2DL相互作用誘導(dǎo)的細胞毒性的敏感性[25]。另一項研究顯示，NKG2D-嵌合抗原受體陽性(chimeric antigen receptor positive，CAR+)T淋巴細胞在體外和小鼠骨肉瘤中對骨肉瘤細胞系的細胞溶解活性顯著增加，同時保留了健康細胞[26]。此外，有研究顯示，采用γδT細胞免疫治療結(jié)合DNA去甲基化藥物地西他濱治療骨肉瘤的效果良好，因為地西他濱增強了骨肉瘤細胞中NKG2DL表達，從而增強了骨肉瘤細胞對細胞毒性γδT細胞的易感性[27]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，14種不同的骨尤文肉瘤細胞系廣泛表達NKG2DL，使用慢病毒將CD3ζ/CD28衍生的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域與NKG2D融合后，可以產(chǎn)生能夠引起骨尤文肉瘤細胞死亡的NKG2D-CAR+T淋巴細胞[28]。

1.5 人類白細胞抗原G 人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen G，HLA-G)在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中具有重要作用。 HLA-G對自然殺傷細胞和T細胞的免疫應(yīng)答具有抑制作用，并且在間充質(zhì)基質(zhì)細胞、T淋巴細胞和各種癌癥細胞中均有表達。研究顯示，在34.0%的骨尤文肉瘤活組織中檢測到HLA-G的表達，雖然HLA-G的表達與腫瘤浸潤淋巴細胞增加密切相關(guān)，但與其他臨床參數(shù)無關(guān)[29]。因此，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的HLA-G表達可能會減弱腫瘤細胞對自然殺傷細胞的抵抗力，從而提高骨尤文肉瘤免疫治療的效果。

2 骨肉瘤中的聯(lián)合免疫治療

2.1 PD-1和CTLA-4聯(lián)合阻滯療法 免疫檢查點阻滯免疫療法的理想效果是對當前治療方法無反應(yīng)的患者實現(xiàn)長期疾病控制，而聯(lián)合阻滯治療是針對機體在可耐受的毒性作用下提高療效的一種新治療方案。Postow等[30]聯(lián)合應(yīng)用伊匹單抗和納武單抗治療142例未接受治療的黑色素瘤晚期患者，結(jié)果顯示聯(lián)合治療組的總體有效率為61%，而單獨使用伊匹單抗組的總體有效率為11%，其中兩組的完全反應(yīng)比例為0.22 ∶0?；诖嗽囼灲Y(jié)果，美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準了這兩種藥物聯(lián)合治療晚期黑色素瘤，并促進了該療法用于治療其他腫瘤的研究，例如骨肉瘤。

有學(xué)者使用抗PD-L1與抗CTLA-4抗體聯(lián)合治療骨肉瘤小鼠，結(jié)果顯示所有小鼠未發(fā)生骨肉瘤轉(zhuǎn)移，其中60%的小鼠長期無病存活，而接受抗PD-L1阻滯單藥治療的小鼠并沒有實現(xiàn)長期無病生存，這表明聯(lián)合阻滯療法具有明顯優(yōu)勢[31]。一項針對轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的Ⅱ期臨床試驗研究顯示，單獨使用納武單抗組的確診反應(yīng)率為5%，伊匹單抗與納武單抗聯(lián)合治療組為16%；聯(lián)合治療組的中位無進展生存期和總生存期分別為4.1個月和14.3個月，優(yōu)于單獨使用納武單抗組的1.7個月和10.7個月；單獨使用納武單抗組、聯(lián)合治療組中分別有19%、26%的患者發(fā)生了嚴重的免疫相關(guān)不良事件，但兩組均未發(fā)生與治療相關(guān)的死亡[7]。這項臨床試驗證實了聯(lián)合治療具有顯著療效且安全性可控。

2.2 免疫檢查點阻滯和放射治療聯(lián)合療法 目前放射治療被認為是單純局部抑制腫瘤的經(jīng)典手段，單獨使用放射治療可以增強全身免疫反應(yīng)并減少遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，即“遠隔效應(yīng)”。這種抗腫瘤免疫反應(yīng)很大程度上是由CD4+和CD8+T淋巴細胞反應(yīng)增強以及免疫檢查點阻滯反應(yīng)增強所引起。因此，放射治療聯(lián)合免疫檢查點阻滯療法或可更好地改善腫瘤患者的臨床結(jié)局，且已在骨肉瘤并發(fā)微轉(zhuǎn)移的患者中得到了證實[32-33]。

已有臨床試驗正在積極研究免疫檢查點阻滯(特別是PD-1、PD-L1和CTLA-4)聯(lián)合放療治療各種腫瘤患者，例如晚期黑色素瘤、非小細胞肺癌、頭頸癌、肝癌、前列腺癌和淋巴瘤[34]。但是還沒有臨床試驗顯示在未接受過治療的腫瘤患者中，免疫檢查點阻滯治療聯(lián)合放療優(yōu)于任一單純療法，并且這種聯(lián)合治療方案所招募的骨肉瘤志愿者很少。目前有一項正在進行的Ⅰ期臨床試驗比較了納武單抗和定向放射聯(lián)合治療與單獨使用納武單抗治療晚期脊索瘤的效果，然而該試驗仍處于研究階段，尚未公布任何結(jié)果。

2.3 免疫檢查點阻滯聯(lián)合靶向治療或化療療法 目前聯(lián)合免疫檢查點阻滯治療、化療或靶向治療的研究已經(jīng)擴展到軟組織肉瘤，然而這些聯(lián)合療法對于骨肉瘤的研究相對較少。一項回顧性研究顯示，納武單抗聯(lián)合帕唑帕尼(酪氨酸激酶血管內(nèi)皮生長因子抑制劑)治療28例軟組織肉瘤或骨肉瘤患者，其中包括4例骨肉瘤患者，在治療超過4個周期后，一半的患者臨床受益[35]。

3 展 望

免疫檢查點抑制劑因其在骨肉瘤治療中的潛在作用而引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注，并且隨著臨床試驗的開展，免疫檢查點抑制劑仍會成為長期的研究方向。目前，研究表明骨肉瘤患者中PD-1和PD-L1的表達水平差異較大，并且與預(yù)后呈負相關(guān)[36]。然而，根據(jù)PD-1和PD-L1的表達水平尚不能可靠地預(yù)測患者對治療的反應(yīng)。與單一免疫檢查點阻滯治療相比，聯(lián)合其他療法的免疫檢查點阻滯治療方案已顯示出優(yōu)越的臨床效果。因此有必要找到合適的聯(lián)合阻滯劑藥物，既保證免疫相關(guān)不良事件在骨肉瘤患者的可承受范圍內(nèi)，又具有最大的臨床效益，這將是未來的研究新領(lǐng)域。